Diese Arbeit wurde vom Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund des University of Michigan Comprehensive Cancer Center und teilweise von NIH Grant CA82529 und der Gillson Longenbaugh Foundation unterstützt.

1. ALDEFLUOR Färbung
<ol><li>Zellprobenpräparation: Bereiten Sie die einzelzellige Suspension von Tumorzellen vor, entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumorproben. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer an.</li>
	<li>Etikettieren Sie vier 12 mm x 75 mm Polystyrol-Reagenzgläser als Steuerröhrchen wie folgt: #1: Unstained, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB und #4: 7AAD.</li>
	<li>Für diese Steuerröhrchen 1ml Zellsuspension in #1 und #4, aber 2 ml in Tube #2. Fügen Sie 5 l DEAB (ALDH-Hemmer) in die #3 und auf Eis zu halten. Dann 10 l aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat in die #2 der Röhre geben, mischen und sofort 1 ml des Gemischs auf #3 übertragen.</li>
	<li>Zur gleichen Zeit fügen Sie den übrigen Zellen (Probenröhren) auch bei 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer ein aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat pro Million Zellen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie sowohl die 4 Steuerröhrchen als auch die Probenröhrchen 30 min im 37 °C Wasserbad.</li>
	<li>Nach der Inkubation fügen Sie dem Probenröhrchen 5 l 7AAD #4 und 1 l 7AAD 1 x 106 Zellen in das Probenröhrchen. 10 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie alle Rohre für 5 min bei 250 x g und entfernen Sie Überstand.</li>
	<li>Resuspend-Zellen im ALDEFLUOR-Assaypuffer.</li>
	<li>Führen Sie eine Flusszytometrie-basierte Sortierung durch.</li>
	<li>Stellen Sie die Sortiertore mit ALDEFLUOR-gefärbten Zellen, die mit DEAB behandelt werden, als Negativkontrolle und der Propidiumjodid (PI) 7AAD- gebeizten Zellen zur Lebensfähigkeitskontrolle. Basierend auf diesen Steuerungen wurde ein Gate eingerichtet, umdie ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-, D5- und SCC7-Zellen zu unterscheiden. Diese Tore werden dann verwendet, um alle oben für die ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-D5- und SCC7-Zellen vorbereiteten Probenzellen zu sortieren.</li>
</ol>2. Präparation von KrebsStammzell-Lysat-Puls Dendritic Cell (CSC-TPDC) Impfstoff
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse (syngene B6 bzw. C3H) mitCO2 und isolieren Sie Oberschenkelknochen und Tibiaknochen.</li>
	<li>Legen Sie die Knochen in 75% Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Knochen mit HBSS.</li>
	<li>Kopf abschneiden und mit einer 21 G Nadel und einer 10 ml Spritze Zellen in eine Schale schieben.</li>
	<li>Die Zellen mit der Spritze ansaugen und blasen, um die einzellige Suspension herzustellen.</li>
	<li>Nach zentrifugieren in 1.500 U/min für 5 min, entsorgen Sie den Überstand. Dann 5 ml RBC Lysepuffer hinzufügen, um den RBC für 1 min im 37 °C Wasserbad zu lysieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml in einem vollständigen Medium (CM) an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Kultur die Zellen und kompensieren CM plus IL-4 und GM-CSF 3 Tage später.</li>
	<li>Am5. Tag die unreifen dendritischen Zellen (DCs) ernten und das DC-Isolationsmedium mit 4,2 ml Lösung C plus 1 ml OptiPrep Dichtegradientenmedium vorbereiten.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellpellets in 5 ml CM auf. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf das Isolationsmedium ein. Zentrifuge bei 2.000 U/min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sammeln Sie die DCs zwischen cmCM und Isolationsmedium. Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml im Kulturmedium an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie Tumorlysate vor, indem SieALDH-hoch- oder unsortierte D5- oder SCC7-Zellen im Kulturmedium aussetzen und viermal schnellen Frost-Tau-Expositionen ausgesetzt werden, gefolgt von Spin bei 100 x g für 5 min, um den Membrananteil der Lysate zu sammeln.</li>
	<li>Zur Herstellung von CSC-TPDC, Puls DCs mit dem Lysat von autologen ALDHhohe Zellen. Zur Vorbereitung von H-TPDC werden Puls-DCs mit unsortiertem heterogenen Tumorzelllysat. Das Verhältnis von Gleichstrom zu Tumorzelllysat ist das gleiche.</li>
</ol>3. Impfung und Bewertung der Wirksamkeit
<ol><li>Impfen Normal-B6-Mäuse jeweils mit 2.500 D5 CSC-TPDC oder D5 H-TPDC Tumorzellen subkutan (s.c.). Impfen Normal C3H Tiere .c. mit 5.000 SCC7 CSC-TPDC oder SCC7 H-TPDC Tumorzellen, bzw.</li>
	<li>Fordern Sie nach der Impfung die B6-Mäuse mit den heterogenen D5-Tumorzellen an, d.h. Euthanisieren Sie die Mäuse 2 20 Tage später mitCO. Die Lunge ernten und Lungenmetastasen aufzählen.</li>
	<li>Im SCC7-Modell fordern Sie die C3H-Mäuse mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c auf der gegenüberliegenden Seite des DC-Impfstoffs heraus. Überwachen Sie die Tumorgröße.</li>
	<li>Am Ende der Experimente euthanisieren die B6- und C3H-Mäuse mit CO2. An Tag 34 nach dem ersten Impfstoff, einschläfern Mäuse mitCO2, und zur gleichen Zeit sammeln die Milz jeder Gruppe mit einem aseptischen Verfahren.</li>
	<li>Aktivieren Sie Milz-T- und/oder B-Zellen mit immobilisierten Anti-CD3 plus Anti-CD28 mAbs in CM, die hrIL-2 oder LPS plus Anti-CD40 (FGK45) mAb-Aszites enthalten.</li>
	<li>Sammeln Sie nach der Aktivierung Überstand und verwenden Sie den ELISA-Test.</li>
	<li>Für ELISA-Assay, Beschichtungsplatten mit Antikörpern für IFN, GM-CSF und IgG bei 4 °C O/N.</li>
	<li>Nach dem Auftragen des Sperrpuffers Proben und Standards hinzufügen und bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte und fügen Sie HRP-Erkennungsantikörper und TMB-Substrat für die Inkubation hinzu.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption eines ELISA-Plattenlesers bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Beendigung der Reaktion.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1/p53-mediated+mouse+mammary+tumors.">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li><li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells.">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li><li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li><li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice:+an+opposite+effect+of+chemotherapy.">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li><li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer.">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li><li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines.">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li><li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine:+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy.">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li><li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity.">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li><li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts.">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li><li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer.">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li><li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li></ol>

