Wir danken den Mitarbeitern der AniCan (CRCL, Lyon) für ihre technische Unterstützung bei der Tierpflege. Diese Arbeit wurde vom Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM Avenir Program), die Ligue Nationale Contre le Cancer, von der Association pour la Recherche sur le Cancer, der vom Institut National du Cancer, und durch Stipendien unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer (JG), aus dem Institut National du Cancer (JG), aus dem Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche in Frankreich (RMP und DFV) und der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer ( DFV).

Alle Verfahren wurden durch eine Ethikkommission unter regulatorischen der staatlichen Behörde genehmigt (&quot;Comité d&#39;Auswertung Commun Au Centre Léon Bérard, à l&#39;Animalerie de Transit de l&#39;ENS, au PBEs et au Laboratoire P4&quot; (CECCAPP)). Die Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen-freien tierischen Anlage am &quot;Plateforme AniCan, Centre Léon Bérard&quot; (Lyon, Frankreich) gepflegt und behandelt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts. Eine schematische Darstellung des Verfahren ist in Fig. 1 gezeigt. 1. Bauchspeicheldrüse Dissection und Kanalkrümmung (Tag 0) Eine sehr schnelle Präparation ist für eine optimale Ausbeute der Extraktion und eine gute Lebensfähigkeit der Zellen in der Kultur gewährleisten. Um die Zeit für Pankreas Isolierung erforderlich zu reduzieren, müssen alle Hilfsmittel bereit, bevor der Maus Euthanasie. <ol><li><html> Euthanize Maus durch CO 2 Ersticken oder Genickbruch. </li></ol> Von diesem Schritt müssen alle Verfahren unter einer sterilen Atmosphäre (MSW, Stufe II) mit steriler Dissektion Ausrüstung durchgeführt werden. <ol start="2"><li> Befestigen Sie die Maus und die Maus sprühen Bauch mit 70% Ethanol. Mit allen Sezieren Scheren und Zangen, einen V-förmigen Einschnitt an den Genitalbereich und fortsetzen bis die Membran vollständig zu öffnen Sie die Bauchhöhle. </li><li> Positionieren Sie die Leberlappen gegen die Membran, sie sollten dort bleiben, wenn der Körperhöhle offen ist weit genug. Ziehen Sie den Darm und den Darm außerhalb der Bauchhöhle auf der linken Seite, und finden Sie das Rektum. Mit einem Paar und einer gebogenen Pinzette Präparierscheren, zupacken und Abschnitt das Rektum. </li><li> Mit der gleichen Pinzette vorsichtig entrollen ganz den Darm aus dem Rektum in den Magen in den Darm, indem auf der linken Seite. </li></ol>ent &quot;&gt; Bei diesem Schritt kann der Bauchspeicheldrüse als schmaler Streifen zwischen dem Magen und dem Beginn des Darms zu unterscheiden. Die Ligationen mit der Milz erhalten bleiben. <ol start="5"><li> Mit Noyes Schere und einer Pinzette vorsichtig schneiden die Bauchspeicheldrüse entlang des Darms und befreien sie mit der Milz von dem Rest des Verdauungstraktes. </li><li> Besorgen Sie sich die Milz und die Bauchspeicheldrüse Abschnitt attached to it (Abbildung 2). </li></ol> Bei diesem Schritt sicher sein, dass kein mesenterialen Fettgewebe und / oder andere benachbarte Gewebe (Milz, Darm usw.) mit der Bauchspeicheldrüse gesammelt werden, um zelluläre Kontamination zu vermeiden. Für den Rest des Verfahrens sind alle Puffer ohne Kalziumionen Ca 2 + Chelatbildner hergestellt werden, um die vollständige Dissoziation des exokrinen Pankreasgewebe in einzelne Azinuszellen vermeiden. <ol start="7"><li> Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse zweimal in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x. </li></ol> Bei diesem Schritt wird als Fettgewebe schweben entgegen Bauchspeicheldrüse, die sinken, ist es leicht möglich, zu visualisieren und schnell entfernen die Verunreinigung weißen Fettgewebe noch Bauchspeicheldrüse angebracht. Wenn die Bauchspeicheldrüse muss auf die Zellkultur-Anlage transportiert werden, muss es auf dem Eis in HBSS 1x gehalten werden. <ol start="8"><li> Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse in einer sterilen Petrischale mit 5 ml HBSS 1x. Mit Noyes Schere und Skalpell, schneiden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke von 1 bis 3 mm 3 (3A). </li></ol> 2. Enzymatische und mechanische Dissociations der Bauchspeicheldrüse (Tag 0) <ol><li> Übertragen Sie sie in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Absaugen und den Überstand verwerfen, um Zelltrümmer und Blutzellen zu entfernen. </li><li> 10 ml Kollagenase IA-Lösung (HBSS 1x mit 10 mM HEPES, 200 U / ml collagenase IA und 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor) auf