We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. Herstellung der Zellen und Reagenzien <ol><li> Der Tag vor dem Test, Platte geeignete Wirtszellen für das Virus in Frage (Tabelle 1 und 2) bei 90 bis 100% Konfluenz. </li><li> Vorbereitung Fixierlösung von 10% Formaldehyd in dH 2 O. In Beispiel mischen 5,56 ml 36% stock Formaldehyd mit 14,44 ml destilliertem H 2 O (dH 2 O). HINWEIS: Verwenden Sie geeignete sicheren Handhabung zu und Lüftung bei der Verwendung von Formaldehyd. </li><li> Vorbereitung Kristallviolett-Färbung: 1% Kristallviolett (CV) in 20% Ethanol und dH 2 O. </li><li> Bereiten 2x Plaque Medien (Zelltyp abhängig zu 2x Konzentration; siehe Tabelle 2). Filter mit einem 0,2 um Filter, wenn irgendwelche Reagenzien sind nicht steril. </li><li> Vorbereitung der Immobilisierung Overlays (Tabelle 3) <ol><li> Für flüssige Overlays, machen Sie eine sterile 2,4% ige Lösung von Avicel in dH 2 O. Um ein Verklumpen zu verhindern, fügen Sie das Pulver in einen Kolben Wasser mit thbei rasch Mischen mit einem Rührstab, gießen Avicel langsam und rühren schnell bei Raumtemperatur (RT). Wenn die Lösung als zu viskos für ein Rührstab zu homogenisieren, zu einem Kolbenschüttler für&gt; 30 min wechseln mit schweren Agitation sogar Homogenisierung zu gewährleisten. HINWEIS: Die Stammlösungen kann bei geringeren Konzentrationen hergestellt werden, aber die Lösungen getrennt und müssen wieder gemischt, um die Homogenisierung zu gewährleisten. Arbeitslösungen Avicel kann reichen von 0,6 bis 3% werden. </li><li> Nach der Homogenisierung Autoklaven die Lösung und lagern bei RT versiegelt. </li><li> Für Agarose und Carboxymethylcellulose (CMC) Overlays, bereiten eine Stammlösung in dH 2 O 2% CMC oder 0,6% Agarose. Mischen Sie mit einem Rührstab und Autoklaven oder Mikrowelle, um in Lösung zu bringen. </li></ol></li></ol> 2. Verdünnungen und Infektionen <ol><li> Am Tag nach der Beschichtung, Sichtprüfung der Konfluenz und Lebensfähigkeit der Zellen vor dem Start des Assays. Stellen Sie sicher, Standardzellmorphologie einnd a ~ 90% konfluenten Monolayer vorhanden. </li><li> Führen Sie eine Verzehnfachung serielle Verdünnung der infektiösen Proben. Verwenden der zellulären Wachstumsmedien für die Virusvermehrung als Verdünnungsmittel (Tabelle 2). Variieren Sie die Anzahl der Verdünnungen auf Basis der erwarteten Titer des Virus in Frage erforderlich, und immer eine nicht-infizierten Kontrollprobe zu verwenden, um unabhängig zu gewährleisten zelluläre Lebensfähigkeit und Hilfe bei der Plaque-Identifikation. </li><li> Aus den seriellen Verdünnungen, infizieren die Zellen für 45 min bis 1 h (Tabelle 1). Verwenden ein ausreichendes Volumen des Inokulums, die Zellen abdecken, während das Volumen so gering wie möglich, um virale Kontakt mit der Monoschicht (Tabelle 4) zu maximieren. Sanft Felsplatten alle 20 min, um sicherzustellen, gleichmäßige Abdeckung und verhindern, dass die zelluläre Monoschicht vor dem Austrocknen. </li><li> Nach der Infektion überlagern eines geeigneten Volumens der Immobilisierung Medium direkt auf die Inokula in der Vertiefung (Tabelle 2) unter Verwendung eines 1: 1-Mischung von 2 x Medium und dem Plaque immobilizing-Overlay der Wahl (CMC, Agarose oder Avicel). Schaukeln zu mischen. <ol><li> Für flüssige Overlays, mischen Sie 1: 1 mit erwärmt 2x Plaque Medien und 1,2-2,4% RT stock Avicel um eine Arbeitslösung von 0,6-1,2% Avicel Overlay Medium zu erhalten. </li><li> Für eine Agarose-Overlay, verwenden Sie