Finanzierung bereitgestellt von der National Science Foundation (IOS-1050701 an BAC), die National Institutes of Health (NS54174 auf SM und F30DC0111907 zu AML-W.), Der Uehara Memorial Foundation und dem Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (G2205 zu TK ). Wir danken Julian Meeks für seine Unterstützung und Beratung zum Thema extrazellulären axonal Aufnahmen. Wir danken Carl Hopkins zur Bereitstellung eines Prototypen Aufnahme Kammer.

<ol>
	<li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus.">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li><li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control:+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin.">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li><li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1.">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li><li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo.">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li><li>Lima, S. Q., Hrom&#225;dka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINP:+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording.">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099 (2009).</li><li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li><li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer.">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li><li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dogged+pursuit+of+coincidence.">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li><li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish:+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia.">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li><li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS.">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pfl&#252;gers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li><li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li><li>Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish.">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li><li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish.">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li><li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior.">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior.">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li><li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain:+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis.">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li><li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection.">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li><li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li><li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex.">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li><li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets.">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system.">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li><li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus.">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li><li>O'Malley, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons:+applications+in+zebrafish.">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li><li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na++current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice.">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li><li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function.">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li><li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons.">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li><li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning.">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li><li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+nonlinear+optical+imaging:+beyond+fluorescence+microscopy.">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li><li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy.">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sobald beherrschen, wird diese Technik erlauben es, identifizierten Neuronen, einschließlich einzelner Axone, für die in vivo-Aufnahmen in vielen Modell Zielsysteme. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine zuverlässig aufzeichnen Spike Ausgabe von Neuronen mit einzigartigen anatomischen Merkmale, die traditionell in vivo Aufnahme Methoden schwierig zu machen. Wir haben diese Technik genutzt werden, um aus ELa &quot;kleinen Zellen&quot; in mormyrid schwach elektrischen Fischen aufzunehmen. Frühere Versuche, die Stimmung Eigenschaften der &quot;kleinen Zellen&quot; zu studieren, waren erfolglos durch anspruchsvolle Aufnahmebedingungen 11, 14. Ähnliche anatomische Merkmale schaffen Hindernisse für den Erhalt von Single-Unit-Aufnahmen aus vielen verschiedenen Wirbeltieren auditorischen Neuronen und elektrosensorischen 8-10. Um diese Herausforderungen in unserem System zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass &quot;kleine Zellen&quot; sind die einzigen Zellen in ELa dass Projekt ELP. Somit begrenzt retrograden Transport des Farbstoffes in ELP platziert Kennzeichnung in ELa zu &quot;kleinencell &quot;somas und Axonen. Fluoreszenzmarkierung der Axone erlaubt präzise Platzierung der Elektroden neben markierten Axone, so dass Single-Unit-Aufnahmen von identifizierten Zellen möglich trotz unzugänglich somas. Wir versuchten somatischen Aufnahmen, waren aber erfolglos, wahrscheinlich aufgrund der umliegenden verschlingenden Synapsen 11 , 17. war jedoch somatische Kennzeichnung deutlich sichtbar darauf hindeutet, dass diese Technik verwendet werden, um somatische Aufnahmen in anderen Zelltypen und andere Schaltungen abzuzielen. Fluoreszenzmarkierung von Neuronen durch retrograden Transport in vivo zur Führung gezielte Aufnahmen in vitro 19-21 verwendet wurde, . Eine ähnliche Technik wurde für die gezielte in vivo Aufnahmen von Motoneuronen im Rückenmark Zebrafisch 22 verwendet. Unsere Arbeit stellt eine neuartige Erweiterung dieses Ansatzes, in dem sowohl die Kennzeichnung und die Aufnahme in vivo im Gehirn sind fertig. Unsere Methode zeigt, dass in vivo Kennzeichnung von CNS Bereiche mit einer retrograden tRennfahrer können auf das Studium der anderen intakten Kreise mit ähnlich selektive Projektion Neuronen erweitert werden. Zum Beispiel in Säugetier-auditiven Verarbeitung dient der Colliculus inferior (IC) als wichtiger Weitergabezentrum für Eingänge von mehreren rhombencephalic