Das Wiederauftreten von Tumoren ist ein sehr prominentes Problem der Resektion. In dieser Studie versuchen wir, mehr über das Tumorwachstum in einer regenerativen Umgebung zu verstehen. Es wurde gezeigt, dass Tumor-Organoide den Tumor des Patienten histologisch und genetisch rekapitulieren, obwohl In-vivo-Modelle rar und instabil sind.
Wir haben erfolgreich das vom Patienten stammende Organoid in die Leber der Maus transplantiert. Wir haben dies an zwei Beispielfällen gezeigt. Die histologischen, immunhistochemischen Färbungen zeigen, dass die Organoide und das Xenotransplantat dem ursprünglichen Tumor des Patienten ähneln.
Die Entwicklung von Organoiden aus dem ursprünglichen Tumor ähnelt einem genaueren Modell des Patiententumors im Vergleich zu anderen Möglichkeiten wie 2D-Zellkulturen. Die Einbettung dieses Modells in die komplexe Umgebung der Leberregeneration wird dazu beitragen, mehr über die bestehenden Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und regenerativer Umgebung zu verstehen. Wir hoffen, dass wir in unserem Fachgebiet Erkenntnisse über das Verständnis des Rezidivs von HCC bei der Leberresektion gewinnen können.
Daher wollen wir mit diesem Modell die Grundlage für zukünftige Forschungsprojekte schaffen. Schneiden Sie zunächst mit einem Skalpell und einer Pinzette das entnommene Leberkrebsgewebe in kleine Fragmente von ein bis zwei Quadratmillimetern. Übertragen Sie die Gewebestücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Dissoziationspuffer.
Stellen Sie das Rohr auf eine Rotationsvorrichtung bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Zellmischung über ein 100-Mikrometer-Zellsieb geleitet, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Verwenden Sie einen Kolben oder eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die Gewebefragmente durch den Filter zu schlagen.
Geben Sie nun fünf Milliliter ergänztes erweitertes DMEM über den Filter, um ihn zu waschen. Übertragen Sie das Filtrat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Aspirieren des Überstands resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen.
Die Suspension erneut fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugieren. Dann resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS, bevor Sie zählen. Entfernen Sie vor der Zellbeschichtung den Überstand aus der Zentrifugenzellensuspension.
Mit etwa einem Milliliter Basalmembranmatrix in das Röhrchen resuspendieren und auf Eis legen. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in die Vertiefungen einer vorgewärmten Sechs-Well-Platte, um Tropfen zu erzeugen. Nachdem Sie zwei bis drei Minuten gewartet haben, stellen Sie die Platte fünf Minuten lang in eine umgekehrte Position in einen Durchflussschrank.
Dann übertrage die Platte zum Erstarren in einen Inkubator. Zum Schluss geben Sie zwei Milliliter Organoid-Nährmedium in jede Vertiefung. Die vom Patienten stammende Organoidlinie wies morphologische Merkmale des ursprünglichen Patiententumors auf.
Platzieren Sie zunächst eine betäubte Maus in Rückenlage, wobei die Gliedmaßen mit Klebeband festgeklebt sind. Verwenden Sie eine Pinzette und eine mikrochirurgische Schere, um einen Schnitt an der erschöpften Operationsstelle entlang der linearen Alba vom Unterbauch bis zum Xiphoidknorpel zu machen. Führen Sie die Retraktoren in den Schnitt ein und passen Sie die Zugrichtung an, um eine optimale Freilegung des Oberbauchs zu erzielen.
Legen Sie eine saubere, mit Kochsalzlösung angefeuchtete Serviette direkt neben die Schnittstelle. Äußere nun den Dünndarm und den Blinddarm auf der nassen Serviette. Legen Sie den rechten oberen Lappen frei, bis eine Injektion möglich ist.
Ziehen Sie die Organoidmischung in eine Spülung, die mit Hamilton gekennzeichnet ist. Injizieren Sie die Suspension gleichmäßig bis zur Markierung, ohne die Nadel zu bewegen. Üben Sie mit einem Wattestäbchen Druck auf die Injektionsstelle aus.