eine 1: 1-Mischung aus erwärmt 2x Plaque Medien und eine Stammlösung von beheizten 0,6% Agarose, in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min, um die Temperatur Erhalt einer endgültigen Agarose / Overlay Konzentration von 0,3 ins Gleichgewicht %. </li><li> Für CMC, bereiten eine 2% ige Stammlösung und Behandlung wie für die Agarose-Overlay beschrieben. </li><li> Bei der Anwendung der Überlagerung zum Monoschicht immer äquilibrieren heißen Agarose oder CMC in einem 56 ° C Wasserbad, um Schäden an der Monoschicht zu verhindern. Stellen Sie sicher, die Lösung ist warm, aber nicht zu heiß zum Anfassen, Zelltod und geringere virale Titer verhindern. Die meisten Agarose Overlays beginnt unter 42 ° C erstarren, arbeiten schnell und / oder bereiten kleinen Chargen, um eine Verfestigung zu verhindern, während der Handhabung. </li></ol></li><li> Nach Zugabe des Overlay, Inkubation Platten deutliche Plaques, die eindeutig zählbare zu produzieren. Plaquebildung kann dauern 2-14 Tage, je nach Virus analysiert, Tabelle 1. HINWEIS: Sobald Flüssigkeit übereinandergelegten Platten werden in den Inkubator gestellt, nicht bewegen. Bewegung der Flüssigkeit Overlays während der Inkubationszeit wird in geschmiertem Plaques führen. Agarose und CMC Overlays sind halbfeste und können verschoben oder periodisch unter einem Lichtmikroskop überprüft, um Plaqueentwicklung zu überwachen. </li></ol> 3. Fixierung und Färbung Cells <ol><li> Um die Zellen zu fixieren, abgießen oder absaugen Avicel-Overlay, und fixieren Zellen unter Verwendung des 10% Formaldehydlösung für 30 min über Nacht (&lt;1 ml pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte). <ol><li> Für Agarose oder CMC, direkt fügen Sie die Formaldehyd-Lösung, um die Überlagerung für 1 h bis über Nacht. HINWEIS: Die Proben können für längere Zeiträume in dem Fixiermittel gehalten werden, sofern sie dannnicht verdunsten und austrocknen, da dies die Monolage verzerren. </li></ol></li><li> Vor der Färbung und nach der Fixierung, entsorgen Sie die Formaldehyd und entfernen Sie die halbfesten Stecker für die Agarose und CMC entweder mit fließendem Wasser oder manuell mit einem Spatel. Spülen Avicel Plaques mit Wasser auf Rest Overlay / Fixiermittel vor der Färbung zu entfernen. </li><li> Zum Färben, decken die Zellen mit einer minimalen Menge an Kristallviolett-Lösung für ca. 15 min. Felsplatten, wenn notwendig, um eine gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Vorsichtig waschen den Kristallviolett-Färbung mit Wasser. Einmal fixiert, gefärbt und getrocknet, speichern Plaques auf unbestimmte Zeit für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. Bestimmung Virustiter <ol><li> Zählen Sie die Plaques in jeder Vertiefung, wobei die durchschnittliche für technische Wiederholungen des gleichen Verdünnung. Für große Plattenformate, Discount Brunnen mit weniger als 5 oder mehr als 100 Tafeln. Beachten Plaquegröße und Morphologie. Die Negativkontrolle sollte eine einheitliche Mono haben undals Referenzkontrolle verwendet werden. </li><li> Bestimmen Sie die virale Titer des Aktien Probe, indem die durchschnittliche Anzahl der Plaques für eine Verdünnung und dem Kehrwert der Gesamtverdünnungsfaktor. </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> HINWEIS: Als ein Beispiel, 30 und 32 Plaketten für Wiederholungen der 1 x 10 -7 Verdünnung [31 (Durchschnitt) / 10 -7 (Verdünnung) x 0,4 ml (Inokulum)] würde einen Titer von 7,75 erhalten x 10 8 pfu gezählt / ml.

