Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der US-Israel-BSF finanziert, um BS und EDSBS ist ein Inhaber des Hilda und Cecil Lewis Professur in Molekulargenetik.

HINWEIS: Verfahren mit tierischen Patienten wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) am Weizmann Institute of Science genehmigt worden. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Isolierung von Pankreasazini <ol><li> Bereiten Sie 300 ml frischem Krebs-Ringer-Bicarbonat HEPES (KRBH) Medium vor dem Start. Mischen 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11 mM Glucose, 10 mM HEPES. Hinzufügen Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (STI) (Resuspensionsmedium). Bereiten 5 - 10 ml Resuspensionsmedium mit Kollagenase (~ 0,75 mg / ml) (Digestionsmedium) ergänzt. </li><li> Oxygenieren die KRB Medium für ~ 30 min. Fügen BSA nach Sauerstoffblasenbildung zu verhindern. Bringen Aufwirbelung und Verdauung Medien bis 37 ° C. HINWEIS: Sauerstoffanreicherung des Mediums reduziert Zellmortalität und verbessert Reaktionsfähigkeit auf die Sekretion. Die Wirkung der Oxygenierung mindestens 6 h deutlich. </li><li&gt; Opfer der Maus durch Genickbruch oder CO 2 Erstickung, nach institutionellen Tierpflege-Richtlinien. Legen Sie das Tier geopfert auf dem Rücken, verbinden Sie es mit einer Dissektion Pad und reinigen Sie die Bauchdecke mit Ethanol. HINWEIS: Um Verunreinigungen zu vermeiden, Autoklaven werden die Dissektion Werkzeuge und die für KRBH Medium vor Gebrauch verwendete Wasser. Filtern KRBH Medium durch ein 0,2 um-Filter. Vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse die Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol spülen und durchzuführen Dissektion auf eine saubere Bank. Durchführung von Virusinfektionen in einem Level 3 Bio-Sicherheitsschrank. Fügen Antibiotika auf den O / N Kulturmedium (siehe Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Ausschneiden des murinen Pankreas <ol><li> Schnitt weit die Bauchhaut und Unterhaut. Identifizieren Sie die Leber, Magen, Darm, Bauchspeicheldrüse und Milz (Abbildung 1). HINWEIS: In den folgenden Schritten, behandeln die Pankreasgewebe vorsichtig und vermeiden Sie übermäßigen mechanischen force auto-Verdauung des Gewebes und Zelltod verhindert. </li><li> Durch die Verwendung von zwei stumpfen Pinzette, ziehen Sie den Dünndarm. Beginnen an den Dünndarm proximalen Ende, nahe dem Ausgang aus dem Magen. Trenne die Bauchspeicheldrüse aus dem Darm und bewahren Sie sie in der Körperhöhle. Nach Erreichen des Dickdarms, bemerken eine rosa / weiß Bindegewebe. Nicht zu verwechseln mit der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Zu löschen, so viel Pankreasgewebe wie möglich, ohne das Sammeln Fett oder Bindegewebe. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse durch Lösen aus der Milz und Magen und Schneiden der Bauchblutgefäße darunter (Abbildung 1A-C). HINWEIS: Da die Ausbeute an Pankreasazini von einem einzigen Tier hoch ist, kann man von Sammeln aller Pankreasgewebe um das Sammeln anderer Gewebe zu verhindern, zu unterlassen. </li></ol></li><li> Collagenaseverdau <ol><li> Spülen Sie die Bauchspeicheldrüse ein paar Mal in Resuspensionsmedium auf 37 ° C erhitzt und entfernen übrigen Teile des nicht-Pankreas-Gewebe. Tauchen Sie in die Bauchspeicheldrüse ~ 5 ml vorgewärmten Verdauung Medium in einem 20 ml Szintillationsfläschchen. Hackfleisch in der Bauchspeicheldrüse an Stücke von 1-3 mm. Legen Sie sie in einem beheizten Wasserbad (optimal unter Rühren von ~ 100 rpm). , Um die Verdauung zu beschleunigen, Pipette der verdauten Gewebe auf und ab, wenn alle paar Minuten. HINWEIS: Die Dauer Collagenaseverdau hängt hauptsächlich von der Kollagenase-Konzentration und der Menge der mechanischen Kraft auf das Gewebe aufgebracht. Verwendung von 0,75 mg / ml Collagenase für ungefähr 15 min und Pipettieren der Gewebe