Wir danken Sankalpi Warnasooriya und Amy Humboldt für das kritische Lesen und Bearbeiten des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Department of Energy (DE-SC0008769) und der National Science Foundation (IOS-1127017) unterstützt.

1. Wachstum von S. viridis <ol><li> Stellen Sie die Wachstumskammer Bedingungen 31 ° C/22 ° C (Tag / Nacht), 12 h Licht/12 h dunkel, 50% relative Luftfeuchte mit einem pre-dawn Behandlung von 15 ° C 8.30 bis 09.00 Uhr Uhr. (Fig. 1). Unter diesen Bedingungen S. viridis A10.1 dauert etwa 21-22 Tage von Aussaat bis Blüte. </li><li> Füllen Wohnungen (4 x 9-Zellen) mit Metro Mix 360 und entfernen Sie eine Zelle für die Bewässerung. </li><li> Leicht Nebel Wasser auf Bodenoberfläche. </li><li> Aussaat der Samen auf der Oberfläche der Erde, einen Samen pro Zelle. </li><li> Gehören die Samen mit einer Erdschicht (etwa 0,5 cm) </li><li> Mist die Oberfläche des Bodens und des Wassers Wohnungen aus dem Boden. Halten Sie die Bewässerung von unten nach Aussaat. </li><li> Für jeden Quer, die mindestens drei Anlagen durchgeführt werden als weibliche Eltern und neun Pflanzen verwendet werden, wie männliche Eltern verwendet werden. Aussaat sollte als alle Pflanzen nicht blühen am selben Tag versetzt werden. Seed sowing über einen Zeitraum von drei Tagen empfohlen, jeden Tag. </li><li> Gießen Sie die Pflanzen 1-2 mal am Tag, die abhängig von der Größe der Pflanzen und Boden Zustand. Überschüssiges Wasser im Boden ist nicht günstig für ein optimales Wachstum der Pflanzen und können das Pilzwachstum im Boden und Beschädigung der Blattgewebe führen. </li><li> Düngen der Pflanzen zweimal pro Woche, mit Jacks 15-16-17 in einer Konzentration von 100 ppm. </li></ol> 2. Trimmen und Kennzeichnung von Rispe Vor Entmannung - Tag 1 <ol><li> Am Nachmittag oder am Abend vor der Bestäubung, bewegen Sie Pflanzen aus der Wachstumskammer an das Labor (Temperatur-(T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit (RH) 21,79% ± 1,15%). </li><li> Wählen Sie die primären Rispen mit 1 Blume auf 1/3 der Blumen auf der Rispe, die bereits geblüht haben. </li><li> In dieser Studie wurden die vier Domänen innerhalb der Rispe sind wie folgt definiert (2A; Spitze distal mittlere, mittlere und proximale Basis). </li><li> Idealerweise choosea Rispe mit 1-5 Blüten, die geblüht haben, schneiden Sie die Spitze der Rispe (distalen Ende), und entfernen Sie alle Blumen in den proximalen Herz-und Basisteile mittels Feder Schere oder feinen Pinzette. </li><li> Wenn eine Rispe hat etwa 1/10 bis 1/5 der Blumen, die geblüht haben, schneiden Sie die Spitze und Zierblumen aus dem Boden der Rispe, nur für weitere Trimmen behalten den unteren Bereich des distalen mittleren und oberen Bereich des proximalen Mitte. </li><li> Wenn eine Rispe hat etwa 1/4 bis 1/2 der Blumen, die geblüht haben, schneiden Sie die distalen Mittelteil und den proximalen mittleren Abschnitt für weitere Trimmen nur behalten. </li><li> Verwenden chirurgische Schere leicht schneiden Sie die Borsten. </li><li> Entfernen Sie alle Blumen, die geblüht haben und alle unreifen Blüten verlassen ca. 20-30 Blüten / Rispe, die gleichmäßig in der Region verteilt sind (Abbildung 3). Üben Sie Sorgfalt, um die Borsten in der Region, um Röschen von möglichen Hitzeschäden zu schützen bestäubt werden beibehalten.Für jedes Ährchen, behalten die Ober reifste Blümchen. Die oberste Blümchen wird eine höhere Wahrscheinlichkeit der Blüte zum Zeitpunkt der Bestäubung (2B) haben. </li><li> Markieren Sie eine Seite jeder Blume mit einem roten Edding und notieren Sie die Anzahl der Blüten auf dem Rispe (2B). </li><li> Flagge der Rispe mit den folgenden Informationen: das Datum der Entmannung, der Dauer und der Temperatur, bei der die Entmannung durchgeführt. </li><li> Sobald der Rispe getrimmt, entfernen Sie alle Motorhacken jeder Pflanze, um die Neuverteilung von Ressourcen, um die Entwicklung der Haupt Rispe zu gewährleisten. </li></ol> 3. Entmannung mit Warmwasser-Tauchen - Tag 1 <ol><li> Stellen Sie das Wasserbad auf 48 ° C ± 0,1 ° C für die Wärmebehandlung. </li><li> Vorsichtig biegen die Rispen abgeschnitten und tauchen sie in warmem Wasser bei 48 ° C für 3-6 min. Seien Sie vorsichtig, nicht auf den Stamm der Rispe zu brechen. </li><li> Über 3-4 Rispen kann getaucht werden together zu einer Zeit, und gleichzeitig genügend Raum zwischen den Rispen für eine gleichmäßige Verteilung der Wärme. Es ist wichtig, die gesamte Rispe in warmes Wasser tauchen während der Wärmebehandlung. Die Flagge Blatt (das Blatt aufspannt die Rispe, die die Nährstoffe in die Rispe bietet) sollten nicht in Kontakt mit warmem Wasser kommen, um Hitzeschäden an Blattgewebe zu verhindern. </li><li> Sobald der Entmannung für die gewünschte Dauer durchgeführt, entfernen Rispen aus dem Wasserbad