Pankreasschnitte. Mit einem 25 ml serologische Pipette, übertragen Sie sie auf einer 25 cm 2-Kolben. Inkubieren Sie für 20-30 min bei 37 ° C. Während dieser Zeit (alle 5 min), führen eine mechanische Dissoziation durch energetisch Bewegung hin-und her die Bauchspeicheldrüse Fragmente etwa zehnmal, in sterilen Pipetten von abnehmender Größe (25, 10 und 5 ml serologischen Pipetten). </li></ol> Bei diesem Schritt ist es wichtig, häufig überwacht, inwieweit der enzymatischen Spaltung von Pankreasschnitten. <ol start="4"><li> Wenn das Gewebe der Bauchspeicheldrüse zu gut dissoziiert scheint (nach dem Verschwinden von Pankreas-Fragmente und der erhöhten Trübung der Lösung) (3B), stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 ml kaltem gepufferte Waschlösung (HBSS 1x mit 5 % Fetal Bovine Serum (FBS) und 10 mM HEPES). </li><li> Übertragen in ein steriles 50 ml Polypropylen-Röhrchen und centrifuge für 2 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, um die Kollagenase IA Lösung zu entfernen. </li><li> Resuspendieren und waschen das Pellet mit 10 ml gepufferte Waschlösung. Zentrifuge für 3 min bei 450 xg und 4 ° C. Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male. </li></ol> 3. Filtration und Seeding von Dispersed Acini (Tag 0) <ol><li> Zellpellet in 7 ml Waymouth-Medium, das 2,5% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin-Gemisch (PS), 0,25 mg / ml Trypsin-Inhibitor und 25 ng / ml rekombinantem humanen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). </li><li> Filtrat die Zelle Mischung, indem man es durch ein 100 &amp;mgr; m-Filter, um die nicht verdauten Fragmente (Kanäle, Blutgefäße und Langerhans-Inseln) behalten passieren. Bauchspeicheldrüsenkrebs acinar Strukturen (acinus von 10-15 Zellen) durchlaufen. </li><li> Spülen Sie den Filter mit 6 ml Medium enthaltenden Waymouth der FBS, PS, Trypsin inhibitor und EGF. </li></ol> Nach diesem Schritt müssen die Zellen sehr vorsichtig behandelt werden, um jede Acini Dissoziation zu vermeiden. <ol start="4"><li> Seed das isolierte acini in einer 6-Well Kulturschale (2 ml pro Well) (3C). Kultur sie bei 37 ° C unter 5% (v / v) CO 2 Atmosphäre. </li></ol> Nach diesem Schritt werden die Azinuszellen in Suspension kultiviert. 4. Azinuszelltumoren Kultur (Tag 1 bis 10) <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach, übertragen Sie die Acini (in Suspension) in eine neue 6-well Kulturschale, um die Verunreinigung Zellen und zelluläre Reste, die über Nacht eingehalten haben (Abbildung 4) zu beseitigen. </li></ol> Wenn die Zellkultur muss für mehrere Tage oder, wenn die experimentellen Bedingungen Zellen in Monolayer gewachsen erfordern, ist es um die Übertragung und Saatgut acini auf Matrix Gerüste empfohlen verlängert werden. <ol start="2"><li> Am Tag zuvor zu sehending auf Matrix-Unterstützung (Tag 0), Wappen eine 6-well Kulturschale mit Kollagen Typ I (5 ug / cm 2). 1 ml der Typ-I-Kollagen-Lösung (50 g / ml in 0,02 M Essigsäure, 0,2 um filtriert) in jede Vertiefung und lassen Sie es passiv adsorbieren auf Kunststoff, während 1 Stunde bei 37 ° C (oder über Nacht bei 4 ° C ). </li><li> Saugen Sie die Typ-I-Kollagen-Lösung und spülen Sie die beschichteten Wells zweimal mit Phosphat-gepufferte Saline 1x. </li><li> Lassen Sie das beschichtete gut trocknen (unter einer MSW) mindestens 12 Stunden vor dem Gebrauch. </li><li> Übertragen der isolierten primären Acini (erhalten in Schritt 4.1) in der Typ-I-Collagen-beschichteten 6-Loch-Kulturplatte und Kultur sie in den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben (bei ​​37 ° C unter 5% (v / v) CO 2-Atmosphäre) . Die Zellen des Typ I-Kollagen Substrat haften für 2 Tage. </li><li> Am Tag 3, verändern das Kulturmedium zu nicht lebensfähigen Zellen, die nicht eingehalten wurden beseitigen. Mit der Zeit in Kultur werden die Zellen schrittweise spLesen auf das Kollagen-haltige Unterstützung. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage (Abbildung 5). </li></ol> Die isolierten Azinuszellen erhalten kann gezählt werden, nach einer kompletten mechanischen Dissoziation durch Verwendung einer Zelle Thoma Zählkammer. Beachten Sie, dass isolierte Azinuszellen nicht in Kultur gehalten werden danach. Die Qualität der acinar Kultur erhalten können, indem die Expression von acinar spezifische Marker wie Trypsinogen, Bauchspeicheldrüse Transcription Factor 1-Untereinheit Alpha oder Carboxypeptidase A1 (Immunzytochemie oder Immunfluoreszenz Experimente) gesteuert werden.