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. 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D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Plaque-Assay liegt in der Optimierung des Protokolls für die bestimmte Viruskultur in Frage Bedingungen erheblich variieren kann. Wichtige Punkte zu berücksichtigen sind: Gastgeber zelluläre Verträglichkeit mit dem Virus in Frage, geeigneten viralen Wachstumsbedingungen, ausreichende Verdünnung reicht, um genau zu differenzieren Plaketten und korrekte Überlagerung Auswahl und Färbung für die Zellen und Viren im Frage. Während VEEV und RVFV sowohl unter sehr ähnlichen Bedingungen unter Verwendung von vielen der gleichen Wirtszellarten wachsen, Unterschiede in der Plaque-Morphologie und Wachstumskinetik erheblich variieren. Bei der Verwendung von Vero-Zellen für die Plaque-Assays, die traditionell als die Ausbreitung und die Indikator-Zelllinie für hämorrhagische Fieberviren und Alphaviren verwendet wurden, wächst VEEV typischerweise zu höheren Titern als RVFV und zeigt erhöhte Replikationskinetik, Entwicklung großer Uniform Plaques bei 48 hpi 4, 10-12. Im Gegensatz zu VEEV, RVFV erfordert 72 hpi und zeigt Plaques, die in der Regel wesentlich kleiner sind und in der Größe variabel. Im Gegensatz zu RVFV und VEEV ist das Influenza-Virus hochWirtsZelle spezifisch und können schwer durch Gewebekultur fortpflanzen. Für das Influenza-Virus, Viruseintritt und Fusion normalerweise durch die Bindung von Zelloberflächenrezeptors mit dem viralen Glycoprotein hamagglutinin (HA), die den Eintritt in die Zielzelle durch Bindung mit der Wirtszelle α-Sialinsäure-Oberflächenrezeptor vermittelt eingeleitet. HA ist ein Glykoprotein, das trimere im Membranhülle aller Influenza-Viren vorhanden ist und erfordert Spaltung in die Untereinheiten HA1 und HA2 durch eine spezifische Wirtszelle Protease. Um das Problem weiter zu komplizieren, können diese Schnittstellen oft schwanken zwischen Virusstämmen 13. Da die Expression von Proteasen spalten kann HA ist auf bestimmte Gewebe beschränkt, Proteasen are häufig Zellkulturmedien, um die viralen Fusion und den Eintritt in die ausgewählte Wirtszelle 13 zu erleichtern zugegeben. TPCK-Trypsin ist ein Beispiel eines üblicherweise verwendeten Protease, die in der Zellkultur sowohl mit MDCK und Vero-Zellen verwendet wird: Erleichtern Multizyklus-Replikation (in Ermangelung einer Trypsin zu inaktivieren Serum) durch die proteolytische Aktivierung der viralen HA 14,15. Wie in dieser Studie und andere zeigten, können Unterschiede in der viralen Lebenszyklen Overlay Selektionen, Plattenformate und Abholzeiten, mit erheblichen Abweichungen zwischen den unterschiedlichen Klassen und Arten von Viren beeinflussen. In unserer Studie zeigte Agarose Overlays klarer Plaques bei höheren Titern als entweder CMC oder flüssigen Overlays für beide RVFV und Influenza-B-Virus, Verstärkungs ihre Nutzbarkeit unter einer breiten Palette von Viren und Zelltypen. Mit einem niedrigen Endkonzentration von Agarose stark bei der Beseitigung der festen Stecker und vereinfachte Färbung unterstützt. CMC Gesamt demonstrierte die poorest Wirksamkeit als Overlay für alle drei getesteten Viren und produziert sehr klein und undeutlich Plaques für Influenza-B-Virus. Obwohl insgesamt CMC zeigten die am wenigsten wünschenswerte Eigenschaften, die Nutzung im schnell wachsenden und vorteil extrem virulenten Viren nachweisen konnten, wie es tat scheinen Plaquegröße mit nur einem minimalen Rückgang der Titer zu reduzieren. Die Flüssigkeit erwies sich als Überlagerung der vielseitigste daß sein war es extrem einfach herzustellen, erhöhte Leichtigkeit der Verwendung und war vergleichbar mit der in allen ausgewählten Viren Agarose. In einem höheren Durchsatz 96-Well-Platte-Format, Anlegen und Entfernen nicht aufgrund der Verfestigung wie bei herkömmlichen Überlagerungen verhindert wird, und sofern genaue und konsistente Ergebnisse. Eine Überlegung bei der Verwendung von flüssigen Überlagerungen liegt in der undurchsichtigen Färbung und die Unfähigkeit, die Plaquebildung zu überwachen, wenn die Platten nicht bis zum Sammelpunkt bewegt werden, begrenzen diese Anpassung an Viren mit bereits charakterisierten Replikationskinetik. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Kleinere Änderungen in der Plaque Assay-Bedingungen können die Ergebnisse erheblich verändern, und die Auswertung und Leistungsfähigkeit jedes neue System oder Technik ist immer gewährleistet. Während eine optimierte und standardisierte Plaque-Assay-Protokoll nicht für jede Situation gibt, unserem Bericht zeigen die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit in der traditionellen als auch neuen flüssigen Overlays für Plaque-Assays, während eine ausreichende Basis für weitere Benutzer Modifikationen.