und schütteln Sie das Wasser von der Rispe. </li><li> Legen Sie eine kundenspezifische Mikrolochbrottasche, um vollständig zu decken entmannt Rispe und sichern Sie es mit einem Twist-tie. Micro-perforierten Brotbeutel kann je nach der Größe der Rispe angepasst werden (enthalten in Video). </li><li> Zeigen Pflanzen zurück in der Wachstumskammer bis zum nächsten Tag. </li></ol> 4. Crossing / Bestäubung nach Entmannung - Tag 2 und Tag 3 <ol><li> Um 9:00 Uhr am Tag 2 und Tag 3, bewegen weiblich (kastriert) und malE Eltern aus der Wachstumskammer zu dem Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%), um Kreuzungen durchzuführen. </li><li> Beobachten Sie und fügen Sie ein weiteres roten Punkt, um Blumen, die geblüht haben oder blühen mit einem roten Edding. Notieren Sie sich die Gesamtzahl der blühte Blüten pro Rispe. </li><li> Notieren Sie das Datum der Bestäubung und den Namen des männlichen Elternteils auf dem Tag zu verfolgen, was Kreuze werden durchgeführt, zu halten. </li><li> Beachten Sie die Peak-Zeit der Blüte bei männlichen Eltern. Unter unserem Kammerbedingungen (Abbildung 1) Blumen auf den Rispen der männliche Elternteil beginnen Synchronöffnung um 10.10 Uhr. Ab dem Zeitpunkt der Öffnung der Blüten, wird die komplette exsertion von Staubbeuteln und Freisetzung von Pollen nach 20 Minuten auftreten. </li><li> Die ideale Bühne für die Bestäubung ist die Phase, in der die Pollen der männlichen Eltern freigegeben wird. Die Blumen werden nach 20 Minuten von Pollenfreisetzung zu schließen. Daher ist etwa 40 Minuten ab dem Zeitpunkt der Öffnung des Strömungs die Dauer der BlüteERS. Die Farbe ändert sich von Pollen gelblich weiß bis braun über einen Zeitraum von etwa 30 min nach der Blüte schließt. </li><li> Starten Bestäubung, sobald gelblich-weißen Staubbeuteln auf Blumen des männlichen Eltern sichtbar sind. Befruchtungen werden am Tag 2 und Tag 3 unter Verwendung einer der drei Techniken durchgeführt: <ol><li> Rispe zu Rispe Bestäubung: freistehend mit einer Rispe als männlich, sanft einmassieren das zusammen mit der Rispe Rispe entmannt, um die Bestäubung zu erleichtern und entsorgen Sie die männlichen Rispe, um eine Kontamination zu vermeiden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Bestäubung jeder Rispe entmannt wurde von 2-3 Rispen bestäubt worden. </li><li> Staubbeutel-zu-Stigma Bestäubung: mit einer Pinzette nehmen eine Blume, die mit gelblich-weißen Staubbeuteln blühen wird oder holen Staubbeutel und körperlich berühren Sie die Narbe der Blüte auf den weiblichen Elternteil. Verwenden Sie eine Blume aus dem männlichen Elternteil auf eine Blume auf dem entmannt Rispe bestäuben. Wiederholen Sie die Bestäubung process bis jede Narbe auf der Rispe entmannt wurde von ein paar (ca. 2-3) Blumen / Staubbeutel bestäubt worden. Das Tragen eines Vergrößerungsblende wird eine bessere Sichtbarkeit zu machen, um die Bestäubung durchzuführen. </li><li> Zwischen den Befruchtungen von verschiedenen männlichen Eltern, tauchen die Zange in 95% Ethanol, gefolgt durch Abwischen mit Kimwipes, um eine Kontamination durch Verschleppung von Pollen zwischen verschiedenen Kreuzungen zu vermeiden. </li><li> Rispe Bindung: Nach Entmannung, wählen 3-4 Rispen auf den männlichen Elternteil, das am nächsten Tag blühen wird. Binde sie zusammen mit dem entmannt Rispe des weiblichen Elternteils mit einem Twist-Krawatte. Positionieren Sie den entmannt Rispe Rispe leicht unter dem des männlichen Elternteils. Legen Sie ein Glassine-Tasche über den Rispen und sichern Sie die Tasche an der Basis mit einer Büroklammer. Dies kann am Tag 2 abgeschlossen werden, sobald die Rispen des männlichen Eltern Blüte beginnen. </li><li> Während der Blütezeit in den Morgen von Tag 2 und Tag 3, Flick oder schütteln Sie die Glassine-Tasche, um facilitate Bestäubung. Fahren Sie über die gesamte Dauer der Blüte am Morgen (zwischen 9.00 Uhr-11: 00 AM) Flick oder schütteln Rispen alle 15 min. Rispen des männlichen Eltern entfernen nach der Bestäubung und beschriften Sie die gegenüberliegende Seite der blühten Blumen auf dem entmannt Rispe. Notieren Sie die Anzahl der blühten Blumen auf der Rispe von jedem weiblichen Elternteil. </li></ol></li><li> Sobald die Bestäubung durchgeführt wurde, legen Sie eine kundenspezifische Mikrolochbrottasche, die Rispe des weiblichen Elternteils abdecken und sichern an der Basis mit Hilfe eines Twist-tie nach der Bestäubung bis zur Samenernte. </li></ol> 5. Seed Ernten <ol><li> Ernte Samen nach 2 Wochen (14-16 Tage) ab dem Tag der Bestäubung. Legen Sie den Tag in der gleichen Tasche der Samen. Samen, die roten Markierungen auf beiden Seiten stellen die Samen, die aus der kontrollierten genetischen Kreuzung geführt. Diese werden voraussichtlich Outcross Nachkommen sein. </li><li> Entsorgen Sie die