Gefördert durch NIH P40 OD010952 die Korein Foundation, einer von der Universität Miami Stipendium für SLC und ein Stipendium für Maytag ATK. Die Autoren danken den Mitarbeitern der nationalen Ressource für Aplysia sowie Lauren Simonitis und Hannah Peck, die Aufnahmen für eine Figur zur Verfügung gestellt.

1. Zellpräparation <ol><li> Am Tag 1, wiegen und betäuben Tier. <ol><li> Wiegen eine 30 g-1 kg Tier. Anesthetize in 5-10 Tier Volumen von 1:1 Meerwasser: isotonische MgCl. 6H 2 0 1 h mit Belüftung wie eine elektrische Luftpumpe Aquarium mit angeschlossenem airstone. </li></ol></li><li> Bereiten Dissektion liefert. <ol><li> Montieren sauber Dissektion Tablett mit Edelstahl Stecknadeln, wie Stoff-Pins. Montieren Sie mehrere Petrischalen mit künstlichem Meerwasser (ASW, siehe Tabellen 1 und 3) + Penicillin / Streptomycin (P / S). </li><li> Haben Sie bereit eine Low-Power-Mikroskop. Haben sauber Dissektionsinstrumente bereit, wie z. B. gerippte Nase und feine chirurgische Pinzette und feine und große chirurgische Schere. Sprühen Sie die Geräte mit 70% Isopropylalkohol vor der Verwendung und trocknen lassen. </li></ol></li><li> Position Tier auf Dissektion Fach. <ol><li> Position Tier Bauchseite nach unten in der Präparation Fach. Pin Tierdurch Kanten des Körpers Wand und parapodial Grenzen, aber vermeiden Schwanz und Kopf, um die dorsale Oberfläche freizulegen und den Genitalbereich Nut </li><li> Spülen Sie die Dorsalfläche in langsam laufenden kaltem Leitungswasser. Tragen Sie eine dünne Strom von 70% Isopropylalkohol von einem Squeeze-Flasche entlang der genitalen Nut und über die Oberseite des Kopfes. </li></ol></li><li> Machen Sie den ersten Schnitt. <ol><li> Mit einem Low-Power-Mikroskop (siehe Tabelle 2) und das reflektierte Licht auf den Punkt, wo die genitale Nut stammt aus der vorderen Schale Marge beobachten, straff mit gerippten Nase-Zange eine Falte des Gewebes auf der linken Seite dieser Herkunft zu halten, während eine flache snipping Hole Alle den Weg durch die glatte, ebene Fläche des Körpers Wand gleich rechts von der genitalen Nut mit feinen abgewinkelte Schere. </li><li> Hämolymphe beobachtet werden, um aus dem Loch gießen, manchmal mit sich trägt, die Abdominalganglion und Magen. </li></ol></li><li> Erweitern Sie den Einschnitt. <ol><li> Verwenden Sie große Schere th erweiterne Einschnitt vorne zu einem Punkt zwischen den Rhinophoren, um beim Ziehen nach oben mit dem unteren Messer zu vermeiden nicking den Darm. Die inneren Organe werden beobachtet zu verschütten aus dem Einschnitt werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Ganglien. <ol><li> Positionieren Sie das Fach, und konzentrieren das Mikroskop auf den Kopfbereich. </li><li> Mit sauberen Pinzette und einer feinen Schere, entfernen Sie den Kopf Ganglien durch Abtrennen an einem Punkt die Nerven, die den Kopf Ganglien bilden in einem Ring um die Speiseröhre zu Pleura-Pedal und Cerebralganglien als Gruppe zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die bukkale Ganglion, das der Bauchseite des Ösophagus hält. </li><li> Entfernen Sie die Abdominalganglion indem die 4 großen Nerv Konnektive dass Problem von diesem Ganglion. </li></ol></li><li> Isolieren Ganglien des Interesses. <ol><li> Trim Kopf Ganglien auseinander, so dass eine Länge von Verknüpfungen an jedem Ganglion