Die genaue Trennung und Quantifizierung von lebensfähigen viralen Proben war stets eine laufende Forschungsziel in der Virologie. Es war nicht bis zum Aufkommen des Plaque-Test im Jahr 1952, die ein Mittel, um quantitativ und qualitativ zu berechnen Tier virale Titer wurde zuerst entwickelt, 1,2. Diese Technik wurde erstmals angepasst und aus Phagen-Assays, die zuvor verwendet worden war, um die Titer von Aktien Bakteriophagen in Pflanzenbiologie 1,2 berechnen modifiziert. Während alternative Mittel für virale Quantifizierung seit entwickelt und angepasst worden ist, wie Immunoassays, Fluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie, abstimmbaren resistive Erfassungsimpuls (TRPS), Durchflusszytometrie, rekombinante Reportersysteme und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) Diese Methoden versagen zu identifizieren und zu quantifizieren replikationskompetentem Vironen 1,3. Während Fortschritte in Technologien und Techniken weiter zu verfeinern und verändern die Landschaft; PLATEe-Assays weiterhin den Goldstandard bei der Bestimmung viralen Konzentrationen für Infektions lytische Vironen 1,4 darstellen. Während eines Plaque-Assays wird eine konfluente Monoschicht von Wirtszellen mit einem lytischen Virus unbekannter Konzentration, die in Reihe mit einem zählbaren Bereich zwischen 5-100 Virionen verdünnt wurde, typischerweise infiziert. Infizierten Monoschichten werden dann mit einem Immobilisierungsmittel Deckungsmedium bedeckt, um eine virale Infektion von wahllos Ausbreitung durch entweder die mechanische oder konvektiven Strömung des flüssigen Mediums während der Virusvermehrung verhindern. Während feste oder halbfeste Overlays wie Agarose, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose (CMC) haben traditionell verwendet worden, haben Flüssigkeitsüberlagerungen eine zunehmend attraktive Alternative mit der Entwicklung von neuartigen flüssigen Overlays werden wie Avicel 5- 7. Plaque Assays Flüssigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Overlays haben mehrere Vorteile, wie das Overlay kann applbei Raumtemperatur und Auftragen und Entfernen IED erheblich. Als flüssige Overlays nicht Erwärmung erfordern, kann zart und hitzelabilen Viren auch beweisen, leichter Plaque. Nach der Erstinfektion und Anwendung der immobilisierenden Overlay einzelnen Plaques oder Zonen der Zelltod wird, beginnen sich zu entwickeln, wie virale Infektion und Replikation in die Umgebung Monoschicht eingeschränkt. Infizierte Zellen wird die Replikation-Lyse-Infektionszyklus fortzusetzen, weitere Vermehrung der Infektion, was zu immer deutliche und diskrete Plaques. Je nach Virus Wachstumskinetik und Wirtszelle verwendet wird, eine sichtbare Plaques bilden normalerweise innerhalb von 2-14 Tagen. Cellular Monoschichten können dann mit einem Standard-Hellfeld-Mikroskop, um ohne weiteres zu identifizieren Plaques mit dem bloßen Auge gezählt werden, oder typischer fixiert und durch Neutralrot oder Kristall gewaltsamen gegengefärbt. Es gibt eine Vielzahl von Plaque Gegen Flecken vorhanden, die jeweils thEIR spezifische Vor- und Nachteile. Kristallviolett ist üblicherweise am Ort der Sammlung und nach der Fixierung / Entfernen der Auflage aufgenommen, wodurch eine rasche und ausgeprägte Gegenfärbung, die für die Identifizierung von sehr kleinen Plaques können, wenn gemischte Morphologie vorliegt. Neutral Rot hat den Vorteil der frühen Anwendung und ständigem Kontakt mit dem Overlay, so dass für die Live-Überwachung der Entwicklung von Plaque-Bildung, was besonders nützlich ist, wenn die Arbeit mit einem unbekannten Virus oder Replikationskinetik. Wir haben jedoch festgestellt, dass Färbung ist in der Regel nicht so deutlich bei der Verwendung von Neutralrot. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid (MTT) bietet einige Vorteile, da die gelben Farbstoff Flecken lebende Zellen dunkelblau und viralen Plaques können ohne Entfernen der Auflage angerechnet werden mit Neutralrot. Der hohe Kontrast zwischen lebenden und toten Zellen durch MTT ergab ermöglicht auch die Erkennung von kleinen Plaketten zu einem früheren Zeitpunkt nach der InfektionObwohl Speicher würde immer noch die Entfernung des Overlay-8 erforderlich. Als Kristallviolett können einfach in einer Lösung aus Wasser und Alkohol hergestellt werden und bietet ein hohes Maß an Sensibilität für gemischten Plaquemorphologie, haben wir es als eine bevorzugte und vereinfachte Gegenfärbung ausgewählt für das Protokoll gezeigt, wie wir nutzen mehrere Familien gut dadurch Viren. Nach Fixierung und Färbung der infizierten Zellmonolayer werden Plaketten um Virusstammproben im Hinblick auf die Plaque-bildenden Einheiten (PFU) pro Milliliter titrieren gezählt. Eine Protokollabfall sollte zwischen serielle Verdünnungen angemerkt werden, und je nach Plattengröße zwischen 5-100 Plaques gezählt, mit einer Negativkontrolle als Referenz verwendet. Statistisch Proben um 10% auf 100 Plaques gezählt beim Vergleich Probe repliziert 3 variieren. Der Vorteil der Verwendung von Plaque-Assays auf Virus-Titer zu bestimmen, liegt in ihrer Fähigkeit, die tatsächliche Anzahl der infektiösen Viruspartikel w quantifizierennnerhalb der Probe. Als mehrere Virionen könnte eine einzelne Zelle zu infizieren, ist die Terminologie der Einheiten über Virionen während der Plaque-Titration 1,2 verwendet. Plaquemorphologie können dramatisch unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und zwischen Virusspezies variieren. Plaquegröße, Klarheit, Grenz Definition und Verteilung sollten alle beachten, da sie wertvolle Informationen über die Wachstums- und Virulenzfaktoren des Virus in Frage stellen werden. Grundprinzipien Plaque-Assay kann auch angepasst und in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, wie beispielsweise bei der Verwendung der Schwerpunkt bildet Assays (FFAs) modifiziert werden. FFS nicht auf Zell-Lyse und Gegenfärbung verlassen, um die Plaquebildung zu erfassen, sondern beschäftigen Immuntechniken, um intrazelluläre virale Proteine ​​direkt zu erfassen durch getaggt Antikörper. Erhöhte Sensitivität, verringerte Inkubationszeiten nach Infektion und vor allem die Möglichkeit, zu quantifizieren nichtlytischen Viren sind alle verschiedenVorteile beim Einsatz von FFS. Während weit verbreitet, die kritischen begrenzenden Faktoren in FFAs gegenüber einem herkömmlichen Plaque-Assays besteht in der Notwendigkeit, geeignete Antikörper und die Fähigkeit, nur Sonde für die virale Proteinuntereinheiten und tatsächliche infektiösen Virionen 4. Für die Zwecke dieser Studie werden wir unsere Diskussion auf klassische Plaque-Assays zu begrenzen und die Verwendung von traditionellen festen und halbfesten Overlays (Agarose und CMC), zusammen mit neuen flüssigen mikrokristalline Cellulose-Overlays.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Plaque-Assays bleibt eines der genauesten Methoden zur direkten Quantifizierung von infektiösen Virionen und antivirale Substanzen durch die Zählung der einzelnen Platten (infektiöse Einheiten und zellulären Totzonen) in Zellkultur. Hier zeigen wir, wie man eine Grund Plaque-Test durchzuführen, und wie unterschiedliche Overlays und Techniken können die Plaquebildung und die Produktion auswirken. Regel feste oder halbfeste Overlay-Substrate, wie Agarose oder Carboxymethylcellulose, verwendet worden, um die Virusausbreitung zu begrenzen, verhindern, unterschiedslose Infektion durch das flüssige Wachstumsmedium. Immobilisiert Overlays beschränken Zellinfektion mit dem unmittelbar umgebenden Monoschicht, welche die Bildung von diskreten zählbaren Foci und die anschließende Bildung von Plaque. Um die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit traditionellen Overlays zu überwinden, ein neuartiges Flüssigkeitslagerung Verwendung mikrokristalliner Cellulose und Carboxymethylcellulose Natrium wurde zunehmend als Ersatz in der Standard