Samen ohne rote Markierungen, wie sie vertretendie Samen, die aus neu entwickelten Blüten nach Entmachtung führen. Samen mit roten Markierungen nur auf einer Seite wird wahrscheinlich stellen die Samen, die aus Selbstbestäubung, da sie nicht zu der Zeit, wenn die Kreuze gesteuert wurden durchgeführt, zu blühen. </li><li> Trockene Samen bei 30 º C für 2 Tage in einem Keim Trockner. Shop getrockneten Samen im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) oder in einer Saatgutkammer (T: 4,0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Bedeutung der pre-dawn Behandlung Um eine hohe Frequenz von Outcross Nachkommen zu erhalten, ist es wichtig, hochsynchronen Blüte der männlichen und weiblichen Eltern haben. Zunächst fuhren wir Temperatur-und Lichtsysteme (31 ° C/22 ° C Tag / Nacht) und nutzte die S. viridis Beitritt A10.1 für alle Befruchtungen. Unter diesen Bedingungen, öffnen die meisten Blumen am frühen Morgen, bevor die Temperatur steigt auf 31 ° C, obwohl einige Blüten geöffnet zufällig zwischen 08.00 Uhr-8: 00 PM. Frühere Studien in S. italica zeigen, dass die Tageszeit, Standort und Jahreszeit dazu beitragen, in der Blüte 7,15,16 variante. Siles et al. 6 darauf hingewiesen, dass der Blüte wurde mit raschen Veränderungen in Temperatur und Luftfeuchtigkeit verbunden, aber nicht mit niedriger Temperatur und hoher Luftfeuchtigkeit, an sich, wie in früheren Studien 7,15 abgeschlossen. Deshalb beschäftigten wir pre-dawn Kältebehandlung von 15 ° C für 30 min (ab 08.30 Uhr-9: 12.00 Uhr) zu imitierendie natürliche pre-dawn Zustand. Das pre-dawn Kältebehandlung bei der Synchronisierung der Blüte bei den Eltern unterstützt. Wir beobachteten, dass, obwohl die Einstellung der Kammer für eine relative Luftfeuchtigkeit von 50%, die relative Feuchtigkeit in der Kammer auf ein Niveau von über 70%, wenn die Temperatur sank von 22 ° C bis 15 ° C und weiter auf über 70% zu bleiben, bis die Temperatur stieg allmählich auf 31 ° C nach 09.30 Uhr. Um 9:00 AM, entmannt weiblichen Eltern und Pflanzen der männlichen Eltern werden ins Labor gebracht (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). Blumen der männlichen Eltern beginnen Öffnung um 10.10 Uhr, und der Bestäubung kann um 10:30 Uhr-11 durchgeführt werden: 00.00. Eine detaillierte Liste mit allen Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 2 angegeben. Die Bedeutung der Rispe Vorbereitung für Entmannung Unter den Kammerbedingungen in dieser Studie (Abbildung 1), die Dauer der Primär Rispe Blüte reichte von2-3 Tage. Typischerweise Blumen am distalen Mitte des Blütenstandes (Abbildung 2A) offene erste und Öffnungsvoran proximal und distal. Die ideale Anzahl von Blumen auf der Rispe beibehalten 20-30. Bei der Entfernung von unreifen Blüten sollten Vorsicht genommen, so dass nur gut entwickelten Blüten (die oberste Blume oder auf der größten Ährchen 17) beibehalten werden. Die Markierung mit roten Marker auf beiden Seiten der Blumen hilft, effizienter zu unterscheiden mutmaßlichen Outcross Nachkommen von Samen aus neu entwickelten Blüten nach Entmannung. Darüber hinaus ist es wichtig, die Borsten auf den Rispen vor Entmannung zu verlassen, um die Blüten aus dem umfangreichen Hitzeschäden zu schützen, aber als Option, sie können nach der Entmannung mit Feder Schere, um die Bestäubung zu erleichtern entfernt werden, insbesondere wenn eine Rispe verbindlich Technik eingesetzt wird (2C und 2D). Optimierte Temperatur eind Behandlungsdauer für Warmwasseraufbereitung Die Grundlage für die Entmannung durch warmes Wasser Tauchen ist, dass Pollen ist empfindlicher auf Hitze als die Narbenfläche. Allerdings kann die Dauer und Temperatur der Wärmebehandlungen unter Setaria-Arten und Beitritte variieren. Im allgemeinen wird eine höhere Temperatur eine kürzere Behandlungszeit oder einer niedrigeren Temperatur mit einer längeren Behandlungszeit die gleiche Wirkung auf die Schwächung. Es wurde berichtet, dass eine Wärmebehandlung von 42 ° C für 20 min 10 oder 47 ° C für 10 min 14 wieder S. italica Pollen nicht lebensfähigen, aber die Effizienz dieser Behandlung wurde nicht bestimmt. Wir haben unser Protokoll nach der Hypothese, dass unter einer optimierten Temperatur und Dauer der Behandlung, Pollen aller Blumen beibehalten auf das weibliche Elternteil wird nicht lebensfähig, während Narben empfänglich bleiben entwickelt. Jedoch nach dem Vergleich und Analyse der Wirkungen von verschiedenen Temperaturen undBehandlungszeiten (Tabelle 1) haben wir festgestellt, daß die Empfindlichkeit der Wärmebehandlung variiert je nach dem an jedem Rispe gehalten Blumen, so ist es schwer, Samen aus Selbstbestäubung vollständig zu eliminieren. Wir schließen daraus, daß die Effizienz der Herstellung outcross Nachkommen ist am größten, wenn Behandlungen bei 48 ° C für 3-6 