von Interesse, die in Höhe von mindestens dem Durchmesser des Ganglion ist, dies wird über verzögern Enzym-Verdauungvon den Zellen von Interesse in dem nächsten Schritt. </li><li> Setzen Sie jedes Ziel Ganglion durch 2 Spülungen ASW + P / S, die sich zwischen Spülungen mit sauberen Pinzette. </li><li> Wenn gezielt die PVC Zellen, lassen Sie den rechten Pleura hemiganglion an das rechte Pedal hemiganglion, und in ähnlicher Weise lassen Sie die linke Pleura hemiganglion an der linken Pedal hemiganglion. </li><li> Entsorgen Sie unerwünschte Ganglien und den Rest des Tieres nach akzeptierten Forschungspraxis. </li></ol></li><li> Enzymatisch verdauen die Ganglien. <ol><li> Für jedes Ganglion Herstellung von 1 ml Enzymlösung, bestehend aus 3,75 mg Dispase, 1 mg Hyaluronidase und 0,3 g Collagenase Typ XI pro ml ASW + P / S in einem 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen. </li><li> Platz gespült Ganglien in Enzymlösung und befestigen Sie den Deckel fest. Legen Sie das Rohr auf seiner Seite auf einem Schüttler (siehe Tabelle 2) bei niedriger Geschwindigkeit für 13-5 h über Nacht bei ca. 23 ° C (Raumtemperatur). </li></ol></li><li> Bereiten Sie dasKulturschalen. <ol><li> Vor Mikrodissektion (Tag 2), bereiten Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Kulturschalen in einer Gewebekultur Kapuze. In ~ 0,5 ml PDL (0,2 mg / ml sterilem Wasser) in die Mitte eines 35-mm-Schale für ~ 25 min. </li><li> Spülen PDL 3x mit sterilem Wasser. Trocknen lassen. UV-Sterilisation der Platten. </li></ol></li><li> Tag 2 Isolieren Neuronen. <ol><li> Füllen Sie das Zentrum von 35 mm Gerichte, die PDL-beschichteten und UV mit ca. 0,5 ml ASW + P / S sterilisiert, um eine Insel der Medien innerhalb der ansonsten trockenen Gericht zu schaffen waren. Dies kann auf der Bank durchgeführt werden, außerhalb der Gewebekulturabzug. Ein Gericht sollte für jede Zelle, die von einem Cluster hemiganglion hergestellt werden. </li><li> Haben Sie bereit eine 100 mm Durchmesser Dissektion Gericht durch Sylgard-Beschichtung und Härten einer 5 mm tiefen Dissektion Oberfläche, mit feinen Sezierung Pins von mehreren Größen als Stifte und Sonden verwendet werden (siehe Tabelle 3) ausgestattet. Spülen Sie dieses Gericht mit 70% Isopropylalkohol, dann mit ASW + P / S, und schließlich fill sie mit ASW + P / S. </li></ol></li><li> Bereiten Mikrodissektion verdaut Ganglien. <ol><li> Gießen Sie die Lösung, die das Enzym verdaut Pleura-Pedal und Buccalganglien in die Dissektion Gericht. </li><li> Legen Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops gegen eine schwarze Fläche unter reflektierte Licht. </li><li> Mit dem beigefügten Bindegewebe, festzunageln jedes Pleura-Pedal hemiganglion dorsalen Seite nach oben. Die Gewebe wird weich und intolerant von Stretching. </li></ol></li><li> Microdissect PVC Neuronen. <ol><li> Mit 2 Paar sauberen feinen Pinzette, und hält einen feinen Sezierung Stift in eine Pinzette als Sonde, isolieren die Zellen aus einem PVC Pleura hemiganglion. Enzyme Verdauung wird entfernt haben oder neben das Bindegewebe Mantel für den PVC-Cluster gebrochen, aber die Zellen aneinander haften. </li><li> Verwenden Sie die Sonde, um diese Zellen aus dem Pedal-Pleura Binde 18 lösen, dann lassen Sie die Zelle Cluster fallen auf den Boden der DissektionGericht. </li></ol></li><li> Übertragen