Strukturen 23. Dye Injektion in den IC würde selektive Markierung der Zellen Vorsprung von jeder dieser Kerne. Der Colliculus superior (SC) bietet eine ähnliche Funktion für Vision 24. Rückenmark Zubereitungen eignen sich besonders gut für diese Technik geeignet, da das Rückenmark leicht zugänglich ist, Farbstoff-Injektion vom Aufnahmeort auftreten, und es kann mit intrazellulären Aufnahme und Füllen von ausgewählten Neuronen zu erwerben genauere anatomische Information 25 kombiniert werden. Schließlich ist Trakt-Tracing eine gut etablierte Technik in der zentralen Nervensystems verwendet werden, um komplexe Schaltung 26 zugeordnet. Unsere Methode kann genutzt werden, um funktionelle Informationen zu diesen Studien hinzufügen, wie hat w getan worden seinit Kalzium-sensitive Indikatoren in cat Sehrinde 27. Die Operation, die gut etabliert ist, zuverlässig und regelmäßig für Blinde in vivo Aufnahmen 16 verwendet wird, muss mit minimalen Blutungen und keine Schäden an der Oberfläche des Gehirns, das Tier und das Gewebe zu überleben erlauben abgeschlossen sein. Mit etwas Übung kann die Chirurgie und Farbauftrag in 30-45 Minuten abgeschlossen sein. Wir haben erfolgreich &quot;kleine Zelle&quot; Axone in 67% der Präparate bezeichnet. Die meisten Präparate haben nur 1 oder 2 sichtbar markierte Axone, aber einige haben so viele wie 8. Von den 119 markierten Einheiten versuchten, erhielten wir Single-Unit-Aufnahmen aus 26 Einheiten über 12 Zubereitungen (Tabelle 2) verteilt. So wurden die Daten von 41% der Präparate mit markierten Axone für eine Erfolgsquote von 28% erhoben. Der kritische Aspekt Farbauftrag wird die Kennzeichnung der Tiefe. Shallow Einsetzen der Wolframdraht in der Farbstoff gewaschen aw führenay. Wenn jedoch die Penetration zu tief, wird markiert Axone nicht sichtbar für das Targeting. Ferner muss eine mechanische Schädigung der Zelle für den Farbstoff ausreichend bis 25, 28 gemacht werden auftreten. Allerdings wird zu viel Schaden töten die Zellen. Wir haben versucht, die Markierung mit anderen Farbstoffen und andere Methoden (Tabelle 2), einschließlich anterograden Kennzeichnung durch Farbstoff Injektion in ELA mit Aufnahme von markierten Axone in ELP (Tabelle 3) gepaart. Wir vermuten, dass anterograden Kennzeichnung nicht erfolgreich war, weil Kennzeichnung wurde, um Zellen mit somatischen Schaden begrenzt, so dass sie nicht mehr reagiert. Zusätzlich kann präsynaptischen Terminals gestört worden. Dagegen minimiert retrograde Markierung beide dieser Probleme. Die Menge und Lage der Farbauftrag kann gemäß der speziellen Schaltung untersucht modifiziert werden. Maximal Kennzeichnung erfolgt mit dem größten Farbstoffkonzentration, die wir durch die Verwendung beschichteter Wolframdrähte. Allerdings, zur Beschriftung von Axonen mit deep Projektionen kann Farbstoff kommen aus einer Wolfram-Nadel, wie es fortgeschritten ist. In diesen Fällen würde Einspritzung besser geeignet. Dye Aufnahme und der Transport sind schnell, mit markierten Axone in unserer Vorbereitung sichtbar bereits 2 Stunden nach der Injektion und zusätzliche markierte Axone erscheinen so spät zu 6 Stunden nach der Injektion. Somit kann die Kennzeichnung und die Aufnahme an einem einzigen Tag durchgeführt werden, die Beseitigung technischer Schwierigkeiten mit dem Überleben Chirurgie. Die Zeitnahme erfolgt für jede Anwendung in Abhängigkeit vom Abstand zur Farbstofftransport erforderlich variieren. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Platzierung der Elektroden. Es ist wichtig, um das Gewebe in der Nähe der Stelle des markierten Axon verhindern das Verstopfen der Spitze ein. Bei dichtem Gewebe wie in ELa minimiert ein langer, dünner Schaft auf der Aufzeichnungselektrode über Bewegung des umgebenden Gewebes. Wenn eine erfolgreiche Aufnahme nicht beim ersten Versuch wiederholen mit frischen Elektroden erreicht, bis eine Aufnahme erhalten oder die tissUE bis zu dem Punkt, an dem das Axon nicht mehr sichtbar beeinträchtigt. Es ist jedoch auch wichtig, schnell die Elektrode neben dem Axon, die Menge des fluoreszierenden Belichtung, die Phototoxizität verursachen können, zu minimieren und Bleichen können physiologische Eigenschaften der Zelle 29-31 beeinflussen. Sobald ein Segment Axon erfolgreich in die Aufnahme-Elektrode abgesaugt, kann Aufnahmen für mehrere Stunden erhalten werden. Wenn Einheiten konsequent in weniger als 1 Stunde verloren gegangen sind, erwägen, kleinere Elektrode Tipps, um das Axon Herausrutschen zu verhindern. Auf der anderen Seite kann ein zu kleiner Spitze in Verstopfung, niedrigen Signal-zu-Rausch-, oder Schäden an der Axon führen. Ein stetiger Rückgang der Spitze Amplitude und der &quot;Rückkehr&quot; einer Einheit mit zusätzlicher Ansaug ist ein Indiz dafür, dass die Spitze zu groß ist. Zu viel Saug kann zu irreparablen Schäden an der Axon. Eine Lösung ist, ein kleines Leck in der Luftleitung ermöglicht so der Druck langsam auf Null zurück. Schnell Ausgleich the Druck wird in einem Übergangszustand relativ-außen &quot;Push&quot;, die das Axon zu vertreiben führen kann. Obwohl diese Technik, ein großer Vorteil für den Erhalt gezielte Aufnahmen von Projektion Neuronen identifiziert, wird es nicht zur Unterscheidung Interneuronen nützlich, als Farbstoff würde von allen Zelltypen an der Injektionsstelle entnommen werden. Theoretisch kann die Verwendung von mehreren Fluorophoren mit getrennten Injektionsstellen ermöglichen diese Verfahren erweitert werden. Zum Beispiel könnte Vergleich einzelner-versus Doppel-Markierung verwendet, um interneurons von Projektionsneurone nach Dual-Injektionen an zwei Punkten in der Schaltung 32 zu unterscheiden. Ebenso können retrograde Tracer mit anderen fortschrittlichen bildgebenden Verfahren, wie z. B. Zwei-Photonen-Imaging, wie kürzlich in Zebrafinken Hohe Vocal Center (HVC) 32 getan kombiniert werden. Außerdem sind die Aufnahme Regionen jenen nahe der Oberfläche begrenzt, wenn mit Epifluoreszenz Mikroskope, wie wir nur konnten 1 &amp; lösenmu; m Strukturen innerhalb der ersten 30 um von Gewebe. Jedoch könnte diese Tiefe durch die Verwendung von anderen Mikroskopieverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie 33 oder Ziel-gekoppelten planaren Beleuchtung Mikroskopie 34 verlängert werden. Insgesamt stellt diese Technik einen wichtigen Fortschritt bei der Untersuchung der neuronalen Schaltkreise in vivo, da sie verwendet werden, um von einzelnen Neuronen in vielen verschiedenen Schaltungen in einer Vielzahl von Modellsystemen aufnehmen - auch diejenigen, die schwer zugänglich sind.