mit einer 5 ml Polystyrolpipette mit einer 2 mm Düse alle 3 - 5 Minuten, was zu Acini 10-30 Zellen. Nach der Verdauung, wird die Suspension trübe, die sichtbare Gewebestücke. Seit Collagenasen Effizienz variiert zwischen verschiedenen Handelstypen und viele, bestimmen den Zeitpunkt der Verdauung empirisch. </li><li> Waschen und Filtrieren <ol><li> Übertragen Sie das verdaut Gewebe in einem 50-ml-Tube und beenden digestion durch Zugabe von 45 ml Medium resuspendiert. Filtern der Suspension durch ein grobes (~ 1 mm) Metallnetz in ein frisches Röhrchen. Zentrifugieren des Durchflusses bei 100 × g für 3 min. </li><li> Überstand verwerfen und suspendiert die Bauchspeicheldrüse verdaut in 50 ml Resuspensionsmedium. Filtern der Suspension durch ein 70 oder 100 um Nylonnetz. Zentrifuge vor. </li><li> Um schwimmende, beschädigte Acini zu entfernen, den Überstand verwerfen und resuspendieren Pankreasgewebe in 3-5 ml Resuspensionsmedium. Es wird 1 ml der Pankreas-Acini in 15 ml konischen Röhrchen mit 7 ml Resuspensionsmedium gefüllt. Lassen Sie die Acini für 2 beigelegt - 3 min. Sammeln Sie die Acini, die am Boden der Röhre mit einer 1 ml Pipette angesiedelt haben, und wiederholen Sie diesen Schritt 2 - 3 mal. </li><li> Sehen Sie sich die Pankreasazini unter einem Lichtmikroskop oder sezieren, um ihren Zustand zu prüfen. In Abbildung 2, beobachten die Reinheit der Isolation und der Schäden auf die Zellen Duri zugefügtng Isolation. Verwenden Sie diese Acini sofort oder Kultur für bis zu 20 Stunden. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Amylase Sekretion Assay HINWEIS: Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß für die sekretorische Kapazität von Pankreasazini. Dies wird durch Sammeln des Mediums, in dem das Pankreas-Acini wurden inkubiert, und die Bestimmung der Amylaseaktivität des Mediums, in der Regel unter Verwendung eines kommerziellen Kits erreicht. <ol><li> Bestimmen der Anzahl von experimentellen Bedingungen untersucht werden (zB nicht-stimulierten versus stimuliert). Verwenden Sie mindestens drei Wiederholungen für jede Bedingung. Außerdem fügen Sie eine Reihe von Wiederholungen, um die Gesamtzell Amylase-Gehalt (&#39;Total&#39; Probe) und einen Satz für die Amylase-Aktivität des Mediums (&quot;Null&quot;-Probe) zu bestimmen. Label eine Multi-Well-Platte, in der der Assay durchgeführt werden, und zwei Sätze von Mikroröhrchen für jede der Wiederholungen verwendet werden. HINWEIS: 12 oder 24-Well-Plattes kann zur Überwachung 1 und 0,5 ml acinar Suspensionen, bzw. werden. </li><li> Zweimal waschen Sie die Acini in 30 ml KRBH Resuspensionsmedium und Inkubation sie in Resuspensionsmedium für 30 min bei 37 ° C. Um die Multi-Well-Platte fügen Sie ein 10 ul Tropfen secretagogue die angemessene endgültige Konzentration zu erreichen. </li><li> Pankreasazini reagieren auf eine Steigung von secretagogue in einem zweiphasigen Weise. Die Konzentrationen optimale Sekretion Werte von 50 bis 100 pM von Cholecystokinin (CCK) und 1 uM Carbachol (3A) 5. </li><li> Waschen und resuspendieren Acini in Resuspensionsmedium. Stellen Sie sicher, dass die Acini sind homogen in der Suspension und aliquoten gleiche Mengen von Suspension in die Multi-Well-Platte und in die &#39;total&#39;-markierten Mikroröhrchen verteilt. Inkubiere die Platte für 30 min bei 37 ° C aufweist. (Vorzugsweise in einem Wasserbad unter leichtem Schütteln (~ 50 min)). HINWEIS: Die genaue Zahl der Acini zwischen experimen variierents sollte aber ähnlich in Wiederholungen innerhalb der einzelnen Experiment. So ist präzise Aliquotierung der Acini Suspension entscheidend für den Vergleich zwischen den verschiedenen Wiederholungen und Bedingungen. </li><li> Während der Inkubation produzieren die &quot;Gesamt&quot; und &quot;Null&quot;-Proben. Zentrifugieren Sie die &quot;Gesamt&quot; Mikroröhrchen für ein paar Sekunden bei 