STEMCELL Technologies hat Open Access-Publikationsgebühren unterstützt.

Die immungeschwächten Wirte, wie Z. CCID-Mäuse, schließen immunologische Beurteilungen von CSCs aus, da es an adaptiver Immunität innerhalb der Hosts fehlt. In dieser Studie haben wir die Immunogenität von CSCs bei immunkompetenten Wirten untersucht, die Patienteneinstellungen genauer nachahmen könnten. Angereicherte CSCs sind immunogen und könnten eine wirksamere Tumorschutzimmunität hervorrufen, wenn ihre Lysate als Impfstoff auf DCs geladen werden, verglichen mit nicht ausgewählten Tumorzelllysat-pulsierten DCs.  Mechanistisch wurde der Schutz durch selektive Induktion von CSC-reaktiven Antikörpern und T-Zellen8 sowie durch die Herstellung von Typ-1-Zytokin, z. B. IFN und GM-CSF, gewährt.
Die meisten der aktuellen Immuntherapien, einschließlich dendritischer zellbasierter Impfstoffe und der Adoptiv-T-Zelltransfer, sind auf tumordifferenzierte Antigene ausgerichtet. CSCs, die diese differenzierten Antigene möglicherweise nicht ausdrücken, können daher diesen immunologischen Targetings entgehen. Im Gegensatz dazu kann ein CSC-Impfstoff, der speziell auf Krebsstammzellen abzielt, diese spezielle Population der Krebszellen zerstören und so die therapeutische Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern, indem er Tumorrückfälle und Metastasen verhindert.
Sowohl in kultivierten Tumorzellen als auch in frisch geernteten Tumoren identifizierten wir die CSC-angereicherte Population durch Durchflusszytometrie auf Basis einer hohen Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität. SolcheALDH-Hochzellen könnten durch Durchflusssortierung isoliert werden, um als Antigenquelle verwendet zu werden, um DC zu pulsieren, um CSC-TPDCs zu erzeugen. VergleichmitALDH-Hochzellen, die aus kultivierten Tumorzellen im Vergleich zu frisch geernteten Tumoren isoliert wurden, zeigte kein signifikanter Unterschied in der Termität der Induktion der Anti-CSC-Immunität8. Diese Ergebnisse zeigten das Potenzial, CSCs zu verwenden, die entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumoren für die klinische Anwendung isoliert sind.
Um klinisch relevant zu sein, muss ein Impfstoff in einem therapeutischen Umfeld untersucht werden. Diese Experimente werden nun in unserem Labor durchgeführt.