<table border="1" cellspacing="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tricaine Methanesulfonate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E10521</td>
 <td>MS-222</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallamine Triethiodide </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8134</td>
 <td>Flaxedil</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lidocaine Hydrochloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L5647</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hickman's Ringer Solution </td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2&bull;2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic Pump</td>
 <td>Gilson or Rainin</td>
 <td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td>
 <td>10.0 &plusmn; 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection Microscope </td>
 <td>Nikon</td>
 <td>SM2645</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super Glue</td>
 <td>Super Glue Corporation</td>
 <td>SGH2</td>
 <td>2g tube</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Omni Drill 35</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>503-598</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501860</td>
 <td>0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Temp Cautery Kit</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500391</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Micromanipulator</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>M3301R</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran Conjugated Alexa Fluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D-22912</td>
 <td>2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescent Microscope</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>E600 FN</td>
 <td>A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93182</td>
 <td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Power Objective</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>93148</td>
 <td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>White Light Source</td>
 <td>Dolan-Jenner</td>
 <td>Model 190</td>
 <td>Fiber Optic Illuminator</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent Light Source </td>
 <td>Lumen Dynamics</td>
 <td>X-Cite 120Q</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low-light Level Camera</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>CoolSnap ES</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digital Manometer</td>
 <td>Omega Engineering</td>
 <td>HHP-201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Motorized Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MP-285</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Headstage</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>CV-7B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>MultiClamp 700B</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquisition System</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1322A</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isolated Pulse Stimulator</td>
 <td>A-M Systems</td>
 <td>2100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-97</td>
 <td>Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: '0', Velocity: 60, Time: 90 Box filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipette Glass</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td>Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