5.000 × g und entfernen 50 ul aus dem Überstand in &#39;zero&#39;-markierten Mikroröhrchen und legen Sie sie bei 4 ° C. Lyse der Acini in den &quot;Gesamt&quot;-Proben durch Zugabe von Triton X-100 zu den Mikroröhrchen, um eine endgültige Konzentration von 1% zu erreichen. Mischen Sie den Mikroröhrchen kräftig. HINWEIS: Aliquote &quot;Insgesamt&quot; repliziert ähnlich wie bei den Wiederholungen des Experiments. Lyse der Azini, führt zur Freisetzung des gesamten Amylase-Gehalt. Alternativ erfassen die Acini zu jedem Zustand und Lyse am Ende des Experiments, um den zellulären Gehalt an jede Wiederholung zu bestimmen. </li><li> Sammeln Sie die meisten der acinar Suspension inin der ersten Reihe von den pre-markierten Mikroröhrchen. Zentrifugieren der Mikroröhren für einige Sekunden bei 5000 × g auf. Den Überstand in den zweiten Satz der vorge markierten Mikroröhrchen. </li><li> Assay des Überstands für die Amylase-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit. Berechnen Sie den Prozentsatz der Amylase sezerniert. Hinweis: Es ist entscheidend, die Amylase-Aktivität in seinem linearen Bereich zu lesen. Präsentieren der Prozentsatz der Amylase als Prozentsatz der Amylase von der anfänglichen Gesamtgehalt freigesetzt sezerniert. Subtrahieren Sie die Hintergrundebene Amylase des Mediums aus jeder dreifacher Ausfertigung und teilen sie durch die ebenfalls normierten Anfangsgesamtgehalt. </li></ol> 3. Live-Imaging von Pankreas-Sekretion Sekretion aus Pankreasazini kann direkt durch Live-Bildgebung überwacht werden. Mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen und Sensoren ermöglicht die Live-Darstellung die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. <ol><li> Frisch herstellen Sauerstoff angereichert Resuspensionsmedium wie ichSchritt n 1.1 und bringen es auf 37 ° C. Stellen Sie das Mikroskop, und wenn mit einem Temperaturregler ausgestattet, passen sie auf 37 ° C. </li><li> Waschen Sie die Azinuszellen in 30 ml Resuspensionsmedium und legen Sie sie in einem Glas oder Kunststoffrutsche. Hinweis: Wenn lipophile Farbstoffe verwendet werden, um Label für Plasmamembran mit lipophilen Farbstoffen markiert, färben die Acini für nicht mehr als 5 min auf die Kennzeichnung von internen Membranen, die durch Endozytose zu verhindern. Während der Arbeit, übernehmen die Acini vorsichtig und vermeiden Pipettieren. </li><li> Einmal am Mikroskop ist die Bild Acini, deren Morphologie klar, und Bildgebung von Acini die basolaterale Bläschen oder intrazelluläre Vakuolen Display zu vermeiden. Hinzufügen Sekretagogum tropfenweise oder mit Hilfe einer Perfusionskammer, entweder während oder unmittelbar vor dem Beginn der Bilderzeugung. Hinweis: Ein hoher Vergrößerung Objektive mit hoher numerischer Aperturen (zB × 63 / 1,4 × 100 oder / 1.4) wird empfohlen, subzellulärer Strukturen zu beobachten. </li></ol> 4. O / N Kultur Pankreasazini (Alternate Zellkulturtechnik) HINWEIS: O / N Kultivierung wird oft für Adeno-Virus-Infektion eingesetzt. 16 h vor der Untersuchung - Infektion wird bei 10 6 bis 10 7 pfu / ml für 9 durchgeführt. <ol><li> Kultur Pankreasazini für bis zu 20 Stunden. Aus einer einzigen Pankreas in 25 ml Kulturmedium (DMEM resuspendiert erhalten Acini mit fötalem Kälberserum (FCS) (5%), Natrium-Pyruvat (1%), Antibiotika (1%), L-Glutamin (0,5%), BSA ergänzt (10 mg / ml) und STI-(0,2 mg / ml), und geteilt zu fünf 10cm-Platten. infizieren die Acini mit Virus in einer Ebene 3 Bio-Sicherheitsschrank. </li><li> Inkubiert Pankreasazini bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchtete Luft. Ermöglichen Acini in sauerstoffhaltigen Resuspensionsmedium 30 min zu erholen, bevor nachfolgende Untersuchung 3,8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. 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The authors declare they have no competing financial interests.