Neuronen Kulturschale. <ol><li> Übertragen Sie die Zelle Cluster auf eine vorbereitete 35 mm Kulturschale durch leichtes Ansaugen der Cluster in der Spitze eines leicht feuerpolierten Einweg-Glas-Pasteur-Pipette, dann Abgeben es langsam in den Medien Insel in einer Kulturschale, wobei darauf zu vermeiden Einführung Luftblasen in die Pipette. Wiederholen Sie die Isolierung des PVC-Cluster der anderen hemiganglion und in einen separaten Kulturschale. </li></ol></li><li> Microdissect und übertragen BSC Neuronen. <ol><li> Merken Sie sich die bukkalen Ganglion Bauchseite up, mit Sorgfalt, um die Zellen von Interesse zu ersparen. Wiederholen Sie Schritt 2 1.12 mit den BSC Zellhaufen der bukkalen Ganglion 10. </li><li> Isolation von PVC und BSC Neuronen produzieren 4 Kulturschalen mit Neuronencluster: 2 Schalen mit BSC-Cluster und 2 Schalen mit PVC-Clustern. Entsorgen Sie den Rest der Ganglien und beiseite stellen die 100 mm Dissektion Gericht. </li></ol></li><li> Dissociate die Zellhaufen. <ol><li> Legen Sie eine Kulturschale mit Zellen auf der Stufe der Low-Power-Mikroskop und den Deckel abnehmen. </li><li> Dissociate die PVC-Cluster durch leichtes Ausklopfen den Boden der Kulturschale neben dem Zellverband mit einem feinen Stift in Dissektion Zange gehalten. Flicking gräbt die Spitze des Stiftes in den Kunststoff der Boden der Schale als versuchte heraus zu graben ein Fleck aus Kunststoff. Wenn die Reibung mit dem Kunststoff der Stift Punkt gibt, wird eine Stoßwelle durch das Medium, die auseinander bricht die Nähe Klumpen von Zellen produziert. </li><li> 5-10 Flicks erforderlich sein, um fast vollständig distanzieren die Zellen werden, aber es ist besser, kleine Gruppen von Zellen eher verlassen als zu viel streichen damit die Zellen durch mechanische schiere zerstört werden. </li><li> Deckel aufsetzen und wiederholen mit anderen Kulturschalen. </li></ol></li><li> Bewahren Zellkulturen. <ol><li> Legen Sie die Kulturschalen mit Medien Inseln in ihren Zentren mit dissoziierten Zellen inein großer Container, der Luftzirkulation, zB ein 150 x 25 mm rund Kunststoff-Petrischale erlaubt, und legen Sie dieses Gericht in einem Inkubator-Set bis 17 ° C. </li><li> Installieren Sie in der Kammer eine offene Schale mit Wasser als Quelle von Feuchtigkeit. Lassen Sie über Nacht ungestört. Die Zellen werden auf die Poly-D-Lysin-Beschichtung in der Mitte der Schale zu halten. </li></ol></li><li> Flood Kulturschalen. <ol><li> Am Tag 3, vorsichtig überschwemmen die Gerichte mit 2,5 ml ASW + P / S. Untersuchen und zählen Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop Zellkultur. Shop in der 17 ° C-Inkubator. </li></ol></li></ol> 2. Elektrophysiologie Die Methode ist Standard Patch-Clamp-das hat in zahlreichen Texten beschrieben worden (z. B. Sakmann und Neher, 1995) 16. Dieses Protokoll wird auf Zellen arbeiten ≤ 100 pF Kapazität oder Zellen &lt;60 Mikrometer Durchmesser während der Tage 3 und 4 des Protokolls. Zellen ohne Prozesse sind optimal für die Aufnahme. Die folgenden speziellen PRÜFUNGIonen gelten: <ol><li> Größere Zellen können mit der Konfiguration Einstellung auf dem Axopatch 200B Verstärker auf β = 0,1 untergebracht werden. Aktivierung sehr große Ströme verursachen Zellen Spannungsklemme entkommen. ASW Lösungen für Salzgehalt substituiert (z. B. ein Bruchteil