retrograde fluorescent labeling allows for targeted extracellular single-unit recording from identified neurons in vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Single-Unit-Antworten von einem identifizierten Population von Neuronen aufzuzeichnen. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von einzelnen Neuronen sind entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise unter natürlichen Bedingungen funktionieren. Traditionell sind diese Aufnahmen durchgeführt &quot;blind&quot;, dh die Identität des aufgenommenen Zelle am Anfang der Aufzeichnung bekannt. Cellular Identität kann nachträglich über intrazelluläre 1, 2 oder juxtacellular loose-Patch 3 Iontophorese des Farbstoffs bestimmt werden, aber diese Aufnahmen können nicht auf bestimmte Neuronen in Regionen mit funktionell heterogenen Zelltypen gezielt vorbehandelt werden. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Zelltyp-spezifischen Weise ermöglicht visuell geführten einzelligen Elektrophysiologie 4-6 ausgedrückt. Es gibt jedoch viele Modellsysteme für die diese genetischen Werkzeuge sind nicht verfügbar. Auch in genetisch zugänglich Modellsysteme, die gewünschte PROmoter unbekannt sein oder genetisch homogenen Neuronen haben unterschiedliche Muster Projektion. In ähnlicher Weise wurden virale Vektoren verwendet, um bestimmte Untergruppen von Projektionsneurone 7 bezeichnen, aber die Verwendung dieses Verfahrens ist durch die Toxizität und das Fehlen von trans-synaptischen Spezifität begrenzt. So werden zusätzliche Techniken, die spezifische Pre-Visualisierung bieten, um von einzelnen Neuronen identifiziert in vivo Aufnahme benötigt. Pre-Visualisierung der Zielneuron ist besonders für anspruchsvolle Aufnahmebedingungen für die klassischen Single-Cell-Aufnahmen sind oft prohibitiv schwierig 8-11. Die neue Technik in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet retrograden Transport von einem fluoreszierenden Farbstoff aufgetragen wurde, mit Wolframnadeln schnell und selektive Markierung eine bestimmte Untergruppe von Zellen in einer bestimmten Region des Gehirns auf ihrer einzigartigen axonalen Prognosen, wodurch ein visueller Hinweis gezielt elektrophysiologischen erhalten von identifizierten Neuronen in einer intakten Schaltkreis withina Wirbeltiere CNS. Der bedeutendste neue Entwicklung unserer Methode ist die Verwendung von Fluoreszenz-Markierung auf bestimmte Zelltypen nicht genetisch zugänglich Modell Zielsystem. Schwach elektrische Fische sind ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in wach, sich verhaltenden Tier 12. Wir nutzten diese Technik, um sensorische Verarbeitung von &quot;kleinen Zellen&quot; in der vorderen exterolateral Kern (ELA) von schwach-elektrischen Fischen mormyrid studieren. &quot;Kleine Zellen&quot; sind die Hypothese zu Zeit Komparator Neuronen wichtig zum Erfassen submillisekundenschnelle Unterschiede in den Ankunftszeiten der präsynaptischen Spikes 13 sein. Allerdings haben anatomischen Merkmalen wie dichten Myelin Verschlingen Synapsen und kleine Zellkörper es extrem schwierig, aus diesen Zellen mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren 11, 14 aufzunehmen. Hier zeigen wir, dass unser neues Verfahren selektiv markiert diese Zellen in 28% der Vorbereitungen, so dass für eine zuverlässige, robuste und Aufnahmen characterisierung der Antworten auf elektrosensorischen Stimulation.