Krebsstammzellen sind relativ resistent gegen konventionelle Chemo- und Strahlentherapie1,2. Auf der anderen Seite könnte diese Population von Zellen die Zellen sein, die für den Rückfall und das Fortschreiten von Krebs nach traditionellen Krebstherapien verantwortlich sind1-4. Aufgrund der fehlenden Expression differenzierter Tumorantigene auf Krebsstammzellen können Krebsstammzellen aktuellen immunologischen Therapien bei Krebs entfliehen, die meist darauf ausgelegt sind, die Antigene auf die differenzierten Tumorzellen zu zielen. Daher kann die Entwicklung neuer Strategien, die speziell auf die Krebsstammzellen abzielen und diese zerstören, Versprechen halten, die therapeutische Wirksamkeit der aktuellen Krebsbehandlung zu erhöhen. Zu diesem Zweck isolierten wir Krebsstammzellen (CSC) angereicherte Populationen aus zwei Tiertumoren (Melanom D5 und Plattenepithelkarzinom SCC7) und verwendeten sie als Antigenquelle, um Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, DC) zur Vorbereitung des CSC-TPDC-Impfstoffs zu pulsieren. Anschließend werteten wir die durch den CSC-TPDC-Impfstoff induzierte Antitumorimmunität bei den syngenischen immunkompetenten Wirten, B6-Mäusen bzw. C3H-Mäusen. Die CSC-TPDC-induzierte Antitumor-Wirksamkeit wurde mit dem traditionellen DC-Impfstoff verglichen, der mit Lysat aus unsortierten heterogenen Tumorzellen (H-TPDC) gepulst wurde, der zuvor von unserer Gruppe5,6sowie von anderen Forschern7 sowohl in präklinischen Studien als auch in klinischen Studien verwendet wurde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">ALDHEFLOUR KIT</td>
			<td style="width:399px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:219px;">1700</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine IL-4</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">214-14</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Murine GM-CSF</td>
			<td style="width:399px;">Pepro Tech</td>
			<td style="width:219px;">315-03</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse IFN-&#611; ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555138</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Mouse GM-CSF ELISA KIT</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555167</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td style="width:399px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D1556</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">BD OptEIA TMB Substrated Reagent Set</td>
			<td style="width:399px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:219px;">555214</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;"></td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Equipment</td>
			<td style="width:399px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">BD FACS Aria Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>336834</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:405px;">Kcjunior</td>
			<td style="width:399px;">Bio-Tek Instruments</td>
			<td style="width:219px;">176058</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a novel dendritic-cell vaccine using melanoma and squamous cancer stem cells

Wir identifizierten Krebsstammzell(CSC)-angereicherte Populationen von murinen Melanom D5 syngenen bis C57BL/6 Mäuse n. Chr. und dem Plattenepithelkarzinom SCC7 syngeneic zu C3H-Mäusen mit ALDEFLUOR/ALDH als Marker, und testeten ihre Immunogenität mit dem Zelllysat als Quelle von Antigenen, um dendritische Zellen (DCs) pulsieren zu lassen. DCs, die mitALDH-hohen CSC-Lysaten gepulst wurden, induzierten eine signifikant höhere schützende Antitumorimmunität als DCs, die mit den Lysaten unsortierter ganzer Tumorzelllysate in beiden Modellen und in einer Lungenmetastasierung und einer s.c gepulst wurden. Tumorwachstumseinstellung. Dieses Phänomen war auf CSC-Impfstoff-induzierte humorale sowie zelluläre Anti-CSC-Antworten zurückzuführen. Insbesondere Splenozyten, die vom Host isoliert wurden, der DemCSC-DC-Impfstoff ausgesetzt war, produzierten eine signifikant höhere Menge an IFN und GM-CSF als Splenozyten, die vom Wirt isoliert wurden, der einem unsortierten Tumorzelllysat-Geflossen-DC-Impfstoff unterzogen wurde. Diese Ergebnisse unterstützen die Bemühungen, einen autologen Therapeutischen Impfstoff auf CSC-Basis für den klinischen Einsatz in einem adjuvanten Umfeld zu entwickeln.