Neben der Ex-vivo-Kultur, alternative Setups für das Studium der exokrinen Sekretion gehören Intravitalmikroskopie und die Messung von Flüssigkeiten aus dem Pankreasgang. Intravitalmikroskopie wurde gezeigt, dass in der Maus Speicheldrüsen 10 gut bedienen. Dieses Verfahren kann die Sekretion in Echtzeit in dem intakten Tier aufnehmen, wird aber in der Auflösung und durch die Einrichtung zum Manipulieren des exokrinen Gewebe beschränkt. Beurteilung Sekretion durch Sammeln von Flüssigkeiten aus ...

Exokrinen Pankreas bildet den größten Teil der Masse des Säugerpankreas und arbeitet an der Produktion und Sekretion von Verdauungsenzymen 1. Die Funktionseinheit des exokrinen Pankreas, Azinus, ist ein Cluster von Epithelzellen, die ein gemeinsames Lumen bildet und Anteile. Auf hormonelle oder neuronale Stimulation werden Vesikel mit Enzymen gefüllt, um der apikalen Zelloberfläche transportiert mit ihm, Sicherung und vertreiben ihre Inhalte in das Lumen 1-3. Die sekretierten Enzyme werden dann durch einen Koaleszenz-Satzes von Kanälen in den Dünndarm, wo sie den Abbau von Lebensmitteln in Nährstoffe katalysieren abgelassen. Dieses Video zeigt, wie intakt Azini werden von der ganzen Bauchspeicheldrüse isoliert und wie ihre sekretorischen Kapazität beurteilt werden kann. Mit diesem Setup wird Pankreas-Sekretion durch Messung der relativen Menge an Amylase, die nach Stimulation veröffentlicht wurde quantifiziert. Alternativ kann die Sekretion Live durch die Verwendung von verschiedenen abzubildendenSensoren und Farbstoffe. Die Ex-vivo-Setup Pankreasazini ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften der intakten Bauchspeicheldrüse behalten, manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier 4-6 werden. Dieser Aufbau wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und da bei der Untersuchung der verschiedenen exokrinen Gewebe ausgedehnt wie der Speichel und Brustdrüsen 3-7. Bemerkenswerterweise ermöglicht es die Untersuchung der Sekretion mit minimaler Störung der komplexen Zellverbände dieser polarisierten Epithelien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Azinuszellen des Pankreas produzieren und sezernieren Verdauungsenzyme. Diese Zellen werden als Cluster, die eine gemeinsame Lumen bildet und Aktien organisiert. Diese Arbeit zeigt, wie die sekretorische Fähigkeit dieser Zellen durch Kultur von isolierten Acini bewertet. Das Setup ist vorteilhaft, da isolierte Azini, die viele Eigenschaften des intakten exokrinen Pankreas behalten können manipuliert und leichter überwacht als in der gesamten Tier werden. Die richtige Isolierung von Pankreasazini ist eine wesentliche Voraussetzung, so dass der Ex-vivo-Kultur wird die in-vivo Natur der Acini darstellen. Das Protokoll zeigt, wie intakt Acini von der Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. Anschließend werden zwei komplementäre Verfahren zur Bewertung Pankreassekretion dargestellt. Die Amylase-Sekretion Assay dient als globales Maß, während die direkte Abbildung von Pankreas-Sekretion ermöglicht die Charakterisierung der Sekretion bei einer subzellulärer Auflösung. Gemeinsam presen die TechnikenTed hier ermöglichen ein breites Spektrum von Experimenten zur exokrinen Sekretion studieren.

Pankreasazini, die ordnungsgemäß isoliert wurden zeigen eine stereotypische Morphologie bei Durchlicht betrachtet. Ihre basolateralen Domänen sollten rund und frei von Blasen erscheinen. Die apikale Domäne wird von Hunderten von sekretorischen Vesikeln umgeben und erscheint dunkler in der Farbe (Abbildung 2a, b). Die Kerne sind basal an die Bläschenbereich. Zelltrümmer und Komponenten des Pankreasgangsystems und des endokrinen Pankreas, die in frühen Stadien der Acini Isolation (2C, D)</s...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann.

Beurteilung der sekretorischen Kapazität von Azinuszellen des Pankreas

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science.  Isoliert Pankreasazini behalten ihre in-vivo-Morphologie und Aktivität und bieten leistungsfähige Möglichkeiten zur Überwachung und Manipulation Sekretion. Diese Arbeit zeigt, wie Acini von der Bauchspeicheldrüse der Maus isoliert werden, und wie die sekretorischen Fähigkeiten beurteilt werden kann. 

Serie: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Forschung

Biologie

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Phänotypisierung Maus Lungenfunktion<em&gt; In-vivo-</em&gt; Mit der Lungendiffusionskapazität

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Quantifizierung der retinalen Pigmentepithel-Phagozytose und der Lipofuszin-Akkumulation

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

Autor im Rampenlicht: Verbesserte Lipofuszinmodelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...