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Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden<em&gt; In vivo</em&gt; Und ermöglicht die Aufnahme von extrazellulären identifiziert Axone. Diese Technik ermöglicht die Aufnahme, wenn Neuronen kann nicht durch genetische Manipulation bezeichnet werden oder sind schwer zu isolieren mit &quot;blind&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Ansätze.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

19.8K Aufrufe.  Washington University in St. Louis. Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden In vivo Und ermöglicht die Aufnahme von extrazellulären identifiziert Axone. Diese Technik ermöglicht die Aufnahme, wenn Neuronen kann nicht durch genetische Manipulation bezeichnet werden oder sind schwer zu isolieren mit "blind" In vivo Ansätze.

Serie: Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Forschung

Neurowissenschaften

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Surgical Implantation of Chronic Neural Electrodes for Recording Single Unit Activity and Electrocorticographic Signals

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery. Here we provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting electrode systems. We demonstrate the implantation procedure of both a penetrating and a surface electrode. The surgical process is described from start to finish, including detailed descriptions of each step throughout the procedure. It should also be noted that this video guide is focused towards procedures conducted in rodent models and other small animal models. Modifications of the described procedures are feasible for other animal models.

We provide useful information for surgeons who are learning the process of implanting chronic neural recording electrodes. Techniques for both penetrating and surface electrode systems are described in a rodent animal model.

Chirurgische Implantation von Elektroden für die Neural Chronische Aufnahme Single Unit Activity und Electrocorticographic Signale

The success of long-term electrophysiological recordings often depends on the quality of the implantation surgery.  Here we provide useful information for ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. Generally, the dyes are applied as solid crystals or by local pressure injection using glass pipettes. However, this can result in dilution of the dye and reduced labeling intensity, particularly when several hours are required for dye diffusion. Here we demonstrate a simple and low-cost technique for introducing fluorescent and ion-sensitive dyes into neurons using a polyethylene suction pipette filled with the dye solution. This method offers a reliable way for maintaining a high concentration of the dye in contact with axons throughout the loading procedure.

We describe a simple and low cost technique for introducing high concentration of fluorescent and calcium-sensitive dyes into neurons or any neuronal tract using a polyethylene suction pipette.

Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Die intrazelluläre Aufnahme, Sinnes Field Mapping und Kultivierung identifizierten Neuronen in der Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Ein Leitfaden zur<em&gt; In vivo</em&gt; Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...