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> Am. J. Physiol. 235, 517-524 (1978).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+binding+and+biologic+effects+on+mouse+pancreatic+acini.">Epidermal growth factor binding and biologic effects on mouse pancreatic acini.</a> Gastroenterology. 85, 339-345 (1983).</li><li>Han, B., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholecystokinin+induction+of+mob-1+chemokine+expression+in+pancreatic+acinar+cells+requires+NF-kappaB+activation.">Cholecystokinin induction of mob-1 chemokine expression in pancreatic acinar cells requires NF-kappaB activation.</a> Am. J. Physiol. 277, 74-82 (1999).</li><li>Ji, B., Kopin, A. S., Logsdon, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+differences+between+rat+and+mouse+CCKA+receptors+determine+the+divergent+acinar+cell+response+to+the+cholecystokinin+analog+JMV-180.">Species differences between rat and mouse CCKA receptors determine the divergent acinar cell response to the cholecystokinin analog JMV-180.</a> J. Biol. Chem. 275, 19115-19120 (2000).</li><li>Ji, K. A., Yang, M. S., Jou, I., Shong, M. H., Joe, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombin+induces+expression+of+cytokine-induced+SH2+protein+(CIS)+in+rat+brain+astrocytes:+involvement+of+phospholipase+A2,+cyclooxygenase,+and+lipoxygenase.">Thrombin induces expression of cytokine-induced SH2 protein (CIS) in rat brain astrocytes: involvement of phospholipase A2, cyclooxygenase, and lipoxygenase.</a> Glia. 48, 102-111 (2004).</li><li>Gaiser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activation+of+trypsinogen+in+transgenic+mice+induces+acute+but+not+chronic+pancreatitis.">Intracellular activation of trypsinogen in transgenic mice induces acute but not chronic pancreatitis.</a> Gut. 60, 1379-1388 (2011).</li><li>Logsdon, C. D., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+acinar+cells+in+monolayer+culture:+direct+trophic+effects+of+caerulein+in+vitro.">Pancreatic acinar cells in monolayer culture: direct trophic effects of caerulein in vitro.</a> Am. J. Physiol. 250, 440-447 (1986).</li><li>Stanger, B. Z., Dor, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+cellular+origins+of+pancreatic+cancer.">Dissecting the cellular origins of pancreatic cancer.</a> Cell Cycle. 5, 43-46 (2006).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tif1gamma+suppresses+murine+pancreatic+tumoral+transformation+by+a+smad4-independent+pathway.">Tif1gamma suppresses murine pancreatic tumoral transformation by a smad4-independent pathway.</a> Am. J. Pathol. 180, 2214-2221 (2012).</li><li>Vincent, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+TIF1gamma+cooperates+with+Kras+to+induce+cystic+tumors+of+the+pancreas.">Inactivation of TIF1gamma cooperates with Kras to induce cystic tumors of the pancreas.</a> PLoS Genet. 5, e1000575 (2009).</li><li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+pancreatic+alpha,+beta,+duct+and+acinar+populations+with+cell+surface+markers.">Isolation of mouse pancreatic alpha, beta, duct and acinar populations with cell surface markers.</a> Mol. Cell Endocrinol. 339, 144-150 (2011).</li><li>Case, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+intracellular+transport+and+discharge+of+exportable+proteins+in+the+pancreatic+acinar+cell+and+other+cells.">Synthesis, intracellular transport and discharge of exportable proteins in the pancreatic acinar cell and other cells.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 53, 211-354 (1978).</li><li>Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+explant+outgrowth+culture+model+for+mouse+pancreatic+acinar+cells+with+long-term+maintenance+of+secretory+phenotype.">A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype.</a> Eur. J. Cell. Biol. 90, 1052-1060 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von pankreatischen Azinuszellen. Dieses Verfahren macht es möglich, mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Tier acinar in weniger als 1 h zu isolieren. Dank seiner schnellen und einfachen Implementierung (so viele wie 10 Bauchspeicheldrüsen unabhängig pro Experiment parallel verarbeitet werden), wird dieses Protokoll als guter Kompromiss zwischen bestehenden Isolation Methoden 3-5,9-12,17. Kritische Schritte...