min in S. durch viridis Beitritt A10.1. Peak-Zeit der Blüte und Fremdbestäubung Wenn die Blumen Reife erreichen und sind dabei, sich zu öffnen, Staubbeutel sind gelblich-weiß in Farbe und Pollen wird so bald wie Staubbeutel exsert aus den Blüten 8 vergießen. Staubbeutel allmählich braun werden nach Pollen Schuppen wie die Blumen beginnen zu schließen. Einmal freigesetzt, die Lebensfähigkeit der Pollen, ist unbekannt. Daher ist es wichtig, den Pollen von Öffnung oder frisch geöffneten Blüten auf dem männlichen Elternteil, sobald wie möglich zu verwenden. Unter unserem Kammerbedingungen (Abbildung 1), die Mehrheit der flowers der männlichen Eltern beginnen um 10:10 Uhr öffnen und die geöffneten Blüten Pollen vergossen um 10:30 Uhr. Somit ist das wünschenswert Fenster für die Durchführung der Bestäubung von 10.30 bis 11.00 Uhr. Die Narben bleiben außerhalb der Spelzen nach Blumen in der Nähe und können Pollen empfänglich zu sein. Dies wurde zuvor beobachtet worden, und in S. bestätigt italica, dass die Narben sind offen für etwa 48 Stunden nach der Blume, die von Siles et al. 6, so ist es wichtig, Tasche Rispen folgende Wärmebehandlung und nach der Durchführung kontrolliert Kreuze. Wie oben besprochen, empfehlen wir leistungs Bestäubungen sowohl auf Tag 2 und Tag 3 nach der Entmannung. Methoden für die Bestäubung Wir verglichen die Wirksamkeit von drei Bestäubungstechniken. Wenn blühenden Blumen sind nicht einschränkend ist Rispe zu Rispe Bestäubung der effizienteste Technik und eine höhere Anzahl von Outcross Nachkommen zu erhalten. Wenn blühenden Rispen begrenzen, eine höhere Frequenz von outcross Nachkommen produziert werden, wenn der Staubbeutel-zu-Stigma-Methode verwendet wird. Wir haben Outcross Nachkommen von beiden Methoden erfolgreich erhalten. Die &quot;Bindung Rispen&quot;-Methode hat in der Überfahrt S. verwendet italica 6, aber wir fanden diese Methode, um die am wenigsten effiziente Methode sein, da das Zeitfenster für die Pollen Abstoßung der männliche Elternteil ist kurz. Darüber hinaus gibt es weniger Einfluss auf die Bestäubung und die Borsten auf S. viridis Rispen kann auch die Bewegung der Pollen auf die Narbenfläche zu behindern. Seed Ernte, Trocknung und Lagerung Nach der Ernte sollten Samen bei 30-33 ° C für 2 Tage getrocknet. Anthecium sollte für GUS-Färbung entfernt werden, falls erforderlich. Samen sollten an einem trockenen, kühlen Ort gelagert werden (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) für die kurzfristige Lagerung (weniger als zwei Jahre) oder in einer Saatgutkammer (T: 4,0- 10 ° C ± 1,0 ° C, relative Feuchtigkeit 20% ± 1%) für die langfristige Lagerung.Schlechte Lagerbedingungen können in niedrigen Raten Lebensfähigkeit 8 führen. Wir haben beobachtet, dass die Keimrate von S. viridis A10.1 etwa 5%, wenn gesät 4 Tage nach der Ernte, sondern kann auf 90-96% nach der Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%) erhöht werden für 110 Tage nach der Ernte, gefolgt von einer dreitägigen Schichtung bei -80 ° C bis Samenruhe zu brechen. Für die Schichtung bei -80 ° C, trockenen Samen in einem luftdichten Behälter (zB Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Münze in einem verschlossenen Umschlag Plastiktüte) platziert werden und für 3 Tage vor dem Pflanzen gehalten bei -80 ° C. Nach 16 Monaten Lagerung im Labor (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, relative Feuchtigkeit: 21,79% ± 1,15%), kann die Keimung Prozentsatz der noch 90-95% erhalten werden. Darüber hinaus, um die Keimruhe zu brechen, Samen können bei 30-33 ° C für 2 Tage nach der Ernte getrocknet werden, und dann bei drei-Tage-Schichtung bei -80 ° C, gefolgt von der Entfernung deranthecium vor dem Einpflanzen. Nach diesen Behandlungen können die Samenkeimung Raten von bis zu 33% erreicht werden. Vorteile, Grenzen und mögliche Änderungen Hier stellen wir die erste Standard-Protokoll für die Durchführung Kreuze in S. viridis A10.1 durch Verwendung einer Wärmebehandlung für Entmannung. Im Gegensatz zu physikalischen emasculation ist dieses Protokoll weniger invasiv und relativ einfach im Labor herzustellen. Es dauert in der Regel etwa 15 Minuten, um eine Rispe schneiden und etwa 15 Rispen können getrimmt und überquerte / Person / Tag werden. Bei durchschnittlich 3-5 Outcross Nachkommen / Rispe können unter optimierten Bedingungen gewonnen werden, können insgesamt 45-75 Outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus kann diese Technik angewandt werden, um in anderen Setaria-Arten kreuzt, wenn zusätzliche Optimierungen wahrscheinlich. Wenn Wachstumskammer der Platz begrenzt ist, können die Pflanzen im Gewächshaus oder Wachstumskammern ohne pre-dawn TREA angebaut werdentment bis der Rispe tritt, bevor sie den optimierten Bedingungen Kammer bewegt werden.

