Die Methode ist eine hochwirksame Methode zur Isolierung von Endothelzellen von Miniaturschweinen. Und die Zellen können auch erweitert werden, untersuchen die Immun- und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation. Der Hauptvorteil der Technik ist, dass es nicht nur einfach, hochwirksam ist, hoch gereinigte Endothelzellen vom Schwein zu isolieren, sondern auch besser, um andere pAECs zu halten, wenn sie durchgehen.
Nach der Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf Schmerzreflex bei der anästhesierten Schwein, waschen Sie die Schweinebauchwand dreimal mit 75%medizinischem Alkohol, und eine Tinktur Jod. Nach der letzten Wäsche, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Bauchschnitt zu machen, um die minderwertige Vena cava zu belichten, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um 5000 Einheiten Heparin-Natrium in die untere Vena cava zu injizieren. Nach fünf Minuten einen Katheter in die Bauchaorta einlegen und mit einem Skalpell das Zwerchfell einschneiden.
Mit Hilfe eines zweiten Ermittlers entfernen Sie den linken Ventrikel und verwenden Sie Knochenzangen, um die Rippen zu verbrauchen, um das Herz und die Lunge zu entblößen. Suchen Sie die Aorta posterior zu Herz und Lunge, und klemmen Sie die Enden. Verwenden Sie die Schere, um die Aorta zu verbrauchen, und waschen Sie sie einmal mit vorgekühlten Waschpuffer.
Entfernen Sie überschüssiges Gewebe um die Aorta mit sterilen Zangen und Scheren, und legen Sie das Gefäß in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr mit frischem vorgekühltem Waschpuffer für den Transfer ins Labor. Zur Isolierung der porcine aortenen Endothelzellen die Schweineaorta unter aseptischen Bedingungen in eine 150-Millimeter-Petrischale geben und vorsichtig beide Enden des Gefäßes entfernen. Schneiden Sie zusätzliches überschüssiges Gewebe, wo das Gefäß geklemmt worden war, mit sterilen Zangen und Scheren, und verwenden Sie 20 bis 50 Milliliter frischen Waschpuffer, um die Außen- und Innenseite der Aorta zu spülen.
Als nächstes, passieren Sie eine chirurgische Naht durch die Aorta, und lose binden ein Ende des Gefäßes, die Naht innerhalb des Lumens zu halten. Fixieren Sie die Aorta in der Nähe des gebundenen Endes vorsichtig mit Zangen und ziehen Sie dann die chirurgische Naht langsam, um die Aorta umzukehren, bis die endotheliale Oberfläche der Aorta freigelegt wird. Die endotheliale Oberfläche der Aorta dreimal mit 10 Millilitern frischer Waschpuffer pro Wäsche waschen und die Aorta in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr geben.
Bedecken Sie die Probe mit 10 Millilitern 37 Grad Celsius erwärmt 0,005%Kollagenase IV Verdauungslösung, und bebrüten das Gewebe bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Am Ende der Inkubation den gesamten Rohrinhalt in eine 100-Millimeter-Kulturschale übertragen und die Verdauung mit 10 bis 15 Millilitern vorgekühltem Stopppuffer stoppen. Mit einem Zellschaber entfernen Sie vorsichtig die Aorten-Endothelzellen von der Inneren Oberfläche des Gefäßes und waschen Sie das Gefäß dreimal mit fünf Milliliter Waschpuffer pro Wäsche.
Nach der letzten Wäsche den Überstand in ein 50-Milliliter-Zenififugenrohr geben und den Boden der Kulturschale zwei Mal mit fünf Millilitern frischer Waschpuffer pro Waschgang waschen und die Wäsche in das 50-Milliliter-Rohr ziehen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und entsorgen Sie alle bis auf die letzten 10 Milliliter Überstand. Fügen Sie 20 Milliliter Waschpuffer hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden, und die Zellen mit einer anderen Zentrifugation sammeln.
Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Zellkulturmedium zum Zählen wieder auf und verkleben Sie die Zellen mit einer zwischenzehn bis sechs Zellen pro 25 Zentimeter quadratischer Kolbenkonzentration. Dann legen Sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid und erfrischen das Medium alle zwei bis drei Tage. Nach der Isolierung werden die Endothelzellen am Tag Null, eins und zwei und nach den Passagen eins und zwei auf Kontamination und deren morphologische Bewertung untersucht.
Die zytometrische Analyse durch die Durchflussmenge mit einem Anti-CD31-FITC-Antikörper weist auf eine typischerweise über 97% endotheliale Zellmarker-positive Population am dritten Tag der Kultur hin, die auch nach zwei Passagen bei einer Reinheit von über 90 % gehalten wird. Die endotheliale Oberfläche der Aorta wurde weniger als 10 Mal in nur einer Richtung, mit einem Zellschaber, abgekratzt und während des Abkratzvorgangs nicht verdichtet. Beste Antwort, optimierte Methode der pAECs-Isolierung, können wir gereinigte pAECs verwenden, um einzelne Experimente durchzuführen und die Immunabstoßung und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation zu untersuchen.