des NaCl mit undurchlässigen N-methyl-D-Glucamin Chlorid substituiert ist) verwendet werden, um Gesamtzellstrom Amplitude zu reduzieren. </li><li> Fasergefüllte Borosilikatglas Patch-Pipetten auf einer Pipette Abzieher gezogen und auf halbem Weg mit intrazellulären Lösung (ICS), bestehend aus 450 mM KCl und andere Salze (siehe Tabelle 1) verfüllt sind geeignet und sollte Widerstand von ca. 0,5-1 MOhm haben. Wenn Isolierung spezifischer Ionenströme erwünscht ist, beispielsweise Na +-Ströme in Abwesenheit von K Ströme, K + in dieser Lösung mit anderen Ionen, wie Cs + ersetzt werden. Cl - Austausch von ICS mit einem impermeant Anion ist auch dann gerechtfertigt, wenn eine natürliche ICS erwünscht9. </li><li> Die Zellen sind mit&gt; 1 hr-lange Aufnahmen möglich bei Raumtemperatur stabil. Die Aufnahme ist optimal an den Tagen 3 und 4 des Protokolls, entsprechend 24-48 h in Kultur. Nach 48 Stunden gibt es Schwierigkeiten bilden Gigaohm Dichtungen, vielleicht wegen der Ausarbeitung eines Glykokalyx auf der Zelloberfläche und Raum Klemme Probleme Prozess Auswuchs verursacht. Die Zellen sind nützlich, aber für nicht-Patch-Clamp-Untersuchungen wie Toxikologie, die bei &lt;14 d abgeschlossen werden kann. </li><li> ASW und andere Lösungen von der Schwerkraft Lösung Gerät verzichtet werden, sowie intrazelluläre Lösung sollte durch eine Spritze gefiltert werden montiert 0,2 um Acrodisk Filter (Tabelle 3), um feine Partikel, die mit Gigaohm Dichtung Bildung stören zu beseitigen. </li><li> Desensibilisierung tritt bei der Verwendung von Agonisten, wie zB D-Aspartat (D-Asp), deshalb ~ 1-2 min zwischen Anwendungen von Agonisten empfohlen. Umgekehrt wird oft mit schnellen Potenzierung wiederholt Anwendung beobachtetKation-Agonisten, wie L-Glutamat (L-Glu). </li><li> Agonist aktiviert Ströme wie L-Glu durch Anlegen Agonisten mit der Pipette Picospritzer untersucht werden. Diese Pipette ist der gleiche wie der Patch-Pipette gezogen und enthält Agonist in ASW. Wenn die Spitze dieser Pipette ist unterhalb der Abflussleitung der Schwerkraft Lösung positioniert und in einem 45 ° Winkel von der Abflussleitung (2F), Agonisten schnell weggewaschen werden aus der Zelle und Desensibilisierung minimiert. Der Agonist Pipette schaffen einen Winkel von 90 ° oder mehr relativ zu der Patch-Pipette. </li></ol>

<ol>
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A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+regulates+a+vesicular+class+of+calcium+channels+in+the+bag+cell+neurons+of+Aplysia.">Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).</li><li>Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+a+calcium-sensitive+nonspecific+cation+channel+by+closely+associated+protein+kinase+and+phosphatase+activities.">Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Dissoziation hier beschriebenen Techniken ergeben sensorischen Neuronen Kulturen mit 50-100 isolierten Neuronen mit einer kleinen Anzahl von Gliazellen und anderen nicht identifizierten Zellen durchsetzt. Die wichtigsten Schritte in dem Protokoll sind die Zeit die Ganglien in Enzym Lösung bleiben, und schnippen, die Dissoziation der verdauten Zellhaufen auseinander zu brechen das Cluster in einzelne Zellen. Enzyme Verdauung (Schritt 1.8) muss bei der Temperatur zur Verfügung optimiert werden. Bei 23 ° C unter lan...