S. viridis ist eine NADP-ME-Subtyp C 4 Gras eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse (NAD-ME Subtyp), der Getreideernte Kolbenhirse und landwirtschaftlichen Versuchs Unkraut Gras 5 zusammen. Die 510 Mb Genom der Zuchtform Setaria, S. italica, wurde kürzlich sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig, S. viridis, ist in Arbeit (unveröffentlicht). S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen und fruchtbare Samenproduktion 3 zu machen. Wichtig ist, daß Methoden kürzlich sowohl transiente und stabile Transformation von S. entwickelt viridis, die die Möglichkeit zur Schaffung von transgenen Pflanzen 4 vorzusehen. Doch ein großer Engpass bei der Entwicklung genetischer Werkzeuge für S. viridis ist seine recalcitrance zu Auskreuzung. Bis heute hat kein Standardprotokoll veröffentlicht worden, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben. Genetische Kreuze in S. italica werden üblicherweise durch Entmannung durch Entfernung der Staubbeutel aus Blumen 6,7,8 oder durch Wärmebehandlung von Blüten der weiblichen Eltern 9-11 durchgeführt. Nach diesen Behandlungen, Staubbeutel oder Rispen von nicht-behandelten Blüten / männlich Eltern sanft gegen Narben frei Pollen abgerieben. In Entmannung, sind Staubbeutel mit einer feinen Pinzette sofort nach dem Blümchen öffnet und der Staubbeutel beginnt exsert entfernt, ist aber noch nicht vergossen Pollen 6-8. Unter den Herausforderungen dieser letzteren Verfahren ist die Schwierigkeit bei der Durchführung Schwächung in einem schmalen Zeitintervall zwischen dem Öffnen und Pollen Schuppen der Blume. Die Dauer der Öffnungs-und Schließ einer einzigen Blume wird in Abhängigkeit von der Beitritts-und Umweltbedingungen variieren und kann von 7 min reichen &lt;sup&gt; 6-2,5 h 12 in S. italica. Da Shedding von Pollen tritt als Antheren exsert von Blümchen, müssen Staubbeutel sorgfältig und schnell entfernt werden, und daher ist es schwierig, Verunreinigungen durch Selbstbestäubung zu vermeiden. Zusätzlich, wie Bestäubungen unmittelbar nach Kastration ausgeführt wird, ist die Anzahl von Kreuzungen, die pro Person pro Tag durchgeführt werden kann / begrenzt. Als alternative Methode kann reifen Rispen in warmen Wasser getaucht werden, um Wärme-kill Entwicklung Pollenkörner 9,10,13,14 mit dem Vorteil der Durchführung Kreuze auf einer großen Anzahl von Rispen. Die Temperatur und Dauer der Wärmebehandlung variiert jedoch stark von verschiedenen Experimenten (zB 47 ° C für 10 min 14 und 42 ° C für 20 min 10). Weiterhin keine systematischen Analysen über die Wirksamkeit von Wärme-vermittelte Entmannungen veröffentlicht worden. Somit ist ein Standard und einfaches Verfahren zur Durchführung der genetischen Kreuzungen in S. viridis würde genetische Ressource Entwicklung und Etablierung von S. stark beschleunigen viridis als Modellsystem in der Forschungsgemeinschaft. Wir berichten über die Entwicklung und Optimierung von einem Standard-Protokoll für die Durchführung genetischer Kreuze in S. viridis. Pflanzen werden unter kontrollierten Umgebungen Blütenentwicklung synchronisieren und erhöhen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens geworden. Kreuze werden mit einer transgenen S. durchgeführt viridis Zeile wie das männliche Elternteil, die das GUS-Reportergen 4 um die Identifizierung erfolgreich gesteuert genetischen Kreuzungen zu erleichtern. Die GUS-Transgen durch einen Ubiquitin-Promotor, der Reis das Zählen von F1 Samen sofort nach der Ernte und ermöglicht somit bequem qualitativen Assay, um die Effizienz der Schwächung und der Bestäubung bestimmen angetrieben. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung begleitet von Blumen, die Kennzeichnung von emascula gewesen sind eingesetztted Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variation der Dauer Eintauchen in warmes Wasser haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitdauern von 48 ° C 3-6 min etabliert. A pre-dawn Kältebehandlung wurde festgestellt, Synchron Blüte in beiden Eltern, um Fremdbestäubung zu erleichtern fördern. Wir haben auch die wichtigsten Schritte in der Protokoll-und der künftigen Anwendung dieser Methode auf andere Setaria Beitritte diskutiert.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Cat. Number</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scissors, spring</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>14126</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumostar Biology Polished</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>TD5BP-XD</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T (Fine Science Tools)</td>
			<td>14005-12</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28"</td>
			<td><a href="http://www.pjpmarketplace.com" target="_blank">http://www.pjpmarketplace.com</a></td>
			<td>361001</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715401C </td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>metro mix 360</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>10-0356-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's 15-16-17</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>07-5925-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red</td>
			<td>Staples</td>
			<td>37002</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DA-10, B0015IP380</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip </td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR scientific</td>
			<td>Model: 1166</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDW walk in plant growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>BDW 40</td>
 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