verwendetPlaque-Test. Flüssig-Overlay Plaque-Assays können leicht in Standard 6 oder 12-Well-Platte Formate nach traditionellen Techniken durchgeführt werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung. Aufgrund seiner flüssigen Zustand und die anschließende einfache Anwendung und Entfernung kann Mikrokulturplattenformate alternativ als schnelle, präzise und mit hohem Durchsatz Alternative zu größeren Maßstab viralen Titrationen verwendet werden. Verwendung eines nicht beheizten viskose Flüssigkeit Polymer bietet die Möglichkeit, die Arbeit zu rationalisieren, schont Reagenzien, Inkubator Raum und erhöht die Betriebssicherheit, wenn in traditionellen oder High-Containment-Labors wie kein Reagenz Heizung oder Glaswaren verwendet benötigt werden. Flüssige Overlays kann sich auch als empfindlicher als traditionelle Overlays für bestimmte hitzelabilen Viren.

Die Fähigkeit von Plaque-Assays, genau zu beurteilen Virustiter beruht auf zahlreichen Faktoren: geeignete Wirtszelle Auswahl geeigneten Medien und Wachstumsbedingungen für die zelluläre und virale Lebensfähigkeit immobilisierten Virusausbreitung und eine genaue Bestimmung des viralen Inkubationszeit, um eine angemessene Zeit für verschiedene ermöglichen und zählbare Plaquebildung. Für diese Studie wurden Viren aus drei repräsentativen Familien gewählt, um Unterschiede in der zeigen: Overlay-Auswahl, Inkubationszeiten und Plaquemorphologie in unterschiedlichen Probenarten. Venezolanischen Pferde-Enzephalitis (VEEV) wurde als (+) ssRNA Virusmodell, das bedeutende Krankheit bei Equiden und Menschen verursachen und stellt die Familie Togaviridae ausgewählt. Influenza B Taiwan Stamm, einem segmentierten (-) ssRNA-Virus vor allem Menschen infizieren, stellt die Familie Orthomyxoviridae. Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), ein (-) ssRNA Arthropoden geboren Virus primär infizieren Arthropoden,Wiederkäuer und Menschen wurde als Vertreter der Familie Bunyaviridae ausgewählt. Für RVFV (Figur 1), wurden die Titer aus einer Stammlösung eines rekombinanten lebenden attenuierten Stamm von MP12 RVFV in einer 12-Well-Plattenformat unter Verwendung CMC, Agarose oder Avicel Overlays, die Seite-an-Seite für 72 Stunden nach der Infektion inkubiert wurden bestimmt (hpi). Ein Vertreter Schild mit Verdünnungen im Bereich von 10 -4 bis 10 -7 in Feld A. Plaques mit CMC zu sehen und Agarose Overlays zeigten kleine, klare und deutliche Plaques mit einem gut definierten Kreisgrenze. Plaques mit einer Flüssigkeit Overlay waren etwas reichlicher und im Vergleich zu Agarose und CMC Plaques größer, und lieferte eine weniger deutliche Grenze. Virustiter wurden in Tafel B mit allen Überlagerungen vergleichsweise Führen verglichen. Um eine klarere visuelle Vergleich zwischen Overlays für MP12 zusammen mit einer größeren Stichprobenumfang zu bestimmen Reproduk erhaltenbilität wurde eine 6-Well-Platte auch in dreifacher Ausführung (Abbildung 2) erprobt. In der 6-Well-Plattenformat, die Verwendung eines CMC-Overlay zeigten kleinere Plaques als entweder Agarose oder Flüssigkeitsüberlagerungen, die in der Größe miteinander vergleichbar waren. Während virale Titer waren ähnlich zwischen allen drei Überlagerungen (Tafel D), erwies sich Plaques in Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen gebildet leichter zu zählen wegen ihrer erhöhten Größe. Im Gegensatz RVFV, VEEV Titer und Plaquemorphologie zwischen den unterschiedlichen Überlagerungen stark variiert (3A). Plaques in CMC Overlays gebildet zeigte eine klare und deutliche Morphologie bei Verwendung einer 12-Well-Plattenformat, auf Kosten der Plaquegröße und Empfindlichkeit (Feld B). Im Gegensatz zu CMC, die Verwendung von Agarose und flüssigen Überlagerungen zu einer signifikant größeren Plaques, was geringere Virushemmung und erhöhte Empfindlichkeit gegen VEEV Replikation. Dieser wurde zuvor bestätigt, als allein zu vergleichen Agarose gegen CMC in apaper veröffentlicht von Juarez