Ein häufig auftretendes Problem für Forschungslabore auf exokrinen Pankreasgewebe ist die Schwierigkeit der Kultivierung Azinuszellen in vitro für einen bestimmten Zeitraum lang genug, um ein langfristiges Experiment erlauben. Ein Faktor behindern Entwicklung solcher Systeme Kultur ist die intrinsische Empfindlichkeit von Pankreas-Gewebe experimentelle Manipulation durch den hohen Gehalt in glykolytischen, proteolytische und lipolytische Enzyme, die wörtlich verdauen Pankreasgewebe, wenn sie bei der Isolierung von pankreatischen Zellen freigesetzt werden. Ein zweiter Faktor ist die bemerkenswerte in vitro Plastizität Azinuszellen, die ihre sekretorischen Eigenschaften verlieren und transdifferenzieren anderen reifen Zellen, wie Pankreasgangzellen oder Leber-ähnlichen Zellen 1. Neigen In vitro variiert diese Zellplastizität mit den experimentellen Bedingungen (z. B. Zusammensetzung des Kulturmediums) 2 </sup&gt; und stellt ein gewisses Maß an Komplexität in der Gestaltung geeigneter Kulturbedingungen für exokrinen Pankreas-Zellen 1. Mehrere Methoden zur Isolierung und Kultur der Azinuszellen, zuerst aus dem Meerschweinchen Bauchspeicheldrüse 3-5 entwickelt. Zunächst werden die Protokolle Verdauung von Pankreasgewebe mit Kollagenase, Chymotrypsin und einer Protease Cocktail beteiligt, mit ultimativen Isolierung durch kräftiges mechanische Dissoziation. Die Zellen der Bauchspeicheldrüse auf diese Weise isoliert angezeigt abnorme strukturelle und funktionelle Eigenschaften, insbesondere ein Verlust von apikalen Strukturen und erhebliche Schäden an ihrer Membran-Rezeptoren. Isolierte Zellen blieben nur für 1 oder 2 Tage lebensfähig. Herstellung von dispergierten acini unterhält ihre intra-und interzellulären Architektur, die Erhaltung Zellmembranen, Schadensbegrenzung zu Oberflächen-Rezeptoren und damit die Verbesserung der exokrinen Sekretion in Reaktion auf Sekretagoga 6-8. Als result, bietet dieses Verfahren den großen Vorteil, sich Azinuszelltumoren Lebensfähigkeit zu 7-10 Tagen in vitro. Darüber hinaus ist dieses Verfahren derzeit Azinuszelltumoren Isolierung 9-12 da die Wartung der interzellulären Kontakte, darunter Zelle Kopplung durch Gap Junctions, ist eine wesentliche Determinante des exokrinen Pankreas Azinuszelltumoren Phänotyp 13 bevorzugt. Da die Entdifferenzierung von Azinuszellen und ihre transdifferentiation zu duktalen Zellen ist einer der vorgeschlagenen Mechanismen für die Entstehung von aggressiven exokrinen Bauchspeicheldrüsenkrebs 14, ist die dispergierte acini Modell auch ein geeignetes System zur Pankreas-Plastizität und ihrer späteren molekularen Mechanismen zu studieren. Darüber hinaus in Kombination mit dem Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren 15,16 und die Entwicklung von Gentransfer-Techniken (Adenovirus 2 oder lentiviralen Transduktion, Einsatz von Nanopartikeln, etc), diese in vitro primäre Azinuszelltumoren Modell kannsehr nützlich sein, zu bestimmen, wie verschiedene genetische Störungen der Regulierung der Azinuszelltumoren Differenzierung oder Entdifferenzierung beeinflussen und sollte ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge verantwortlich für das Auftreten von Pankreatitis, Krebsvorstufen und Veränderungen in Zellplastizität bieten. Isolation von dispergierten acini ist der Ansatz, die wir in unserem Labor zu Kultur Azinuszellen des Pankreas. Wir beschreiben und diskutieren die Methode verwendet. Es handelt enzymatische Dissoziation von Pankreasgewebe (mit einer bakteriellen Collagenase) gekoppelt mechanisches Aufbrechen ohne Dissoziation Azinuszellen. Während die meisten Protokolle Kultivieren der Acini, beinhalten entweder in Suspension oder auf speziell behandeltem Kunststoff Substraten wachsen wir sie in Suspension nur kurz (24 Std.), Säen sie anschließend auf einer Matrix Gerüste, wenn längerer Zellkultur erforderlich. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) des Pankreas verteilt acini, nachhaltige für mehr als eine Woche in der Kultur. Es ermöglicht Isolierung von mehr als 20 x 10 6 Zellen pro Maus acinar Bauchspeicheldrüse. Die Einfachheit ist es möglich, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Durch die Beibehaltung des intra-und interzellulären Architektur der Acini und damit die acinar Phänotyp der isolierten primären Zellen, stellt dieses Modell ein System der Wahl für die Untersuchung von Mechanismen transdifferentiation, wie alle anderen exokrinen derzeit verfügbaren Modelle von Tumoren der Bauchspeicheldrüse Anzeige von vielen genetischen abgeleitet Änderungen, die zu zellulärer Transformation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.2 &mu;m filter</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>146560</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357551</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 &mu;m filter</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1000 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>20 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-1810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>200 &mu;l filter tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357535</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml serological pipettes</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml polypropylene tube</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic acid 100%</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase IA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2676</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Curved forceps, Dumont #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14188</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting scissors, straight</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14393</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epidermal Growth Factor, human</td>
			<td>Promokine</td>
			<td>C-60180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol absolute (AnalaR Normapur)</td>
			<td>VWR BDH Prolabo</td>
			<td>20821.310</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-801F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumont #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14098</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hank's Balanced Salt Solution 1x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES 1 M (pH 6.98-7.30)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator O2/CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-19M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microbiological Safety Cabinet, level II</td>
			<td>Faster</td>
			<td>SafeFast Elite 212 S</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Noyes scissors, sharp/sharp tips, German</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500228-G</td>
			<td>To sterilize before use</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin mixture</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x </td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P20</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123600</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipetman P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Paramount Surgimed Ltd.</td>
			<td>Disposable Scalpel Size 23</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>T25 flask, 25 cm2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707481</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin inhibitor, from Glycine Max</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Waymouth's medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31220-023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Trennung (in weniger als 1 Stunde) von Maus Pankreasazini, so dass es möglich ist, sie in der Kultur für mehr als eine Woche halten. Mehr als 20 x 10 6 Azinuszellen aus einem einzigen murine Pankreas gewonnen werden. Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, unabhängig verarbeiten zu 10 Pankreas sind. Weil es acinar Architektur bewahrt, ist dieses Modell auch für das Studium der Physiologie des exokrinen Pankreas in vitro im Gegensatz zu Zelllinien aus Tumoren der Bauchspeicheldrüse, die viele genetische Veränderungen zu einer teilweisen oder vollständigen Verlust ihrer acinar Differenzierung angezeigt gegründet geeignet.