methods for performing crosses in setaria viridis, a new model system for the grasses

Setaria viridis ist eine neue Modellsystem für C 4 Gräser. Es ist eng mit der Bioenergie Futter-Vorrat Rutenhirse und der Getreideernte Kolbenhirse zusammen. Vor kurzem hat die 510 Mb Genom von Kolbenhirse, S. italica, wurde sequenziert 1,2 und eine 25-fache Abdeckung des Genoms relativ schmächtig S. viridis ist in Arbeit. S. viridis hat eine Reihe von Eigenschaften, die es ein potentiell hervorragendes Modell genetische System mit einem schnellen Generationszeit, kleine Statur, einfache Wachstumsanforderungen, fruchtbare Samenproduktion 3 und entwickelten Systeme sowohl für transiente und stabile Transformation 4 zu machen. Jedoch die Genetik von S. viridis weitgehend unerforscht, teilweise aufgrund des Fehlens von detaillierten Verfahren zum Ausführen von Kreuzungen. Bis heute hat keine Standard-Protokoll verabschiedet, die schnelle Produktion von Saatgut aus kontrolliert Kreuze erlauben. Die Protokolldrucktierte hier ist für die Durchführung genetischer Kreuze in S. optimiert viridis, Beitritt A10.1. Wir haben ein einfaches Wärmebehandlung mit warmem Wasser für Entmannung nach dem Beschneiden der Rispe zu 20-30 Röschen und Kennzeichnung von Blumen zu behalten, um Samen von neu entwickelten Blüten nach Entmannung zu eliminieren beschäftigt. Nach der Prüfung einer Reihe von Wärmebehandlungen bei permissiven Temperaturen und Variieren der Dauer des Eintauchens, haben wir eine optimale Temperatur-und Zeitbereich von 48 ° C für 3-6 min hergestellt. Durch Verwendung dieses Verfahrens kann ein Minimum von 15 Kreuzungen von einem einzigen Arbeiter pro Tag durchgeführt werden, und durchschnittlich 3-5 outcross Nachkommen pro Rispe wiederhergestellt werden können. Daher kann ein Durchschnitt von 45-75 outcross Nachkommen von einer Person an einem Tag hergestellt werden. Grundzüge der Implementierung dieser Technik wird die Entwicklung von rekombinanten Inzuchtlinie Populationen von S. erleichtern X S. viridis viridis oder S. X S. viridis italica, Kartierung Mutationen durch Groß segregant Analyse und Erstellung von höherer Ordnung Mutanten für die genetische Analyse.