et al. 4. Während Agarose und Flüssigkeitsüberlagerungen erzeugt größere Plaques als CMC hatten die Plaques schlecht definierten Grenzen und waren schwierig, in einem 12-Well-Format zählen, mit flüssigem Overlays Erbringen der größten Grenzdiffusion. Wenn Plaques wurden in 6-Well-Platten (Abbildung 4) erprobt, negiert die größeren 6-Well-Format das Thema offenkundig großen Plaques, die schwer in der 12-Well-Format zu unterscheiden waren, mit Agarose und flüssigen Overlays beweisen besser als die CMC-Overlays in Bezug auf Plaque Definition und sensibel (4D). Im Vergleich zu RVFV oder VEEV bietet einige einzigartige Herausforderungen Influenza bei Plaquebildungs, wie das Erfordernis einer externen Protease. Die Empfindlichkeit des Influenza-Virus zu unterschiedlichen Overlay Auswahl wurde auch in der Vergangenheit gut dokumentiert als signifikante Veränderungen festgestellt wurden, wenn Änderungen so gering wie unterschiedliche Marken aus Agarose habenen verwendet 9. Interessant für das Influenza-B-Stamm Taiwan, die Verwendung von CMC als Overlay Folge deutlich kleinere Plaques, die schwer zu zählen sind, und erwies sich als schwierig, zuverlässig Note (5A). Die Verwendung eines Agarose-Overlay versehen die besten Plaques (Feld C) und ergab einen dunkleren Hintergrund-Färbung (wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Mono Lebensfähigkeit) und zeigte deutlicher und schärfer Plaques im direkten Vergleich zu der Verwendung des Flüssigkeitsüberlagerung (Feld B ). Ein deutlicher Vorteil von flüssigen Polymeren auf festen und halbfesten Overlays, wie Agarose und CMC, liegt in der Leichtigkeit der Entfernung und Anwendung. Halbfesten Overlays erfordern Heizung und Verfestigung kann problematisch erweisen bei der Handhabung und Beseitigung. Um diese Vorteile zu nutzen und die Praktikabilität der Verwendung von Avicel in einem Hochdurchsatz Weise RVFV zu bestimmen, wurde eine 96-Well-Platte-Format bei unterschiedlichen Lagerungs concentrati trialedons (Abbildung 6). Für RVFV MP-12 wurden in vierfacher Verdünnungen an beiden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel geführt. Overlay Anwendung und Entfernung erwies sich als einfach, ohne erkennbare Unterschiede zwischen den Wiederholungen oder zwischen Konzentrationen festgestellt, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit. Beim Vertonen waren Plaques deutliche und zählbaren mit dem bloßen Auge, die Machbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurch Weise RVFV. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Fig. 1: RVFV Plaque Overlay Vergleiche unter Verwendung 12-Well-Platten wurden bei Veros 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC (c endgültigenoncentrations) wurden um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Fig. 2: RVFV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von MP12 infiziert. Drei ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie in Panel A gezeigt, wurden B und C. Separate Experimente identisch durchgeführt wie für Panels AC beschrieben mit Plaques gezählt und in Feld D (N = 3) titriert. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Figur 3: &lt;strong&gt; VEEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 12 Vertiefungen. Veros wurden bei 2,5 x 10 5 Zellen in 12-Well-Platten plattiert und mit 200 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe des VEEV TC-83-Impfstoff-Stamm infiziert. Nach der Infektion 1,5 ml Overlays von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet wie im Feld A. Plaques nachgewiesen wurden gezählt und in Feld B titriert <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Fig. 4: V EEV Plaque Overlay Vergleiche Verwendung Platten mit 6 Vertiefungen Veros wurden bei 5 × 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe VEEV TC-83 infiziert. Nach der Infektion 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder eine 1% CMC wurden, um direkt vergleichen die Overlays