Die Arbeit in unserem Labor wird von einem VIDI Zuschuss von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (zu DJS) finanziert. Wir danken Marc Stuart und der Abteilung für Elektronenmikroskopie an unserer Universität, für die Unterstützung bei und den Zugang zu dem Transmissionselektronenmikroskop.

Untagged FtsZ Proteine ​​wurden wie zuvor beschrieben gereinigt, 11,15, gegen 20 mM Tris / HCl (pH 7,9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2,5 mM MgAc und 10% Glycerol dialysiert und bei -80 ° C gelagert Unter diesen Bedingungen kann das Protein für mehr als 2 Jahren ohne signifikanten Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Das Protein ist in 100 &amp;mgr; l Aliquots gelagert werden, Auftauen und Einfrieren der Probe zu vermeiden. Nach dem Auftauen kann die Probe bei 4 ° C für maximal eine Woche lang werden. FtsZ ist bei hohen Konzentrationen löslich und kann bei 7-10 mg / ml aufbewahrt werden. Es ist wichtig, um die Proteinkonzentration hoch zu halten, um unerwünschte Effekte der Speicherpufferkomponenten in späteren Experimenten vermeiden. Somit sollte Speicherkonzentration für eine Verdünnung von FtsZ von mindestens 10x ermöglichen Glycerinkonzentration unter 1% zu bringen und die Konzentration der anderen Komponenten der Dialysepuffer in der Reaktionsmischung zu minimieren. FtsZ Polymerisation kann auch durch die Anwesenheit von hohen Natrium 9 betroffen </sup&gt; oder Imidazol-Konzentrationen so müssen diese Komponenten aus der Polymerisation Puffer entfernt werden. SepF wurde, wie beschrieben und in 7 Elutionspuffer bei -80 ° C gelagert gereinigt Alternative veröffentlichten Verfahren zur Reinigung von FtsZ aus E. coli und B. subtilis sowie Hinweise zu den Verfahren zur Reinigung von FtsZ aus verschiedenen Quellen sind in Tabelle 1 zusammengefasst (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt). 1. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten Polymerisation Puffer: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 50 mM MES / NaOH, pH 6,5 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 50 mM KCl </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 50 mM Hepes / NaOH, pH 7,5, 300 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 25 mM PIPES / NaOH, pH 6,8, 300 mM KCl </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 50 mM MES / NaOH, pH 6,5, 300 mM KCl </td></tr></tbody></table></li><li> Filter sterilisieren alle Puffer mit einer 22 um Membranfilter. </li><li> Bereiten 100 mM GTP, GDP und MgCl 2 Stammlösungen in jeder Polymerisation Puffer aus (1). </li><li> Preclear Proteine ​​durch Zentrifugieren bei 100.000 g für 20 min bei 4 ° C für alle Experimente. </li></ol> 2. FtsZ Sedimentation Assay <ol><li> Bereiten Sie die Reaktionsmischung durch Zugabe von MgCl 2 und FtsZ zu einem der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung Punkt 1) in Rohren mit Highspeed-Zentrifugation kompatibel. Gesamtvolumen sollte 49 &amp;mgr; l bei 12 &amp;mgr; M in 50 &amp;mgr; l Endvolumen zu sein, mit MgCl &amp;sub2; auf 10 mM und FtsZ. </li><li> Pschnüren das Rohr in einem Inkubator mit Schüttelfunktion, Inkubation für 2 min bei 30 ° C bei 300 rpm (alternativ kann die Probe leicht schnippte und kurz mikrozentrifugiert durch Vorwärmen bei 30 ° C, gefolgt). </li><li> Starten der Polymerisation durch Zugabe von 1 &amp;mgr; l GTP oder GDP-Stammlösung in dem gleichen Puffer wie im Experiment (Endkonzentration 2 mM) verwendet. Inkubation für 10 min oder 2 (für Puffer mit 50 mM KCl und 300 mM KCl, jeweils) bei 30 ° C mit 300 Upm (oder in einem Inkubator unter Schütteln Funktion). </li><li> Übertragen Sie die Rohre auf einer Ultrazentrifuge Rotor-und Spin-down für 10 min bei 350.000 xg (89.700 rpm für TLA 120.1 Rotor) bei 25 ° C </li><li> Nach dem Spinnen sorgfältig die Rohre zu entfernen aus dem Rotor und sofort den Überstand in ein sauberes Röhrchen. Vorbereitung Proben für SDS-PAGE durch Zugabe von 20 &amp;mgr; l Überstand und 20 ul 2x Probenpuffer. Die Mischung 10 min bei 98 ° C. </li><li> In 