In dieser Studie, die sequenziert S. verwendeten wir viridis Beitritt A10.1 als das weibliche Elternteil und einem transgenen S. viridis Leitung (auch A10.1), die das GUS-Reportergen 4 als männliche Eltern für alle Befruchtungen. Eine optimierte Wachstumsregime wurde zur Blüte zu synchronisieren, wie in Fig. 1 gezeigt. Wir haben mehrere Kombinationen von Temperatur und Zeit der Wärmebehandlung für Entmannung getestet und festgestellt, dass etwa 40-80% der an der Rispe entmannt beibehalten Blumen blühten auf dem 2. Tag, während der Rest blühte am 3. Tag (Abbildung 2). Wenn jedoch die Wärmebehandlung zu stark, zum Beispiel 49 ° C für 4 min, sehr wenige oder keine Blumen blühten am 2. Tag. Kreuzbestäubung wurde am 2. oder 3. Tag nach der Kastration, die abhängig von der Spitzenzeit von der Blüte der männlichen Eltern durchgeführt. Es war Beobachtered, dass die jungen Blumen weiter nach Entmannung entwickeln, gereift und selbstbestäubten 3-6 Tage nach kontrollierter Befruchtungen. Nach 7-10 Tage nach der Bestäubung sind Blumen, die in der Farbe weiß sind auf der Rispe sichtbar. Diese weißen Blüten werden entweder aufgrund von Hitzeschäden oder schlechte Bestäubung unbefruchtet. Zur gleichen Zeit, die Blumen, die erfolgreich bestäubt haben, beginnen zu dunklen Samen tragen, und starten bewegend nach 14 Tagen. Die dunklen Samen mit roten Markierungen auf dem 14. Tag nach der Bestäubung geerntet klar aus den Samen ohne rote Markierungen, die noch grün waren und nicht zerbrechen unterschieden werden. Wenn die Ernte verzögert, die anthecium der Samen mit und ohne rote Markierungen sowohl dunkel werden, ist es schwierig, schnell die Samen mit roten Markierungen in geerntet Pools zu unterscheiden. Zur Optimierung der Kreuzung Protokolls mehrere Wärmebehandlungsversuche wurden durchgeführt, wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Durchschnitt0-10 Samen / Rispe wurden von verschiedenen Wärmebehandlungsversuche gewonnen. Nach der Ernte wurden die Samen bei 30 º C für 2 Tage in einer Samentrockner, gefolgt von der Entfernung des anthecium Verwendung eines anthecium Entferner getrocknet. Nachdem die anthecium entfernt war, wurden mutmaßliche F1-Samen mit GUS-Färbelösung gefärbt und Outcross Nachkommen blau gefärbt Farbe in 1-2 h (2F). Basierend auf diesen Ergebnissen empfehlen wir eine Wärmebehandlung von 48 ° C für 3-6 min. Darüber hinaus empfehlen wir, dass Kreuze auf beiden Tag 2 und Tag 3 folgenden Entmannung durchgeführt werden. Um die Wirksamkeit dieser Technik in Ausführen von Kreuzungen mit anderen Setaria Beitritt oder Arten zu untersuchen, kreuzt zwischen S. viridis A10.1 und acht verschiedenen S. viridis Beitritte und ein S. pumila Beitritt durchgeführt. Obwohl Tage bis zur Blüte variiert unter den Beitritten wir festgestellt, dass die Blumen von allen acht S. viridis Beitritte und ein S.pumila Beitritt Öffnung zwischen 10.00 Uhr bis 11.00 Uhr beginnen mit einem Spitzenöffnungszeit auf 10.20 bis 11.00 Uhr nach der Morgendämmerung Kältebehandlung. Dies zeigt, dass die Morgendämmerung Kältebehandlung kann auf vielfältige Setaria Beitritte angewendet werden. Eine Wärmebehandlung von 48 ° C für 5-6 min wurde verwendet, um S. entmannen viridis A10.1, die als das weibliche Elternteil für alle durchgeführt Kreuze verwendet wurde. Wir erholten uns von einem bis zu 12 Samen aus Kreuzungen zwischen A10.1 und drei der vielfältigen S. viridis Beitritte und sechs Samen aus einer Kreuzung zwischen S. viridis A10.1 und ein Einzel S. pumila Beitritt. Doch zu diesem Zeitpunkt haben wir nicht festgestellt, ob diese Samen resultierte aus einer erfolgreichen testcross oder waren das Ergebnis von Selbstkontamination. Unabhängig deuten diese vorläufigen Ergebnisse, dass die für S. verwendeten Wachstumsbedingungen viridis A10.1 kann verwendet werden, um Kreuzungen mit verschiedenen S. erzeugen viridis Beitritte und möglicherweise auch andere Arten von Setaria. <tablE border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Temp Wärmebehandlung (° C) </td><td> Wärmebehandlungszeit (min) </td><td> # Kreuze </td><td> Rel. # Von Blumen nach trim </td><td> Tag der Bestäubung (Tag nach emasc) </td><td> Rel. # Samen (rot) / Rispe (Mittelwert) </td><td> Rel. Gus% (+) / Samen (rot) </td><td> Rel. # Hyb Samen (Gus +) </td><td> Min # Hyb Samen </td><td> Max # hyb Samen </td></tr><tr><td> 47 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 27 </td><td> 2. Tag </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 48 </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 36 </td><td> 2. Tag </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 4</td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 3. Tag </td><td> 10 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 7 </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2. Tag </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 2. Tag </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 24 </td><td> 2. Tag </td><td> 3 </td><td> 33 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 25 </td><td> 3. Tag </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> N / A </td><td> N /A </td></tr><tr><td> 49 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 23 </td><td> 2. Tag </td><td> 5 </td><td> 25 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 7 </td><td> 26 </td><td> 2. Tag </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 22 </td><td> 2. Tag </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 25 </td><td> 2. Tag </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Optimierung der Wärmebehandlung zur Schwächung. Ergebnisse der Veränderung sowohl der Temperatur und Zeit der Wärmebehandlung. Befruchtungen wurden ein (2. Tag) oder zwei Tage (3. Tag) durchgeführt folgenden Entmannung und erfolgreiche Auskreuzungen smit GUS-Färbung entkernt <img alt="Figur 1" fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Optimierte Wachstumskammer Bedingungen mit einem pre-dawn Kältebehandlung. Temperatur und Fristen für optimales Wachstum und Synchronität der Blumenproduktion gezeigt. Grüne und rote Pfeile zeigen optimale Fenster für die Durchführung Kreuze und Entmannung auf. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" /> 2. Rispe Vorbereitung für die Überfahrt und die GUS-Färbung von Outcross Nachkommen. (A) Eine Rispe von Setaria viridis A10.1 vor dem Trimmen, zeigt etwa 1/10 der Blumen eröffnet. Die vier Abschnitte und Direktionalität in Fortschreiten der Blüte an der Rispe gezeigt. <strong&gt; (B) A getrimmt Rispe vor mit Borsten behalten Entmannung. (C) Ein entmannt Rispe nach der Entfernung der Borsten. (D) Ein entmannt Rispe am Tag 2 nach der Entmannung, zeigt Blumen, die blühen werden (Bild, um 10:30 genommen AM). (E) Eine Rispe des männlichen Elternteils (Setaria viridis transgenen A10.1 Linie mit einem β-Glucuronidase (GUS)-Reporter-Gen), die nach dem pre-dawn-Behandlung (Bild, um 10:30 Uhr genommen) blühen wird. A bis E, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Vermutliche outcross Nachkommen nach GUS-Färbung für 2 Stunden, gefolgt von distaining in 70% (v / v) Ethanol. Die beiden Samen von rechts sind negative und positive Kontrollen. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" /> 3. Flussdiagramm des Protokolls eine schematische Darstellung des michtige Schritte bei der Durchführung beteiligt S. viridis quert.