ALDEFLUOR/ALDH wurde als Einzelmarker verwendet, um Stammzellen in mehreren Malignitäten8-11zu isolieren. Wir identifizierten Krebsstammzell-angereicherte Populationen in zwei Tumormodellen D5 und SCC7, indem wir ALDEFLUOR als Marker verwendet. Wir haben ALDEFLUOR+ Zellen bei dem murinen Melanom B16-D5 und Demkmittelzellkrebs SCC7 nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass ALDEFLUOR+-Zellen etwa 0,5 % bzw. 5,2 % zu kultivierten D5- bzw. SCC7-Tumorzelllinien beitragen (Abbildung 1). Frisch geerntete Tumorzellen aus etablierten Tumoren wurden analysiert, um die Existenz von ALDEFLUOR+-Zellen zu bestätigen. Wie auch in Abbildung 1dargestellt, gab es 2,5% bzw. 4,2% der ALDEFLUOR+-Zellen aus in vivo etablierten D5- und SCC7-Tumoren. Die Tumorigenität und die Selbsterneuerungskapazität dieser sortierten D5- und SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH-Hochpopulationen wurden beim syngenischen immunkompetenten Wirt, den C57BL/6 und C3H-Mäusen bzw.8,untersucht.
Wir haben heterogenes unsortiertes Tumorzelllysat zu Puls-DCs (H-TPDC) sowohl in Tierstudien als auch in klinischen Studien5,6verwendet. Um die Immunogenität von CSCs zu untersuchen, isolierten wirALDH-hoch CSC und gepulste Gleichstrom mit dem Lysat der CSCs zu generiertem CSC-TPDC (Abbildung 2) und verwendeten H-TPDC als konventionelle Krebsimpfstoffkontrolle, um zu testen, ob CSC-TPDC eine positive Wirkung bei der Verhinderung von Tumorwachstum hat.
Wir haben die Immunogenität von CSCs untersucht, indem wir die durch CSC-TPDC induzierte schutzbeschützende Antitumorimmunität untersucht haben. Im D5-Modell wurden naive immunkompetente Mäuse s.c mit CSC-TPDC oder H-TPDC geimpft (bei gleichem Lysat: DC-Verhältnis). Kontrollgruppen erhielten Saline (PBS). Eine Woche nach dem letzten Impfstoff wurden die Mäuse mit unsortierten D5-Tumorzellen intravenös herausgefordert (i.v.), und die Lunge wurde 3 Wochen später geerntet, um Lungenmetastasen aufzuzählen. Wie in Tabelle 1dargestellt, entwickelten Mäuse, die mit dem H-TPDC behandelt wurden, im Vergleich zur PBS-Gruppe weniger Lungenmetastasen. Wichtig ist, dass Mäuse, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, in beiden durchgeführten Experimenten deutlich weniger Lungenmetastasen hatten als die H-TPDC-Impfstoffgruppe. Im SCC7-Modell wurden normale C3H-Tiere s.c mit SCC7 CSC-TPDC bzw. H-TPDC auf der rechten Flanke geimpft, gefolgt von einer Herausforderung mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c in die linke Flanke. Im Vergleich zur PBS-Gruppe induzierte H-TPDC eine bescheidene Anti-Tumor-Immunität gegen Tumorwachstum. Allerdings gab es eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums bei Mäusen, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe und der H-TPDC-Gruppe (p<0.05, Abbildung 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CSCs als effektivere Antigenquelle verwendet werden könnten, um DCs zu laden als herkömmliche unsortierte Tumorzellen bei der Induktion einer schützenden Immunität gegen die Herausforderung von Tumorzellen.
Um die Mechanismen, die der beobachteten CSC-induzierten Schutzantitumor-Immunität zugrunde liegen, weiter zu verstehen, haben wir die Milz von den Tieren geerntet, die am Ende der Experimente DC-Impfungen unterzogen wurden. Die Milzzellen wurden dann durch Anti-CD3/CD28/IL-2 oder Anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 aktiviert. Dann wurden die Kulturüberstände gesammelt, um den Ausdruck von Zytokinen und Antikörpern zu erkennen.  Deutlich höhere Produktionen von IFN und GM-CSF durch die Milzzellen der mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tiere (Abbildung 4) gab es. Darüber hinaus gab es eine signifikant (p<0,05) höhere IgG-Produktion durch LPS/Anti-CD40 aktivierte Milzzellen, die von den mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tieren gesammelt wurden, verglichen mit D5 H-TPDC oder SCC7 H-TPDC. Es wurde festgestellt, dass diese Antikörper an D5 bzw. SCC7 CSCs binden, und eine solche Bindung könnte in Gegenwart von Komplement8zur CSC-Lyse führen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Abbildung 1. ALDHFLUOR+/ALDHhohe Populationen wurden sowohl bei kultivierten als auch bei neu geernteten frisch geernteten murinen D5-Melanomen und SCC7-Plattenepitheltumoren nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurden Tumorzellen verwendet, die mit 50 mmol/L DEAB, einem spezifischen ALDH-Hemmer, behandelt wurden.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Abbildung 2. Generierung von dendritischen zellbasierten Krebsstammzellen-Impfstoffen. Zur Herstellung von CSC-TPDC und H-TPDC wurden von Knochenmark abgeleitete dendritische Zellen mitALDH-hoch- bzw. unsortierten Tumorzelllysaten gepulst.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Abbildung 3. CSC-Lysat-gepulster DC-Impfstoff (CSC-TPDC) könnte eine wirksamere Schutz-Antitumor-Immunität in der s.c induzieren. SCC7 Tumormodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Abbildung 4. Stärkere systemische zelluläre Reaktionen bei immunkompetenten Wirten, die mit CSC-TPDC geimpftwurden.  Splenozyten wurden von den Tieren geerntet, die der H-TPDC- oder CSC-TPDC-Impfung unterzogen wurden, und wurden wie angegeben aktiviert. Die Kulturüberstandmittel wurden dann zur Zytokin-Erkennung mit ELISA gesammelt.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells at JoVE.com