Die marine opistobranch Weichtier, Aplysia, ist ein nützliches neurobiologischen Modell für viele Jahrzehnte. Es ist am besten als ein Modell der Gewöhnung und klassische Konditionierung 7, 8 bekannt. Studien über Lernen und Gedächtnis in diesem Modell gewann den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin im Jahr 2000 für Eric R. Kandel, in einem Preis, den er mit Arvid Carlsson und Paul Greengard 10 geteilt. Studien mit elektrischen Aufnahmen von reduzierten Zubereitungen, in denen Elemente des Nervensystems des wirbellosen aus dem Tier seziert Nerven und Muskeln belassen wird, haben dazu beigetragen, erläutern die Rollen der einzelnen Neuronen in Aplysia. Identifizierung der genauen molekularen Mechanismen, die das Lernen in Aplysia bilden aber oft eine andere Technik eingesetzt, langfristige Co-Kulturen von einer sensorischen Neuronen und Motoneuronen, erhalten eine nach der anderen von den einzelnen Tieren und Spender erlaubt, eine Synapse in der Kulturschale 21 bilden . Wir und andere 1, 3, 6, 14, 15, 16 haben die Leichtigkeit, mit der Neuronen in diesem Modell kann gezielt sowie ihre Ausdauer werden in langfristige Experimente dissoziiert kurzfristig Kulturen von Clustern aus nominell homogenen Neuronen identifiziert machen genutzt in denen wir studieren Ionenströme unter Voltage-Clamp in der Patch-Clamp-Konfiguration. Viele Aplysia aufstehen, um wiederholte Runden der Patch-Clamp-Zeit für dauerhafte experimentelle Manipulationen zu ermöglichen. Das Verfahren ist nützlich für die Neuronen wie die neurosecretory Tasche Zellen des Abdominalganglion und der sensorischen Neuronen der Pleura und Buccalganglien deren Dissoziation hier beschriebenen, nicht aber für sehr große Neuronen&gt; 60 um Durchmesser, wie L7 oder R2 die Abdominalganglion. Wir beschäftigen keine Aplysia Serum in unseren Kulturen, im Gegensatz zu den sensorisch-Motoneuronen Co-Kulturen an anderer Stelle beschrieben. Die meisten Neuronen erhalten mit diesem Verfahren wird ohne Prozesse für ter zunächst 48 h in Kultur, Erleichterung ganze Zelle Spannung Aufnahme, aber dann sprießen und erarbeiten Axone und andere Prozesse für etwa 14 Tage vor dem Sterben aus Mangel an Nährstoffen und / oder Wachstumsfaktoren. Diese Technik erzeugt primären Kulturen von 50-100 Neuronen pro Schale aus physiologisch dokumentiert Regionen der bukkalen und Pleuralganglien. Dieses Protokoll ist für die Forscher studieren Aspekte der einzelnen Zelle Physiologie in Experimenten, die zahlreiche Experimentwiederholungen pro Tier erforderlich. Es entsteht ein passendes Paar von Kulturen aufgrund der anatomischen Trennung der Zielzellen in linke und rechte hemiganglia, ermöglicht Untersuchungen, die Nutzen aus abgestimmten Behandlung und Kontrollkulturen. Das Protokoll zielt bukkalen S-Cluster (BSC) Neuronen des Ganglion bukkalen und Pleura ventrokaudal (PVC) Neuronen des Ganglion Pleura. Diese Zellen sind eine geeignete Größe für die gesamte Zellspannung Aufnahmen und Display robust glutamatergen Antworten. Die diskutierten Methodik ist für die meisten Ganglien in der Aplysia Nervensystem.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Artificial seawater ASW</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100</td>
 <td>Lonzo Walkersville, Inc.</td>
 <td>17-603E</td>
 <td>5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral dispase II</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>10165859001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hyaluronidase</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4272</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>collagenase type XI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C9407</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamate (L-Glu)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49601-100G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Aspartate (D-Asp)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>11200-10G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-methyl-D-aspartate (NMDA)</td>
 <td>Biomol</td>
 <td>100002-268</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Asp</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6683-25G</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6816-5MG</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glu R antagonists</td>
 <td>various</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>agar</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>kynurenate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>61250</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>APV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-propanol</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>BDH1133</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloriding solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>assorted</td>
 <td>25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard silicone 2-part polymer</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>Provides pin-out surface for small dissection dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0-40x zoom magnification microscope for dissections</td>
 <td>Wild</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator</td>
 <td>Microoptics of Florida</td>
 <td>TQ FOI-150</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RotoMix 50800 orbital mixer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) &amp; 40x objectives</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>Eyelink II</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tektronix digital oscilloscope</td>
 <td>SR Research Ltd.</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp 10 data acquisition and analysis software</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PC with Windows XP or higher operating system</td>
 <td>PC Solutions</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown P87 micropipette puller</td>