Abbildung 1 schematisch die &quot;verteilt&quot; acini Methode zur primären Azinuszellen Isolation. Die entscheidenden Schritte, die streng im Protokoll eingehalten werden müssen, werden in der Diskussion Teil beschrieben. Um die Entfernung zu erleichtern, hat die Bauchspeicheldrüse vom Abdomen zusammen mit der beigefügten Milz (2) gesammelt werden. Beide Organe müssen auseinander geschnitten werden, und das verbleibende Fettgewebe, die noch an der Bauc...

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Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

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Research

JoVE Journal

Biology

35.3K Aufrufe.  Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon.  In dieser Veröffentlichung beschreiben wir eine schnelle und bequeme Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von primären Azinuszellen des Pankreas von dem murinen Bauchspeicheldrüse. Diese Methode stellt einen wertvollen Ansatz, um die Physiologie der frischen primären normal / transformierten exokrinen Pankreas-Zellen zu studieren. 

Serie: Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Forschung

Biologie

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work demonstrates how the secretory capacity of these cells can be assessed by culture of isolated acini. The setup is advantageous since isolated acini, which retain many characteristics of the intact exocrine pancreas can be manipulated and monitored more readily than in the whole animal. Proper isolation of pancreatic acini is a key requirement so that the ex&#160;vivo culture will represent the in&#160;vivo nature of the acini. The protocol demonstrates how to isolate intact acini from the mouse pancreas. Subsequently, two complementary methods for evaluating pancreatic secretion are presented. The amylase secretion assay serves as a global measure, while direct imaging of pancreatic secretion allows the characterization of secretion at a sub-cellular resolution. Collectively, the techniques presented here enable a broad spectrum of experiments to study exocrine secretion.

Isolated pancreatic acini retain their in&#160;vivo morphology and activity and offer powerful ways for monitoring and manipulating secretion. This work demonstrates how acini can be isolated from the mouse pancreas, and how their secretory capacities can be assessed.

Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...