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Bewertet in syngeneimmunen immunkompetenten Wirten zeigte der Krebsstammzell-Impfstoff (CSC) eine signifikant höhere Antitumorimmunität als herkömmliche DC-Impfstoffe, die mit heterogenen Massentumorzellen gepulst wurden.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.2K Aufrufe.  University of Michigan. Bewertet in syngeneimmunen immunkompetenten Wirten zeigte der Krebsstammzell-Impfstoff (CSC) eine signifikant höhere Antitumorimmunität als herkömmliche DC-Impfstoffe, die mit heterogenen Massentumorzellen gepulst wurden.

Serie: Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Massenspektrometrische Analyse Glycosphingolipid Antigene

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem cells are responsible for ensuring tissue homeostasis and repair throughout life, it is reasonable to hypothesize that the stem cell population is critical for preserving genomic integrity of tissues. Therefore, significant interest has arisen in assessing the impact of endogenous and environmental factors on genomic integrity in stem cells and their progeny, aiming to understand the etiology of stem-cell based diseases.
LacI transgenic mice carry a recoverable &#955;&#160;phage vector encoding the LacI reporter system, in which the LacI gene serves as the mutation reporter. The result of a mutated LacI gene is the production of &#946;-galactosidase that cleaves a chromogenic substrate, turning it blue. The LacI reporter system is carried in all cells, including stem/progenitor cells and can easily be recovered and used to subsequently infect E. coli. After incubating infected E. coli on agarose that contains the correct substrate, plaques can be scored; blue plaques indicate a mutant LacI gene, while clear plaques harbor wild-type. The frequency of blue (among clear) plaques indicates the mutant frequency in the original cell population the DNA was extracted from. Sequencing the mutant LacI gene will show the location of the mutations in the gene and the type of mutation.
The LacI transgenic mouse model is well-established as an in vivo mutagenesis assay. Moreover, the mice and the reagents for the assay are commercially available. Here we describe in detail how this model can be adapted to measure the frequency of spontaneously occurring DNA mutants in stem cell-enriched Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK) cells and other subpopulations of the hematopoietic system.

Here we describe an in vivo mutagenesis assay for small numbers of purified hematopoietic cells using the LacI transgenic mouse model.&#160;The LacI gene can be isolated to determine the frequency, location, and type of DNA mutants&#160;spontaneously arisen or after exposure to genotoxins.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...