 <td>Sutter Instruments, Novato, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>CV203BU</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1200 A/D converter</td>
 <td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration</td>
 <td>Parker Hannifin, Cleveland, OH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TMC Micro-G Vibration isolation table</td>
 <td>Ametek</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Faraday cage</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators</td>
 <td>Burleigh Instruments; Thorlabs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>presently PCS-5000; -6000 series + mounts</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 inch length</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl half cell</td>
 <td>WPI</td>
 <td>EP4</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Angled Scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15006-09</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumostar Fine forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-00</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm falcon tissue culture dishes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>25382-064</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>1013</td>
 <td>also can be made into small dissection dishes with sylgard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sylgard</td>
 <td>WPI</td>
 <td>SYL184</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>animal dissection tray</td>
 <td>various</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>21008-918</td>
 <td>For 6-bore gravity-fed perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum clips with screw hole ends</td>
 <td>hardware store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 gauge needles (manually file off points)</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array</td>
 <td>Narishige USA</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>one-way valves</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps 1 &mu;l</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>For perfusion system</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18 gauge needles for suction (filed off points)</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polyethylene tubing</td>
 <td>Cole Parmer</td>
 <td>4.27436E+11</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>fine dissection pins</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>26002-20</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>capillary tubes</td>
 <td>Kimble 71900-100</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>modeling clay</td>
 <td>craft store</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dish holder for microscope stage with isolated ground bath</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Custom manufacture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pasteur pipettes</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>14672-412</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pipette bulbs</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>53283-911</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>acrodisk syringe filters</td>
 <td>VWRSP</td>
 <td>28144-040</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass</td>
 <td>WPI</td>
 <td>1B150F-3</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

isolation of sensory neurons of aplysia californica for patch clamp recordings of glutamatergic currents

Die Meeresschnecke Aplysia californica Weichtier hat eine traditionsreiche Geschichte als Modell für die Funktion des Nervensystems, mit besonderer Bedeutung in den Studien von Lernen und Gedächtnis. Die typischen Vorbereitungen für solche Studien sind solche, bei denen die sensorischen und Motoneuronen intakt gelassen werden in einem minimal seziert Tier oder eine technisch aufwendige neuronalen Co-Kultur der einzelnen sensorischen und Motoneuronen. Weniger häufig ist das isolierte neuronale Vorbereitung, in denen kleine Gruppen von Neuronen sind nominell homogen dissoziiert in einzelne Zellen in kurzfristige Kultur. Solche isolierten Zellen sind für die biophysikalischen Charakterisierung Ionenströme mit Patch-Clamp-Techniken, und gezielte Beeinflussung dieser Leitwerte. Ein Protokoll für die Herstellung solcher Kulturen beschrieben. Das Protokoll nutzt die leicht identifizierbaren glutamatergen sensorischen Neuronen des Pleura-und Buccalganglien, und beschreibt deren Dissoziation und minimale Wartung in Kultur für mehrere Tage ohne Serum.

Die Positionen der sensorischen Neuronen im Ganglien, die in diesem Protokoll ausgerichtet sind, sind die BSC und PVC Neuronen in Abbildung 1 dargestellt. Die BSC Neuronen in 2 symmetrische oval Cluster auf der Bauchseite des bukkalen Ganglion, die Oberfläche, die abgewandt von der bukkalen Masse im intakten Ganglion (1A) angeordnet ist. Die PVC Neuronen bilden bilateralen, V-förmigen Cluster, die sich um die dorsale Oberfläche der Pleura Ganglion in Richtung der Mittelachse ...

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Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt Seehasen<em&gt; Aplysia</em&gt; Nach der Narkose, die Isolierung von Neuronen für kurzfristige-Gewebekulturen, und Aufnahmen von einzelnen Zelle Ionenströme über die Patch-Clamp-Technik.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

isolation-sensory-neurons-aplysia-californica-for-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

12.2K Aufrufe.  University of Miami. Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt Seehasen Aplysia Nach der Narkose, die Isolierung von Neuronen für kurzfristige-Gewebekulturen, und Aufnahmen von einzelnen Zelle Ionenströme über die Patch-Clamp-Technik.

Serie: Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforated-Patch-Clamp-Aufzeichnung der Maus Riechzellen in Intact Neuroepithel: Funktionelle Analyse von Neuronen, die eine bestimmte Geruchsrezeptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.