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Wir haben eine Methodik für die Durchführung Kreuze in Setaria viridis (S. viridis) entwickelt. Das Verfahren beinhaltet das Beschneiden der Rispe vor einer Heißwasserbehandlung, um lebensfähige Pollen zu töten. Kreuze werden nach einem gut kontrollierten Wachstum Regime durchgeführt und in der Regel bei der Gewinnung von 1 bis 7 Quer bestäubt-Saatgut / s pro Rispe führen.

Verfahren für Kreuze in<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Ein New Model System für die Gräser

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

methods-for-performing-crosses-setaria-viridis-new-model-system-for

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

21.5K Aufrufe.  Donald Danforth Plant Science Center.  Wir haben eine Methodik für die Durchführung Kreuze in Setaria viridis (S. viridis) entwickelt. Das Verfahren beinhaltet das Beschneiden der Rispe vor einer Heißwasserbehandlung, um lebensfähige Pollen zu töten. Kreuze werden nach einem gut kontrollierten Wachstum Regime durchgeführt und in der Regel bei der Gewinnung von 1 bis 7 Quer bestäubt-Saatgut / s pro Rispe führen. 

Serie: Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Forschung

Umwelt

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Eine neue Anwendung der Electrical Penetration Graph (EPG) zur Erfassung und Messung elektrischer Signale in Phloem Siebelemente

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Methoden der Boden Resampling zur Überwachung von Veränderungen in der chemischen Konzentrationen von Waldböden

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Messung und Mapping-Muster von Erosion und Ablagerung im Zusammenhang mit Boden-Karbonat-Konzentrationen unter Landbewirtschaftung

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

Methodik zur Entwicklung von Sterbetafeln für festsitzende Insekten im Feld mit der Mottenschildläuse Tabak Tabaci, in Baumwolle als ein Modellsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

Techniken für die Untersuchung von der Anatomie des Sehsystems Ant

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Entwicklung neuer Methoden zur Quantifizierung der Fisch-Dichte mit Unterwasser-Stereo-Video-Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Eine neue Methode für die Analyse von Pentosan in Jute Biomasse und deren Umwandlung in Zucker Monomere mit sauren ionischen Flüssigkeit

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Eine neue Portable In-vitro- Exposition Kassette für Aerosol-Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...