angewendet als nachgewiesenin den Feldern A, B und C wurden Separate Experimente identisch durchgeführt wie bei den Feldern A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Figur 5: Influenza Plaque Overlay Vergleiche MDCK-Zellen wurden mit 5 x 10 5 Zellen in 6-Well-Platten plattiert und mit 400 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe von Influenza B Taiwan infiziert.. Kein fötales Rinderserum (FBS) wurde in das Wachstumsmedium oder Überlagerungen verwendet werden, wie FBS kann Influenza Ausbreitung durch Inhibition von bestimmten Proteasen, die für die Virusfusion erforderlich hemmen. TPCK-Trypsin, um virale Fusion und die Eingabe mit den Wirtszellen zu erleichtern, um alle Überlagerungen vor der Anwendung hinzugefügt. Nach der Infektion wurden 3 ml Überlagerungen von 0,3% Agarose, 0,6% Avicel, oder 1% CMC, um direkt zu vergleichen angewendetdie Symbole wie in Panel A, B und C. Getrennte Experimente zeigten, wurden identisch durchgeführt wie in Panel A beschrieben - C, mit Plaques gezählt und in Tafel D titriert (N = 3). Während ein durchschnittlicher wurde für CMC Plaques ergriffen sie erwies sich als schwierig, um zuverlässig zu zählen, wie sie diffuse Grenzen und sehr kleine Plakette Größen demonstriert. <img alt="Figur 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Fig. 6: Hochdurch Plaque Overlays Eine Platte mit 96 Vertiefungen ausplattiert der Veros bei 3 x 10 4 Zellen pro Well wurden mit 50 &amp; mgr; l Inokulum unter Verwendung der gleichen Reihe verdünnt Ausgangsprobe RVFV MP12 für 1 Stunde infiziert, in vierfacher Ausfertigung. Für die Überlagerungen wurden 0,6 und 1,2% Endkonzentrationen von Avicel, um die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit der Verwendung flüssigen Overlays in einem Hochdurchsatz-Weise Panels A und B zu bestimmen erprobt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plaque-Assay Inokulation Bedingungen und Zelltypen <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zellen-Art </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Wachstumstyp</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plaque Medien </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin ergänzt. 2. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit 1% L-Glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml ergänzt. A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% Natriumpyruvat (5 ml), 1% L-Glutamin (5 ml) ergänzt, 2% Pen / Strep (10 ml). B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) mit 0,2% Rinderserumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, Trypsin-TPCK ergänzt * * Kurz vor der Zubereitung, fügen 1 ul pro 25ml 2 ug / ml Bestand TPCK-Trypsin zu dem aliquoten Sie verwenden werden, um mit Agarose für Plaques mischen. Tabelle 2: Plaque und Viral / Zellwachstum Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Zelltyp </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Infektionsperiode </td><td> 1 Stunde </td><td> 1 Stunde </td><td> 45 min </td></tr><tr><td> Inkubationszeit </td><td> 3 Tage </td><td> 2 Tage </td><td> 3 Tage </td></tr></tbody></table> Overlay-Lösungen wird nicht erlöschen, wenn gemacht, so lange, wie die Sterilität erhalten bleibt. Tabelle 3: Overlays Lizenz <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 gut </td><td> 12 gut </td><td> 96 gut </td></tr><tr><td> Anzahl der Zellen / Vertiefung </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2,5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Volumen Innokulum (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Volumen von Overlay (ml) </td><td> 3 </td><td> 1,5 </td><td> 0,100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Plattenformate

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.1K Aufrufe.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Serie: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Plaque-Assay für Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.