Überprüfen Sie dann den Bauch auf einen Bruch oder Rückfluss des Lappens. Spülen Sie den Bauch mit 0,5 Millilitern steriler Kochsalzlösung ab. Legen Sie eine Laufnaht mit einer resorbierbaren Naht an, um den Bauch zu verschließen.
Der Tumor, der sich in der Maus entwickelte, ähnelte sowohl den vom Patienten stammenden Organoiden als auch dem ursprünglichen Tumor des Patienten. Um mit einer kleineren Leberresektion zu beginnen, führen Sie eine Laparotomie an einer anästhesierten Maus in Rückenlage durch. Schieben Sie mit feuchten Wattestäbchen den Innenlappen nach vorne, um mehr Platz im Operationsfeld zu schaffen.
Drehen Sie den linken lateralen Leberlappen nach kranial, um den Schwanzlappen und das Band freizulegen. Das Band komplett durchtrennen. Setzen Sie dann eine Ligatur unterhalb des lateralen Leberlappens ein.
Drehen Sie nun den linken lateralen Leberlappen kaudal um und führen Sie das linke freie Ende der Ligatur um die linke Spitze des linken lateralen Leberlappens. Führe das rechte freie Ende um die andere Spitze herum. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Lappen zu ziehen, und stellen Sie sicher, dass die Ligatur mittig positioniert ist.
Dann binde einen doppelten halben Knoten. Befestigen Sie diesen Knoten mit einem anderen Knoten zur zweiten Hälfte, der in die andere Richtung gebunden wird, ohne ihn vollständig festzuziehen. Wenn die Ligatur richtig positioniert ist, halten Sie das kraniale freie Ende der Ligatur mit einer stumpfen Pinzette fest und ziehen Sie mit einer weiteren Pinzette am kaudalen Ende.
Befestigen Sie den Knoten mit einem zweiten Knoten, der in die entgegengesetzte Richtung gebunden wird. Schneiden Sie nahe an der Ligatur, ohne sie zu schneiden, um die Leber zu resezieren. Nach der geringfügigen Resektion des linken lateralen Leberlappens wird das falciforme Band durchtrennt.
Drehen Sie den Lappen nach vorne, führen Sie dann eine Ligatur darunter ein und drehen Sie ihn kaudal. Schlingen Sie nun die freien Enden der Ligatur um das Labial. Sobald die Ligatur richtig platziert ist, binden Sie langsam einen doppelten Halbknoten.
Ziehe einen zweiten halben Knoten in die entgegengesetzte Richtung vollständig fest, dann füge einen dritten halben Knoten in die entgegengesetzte Richtung hinzu. Schneiden Sie den Lappen erneut und spülen Sie dann den Bauch mit steriler Kochsalzlösung. Setzen Sie den Darm wieder an seinen anatomischen Platz.
Um den Bauch zu schließen, greifen Sie mit einer Pinzette die Haut und das Bauchfell. Platzieren Sie einen Stich mit einer resorbierbaren Naht am oberen Ende der Schnittlinie. Führen Sie einen zweiten Stich auf der anderen Seite des Schnitts aus, der auf der Hautseite austritt.
Den Knoten fest binden und das freie Ende ohne Nadel kurz lassen. Lassen Sie das Nadelende der Masche lang. Beenden Sie die laufende Naht mit einem Knoten am unteren Ende des Schnitts.
Reinige den Bauch von jeglichem restlichen Blut. Der relative Beitrag der Leberlappen ist zwischen den verschiedenen Mäusen desselben Stammes vergleichbar. Das mittlere Gewicht des rechten unteren Lappens stieg nach einer kleinen Resektion auf 0,82 % des Gesamtkörpergewichts an.
Größere Resektionen führten zu einer Zunahme des gesamten Körpergewichts um 0,99 %. Eine größere Resektion des rechten oberen Lappens führte zu einer deutlichen Gewichtszunahme im Vergleich zum rechten unteren Lappen.