50 ul 2x Probenpuffer zum Pellet Fraktion, Ftsz Polymere. Legen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in einem 2-ml-Tube. Das Pellet durch Kochen für 10 min bei 98 ° C, dann fügen Sie 50 ul demineralisiertem H 2 O, um die Probe die gleiche 2x Verdünnung als Überstand Probe zu machen. </li><li> Drehen Sie den Ultrazentrifugenröhrchen kopfüber in der 2-ml-Tube und Spin-Down für 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 18.000 x g. Entfernen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen aus der 2-ml-Tube. </li><li> Last 10 &amp;mgr; l jedes Überstands-und Pelletprobe nebeneinander auf einem 10% SDS-PAGE-Gel. Führen Sie das Gel bei 150 V </li><li> Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue G-250 und halten für die Quantifizierung. </li></ol> 3. FtsZ Sedimentation Assay bei Slow-Spin <ol><li> Bereiten Polymerisation Lösung wie in Schritt 2, fügen SepF und / oder FtsZ (Endkonzentration 12 uM). Diese Versuche können in Beckman Einweg 1,5-ml-Röhrchen in Kombination mit einem Rotor TLA-55 durchgeführt werden. </li><li> Das Röhrchen wird in einem Brutschrank unter Schütteln funktion und Inkubation für 2 min bei 30 ° C bei 300 UpM. </li><li> Starten der Polymerisation durch die Zugabe von 1 &amp;mgr; l GTP oder GDP aus einer Stammlösung (Endkonzentration 2 mM), Inkubation für 20 min bei 30 ° C bei 300 UpM. </li><li> Spin down für 15 min bei 24.600 xg (20.000 rpm für TLA 55 Rotor) bei 25 ° C </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Überführung in ein sauberes Röhrchen, nehmen Sie 20 ul und Transfer in 20 ul 2x Probenpuffer. Die Mischung 10 min bei 98 ° C. </li><li> Dann werden 50 ul 2x Probenpuffer zu pelletieren Fraktion enthaltende Polymere und resuspendieren durch Kochen für 10 min bei 98 ° C, 50 &amp;mgr; l demineralisiertem H 2 O. </li><li> Last 10 &amp;mgr; l jedes Überstands-und Pelletprobe nebeneinander auf einem 10% SDS-PAGE-Gel. Führen Sie das Gel bei 150 V </li><li> Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue G-250 und halten für die Quantifizierung. </li></ol> 4. Die Quantifizierung der FtsZ Sedimentation Assays <ol><li> Machen Sie ein Foto des Coomassie stained Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem (zB LAS-4000, Fujifilm). </li><li> Öffnen Sie das Bild in einem Gel eignet sich für densitometrische Analyse von Gelen (zB AIDA Bildanalyseprogramm (Raytest))-Programm und zu beschreiben Analyse in diesem Programm unten. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Auswertung&quot; in der Symbolleiste. </li><li> Wählen Sie die &quot;2D-Densitometrie&quot; aus der Liste und klicken Sie auf OK. </li><li> Im Hauptmenü, klicken Sie auf &quot;Auswertung&quot; und wählen Sie die &quot;Region Bestimmung&quot;-Eintrag. </li><li> Um eine Region auf dem Gel zu erstellen, klicken Sie auf das Symbol der Auto-Kontur-Werkzeug in der Region Bestimmung Toolbox. </li><li> Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Protein-Bande auf dem Gel, halten Sie die Maustaste gedrückt und ziehen Sie es an die gewünschte unteren rechten Ende der Band und lassen Sie die Maustaste los. </li><li> Filter jeweils FtsZ / SepF Band in der gleichen Weise. </li><li> Alle Informationen über die Bewertung der zugeordneten Bereiche können in der Region Bericht. Um die Regio erhaltenn Bericht auf die Schaltfläche &quot;Region anzeigen Report&quot; in der Region Bestimmung Toolbox. </li><li> Um den Bericht zu exportieren, auf dem Hauptmenü, klicken Sie auf Datei und wählen Sie &quot;Export à 2D-Region Report&quot;-Eintrag. </li><li> In der Region Bericht sollte die Intensität von jedem erstellt Region. Der prozentuale Anteil an Protein (FtsZ, regulatorische Protein) im Pellet mit den Intensitätswerten aus dem Bericht. </li></ol> 5. 90 °-Lichtstreuung <ol><li> Schalten Sie einem Fluoreszenzspektrometer (zB AMINCO-Bowman Series 2), die Lampe zum Aufwärmen für mehrere Minuten, um Temperaturschwankungen zu vermeiden und drehen auf einem umlaufenden Wasserbad auf die Küvette Raumtemperatur bei 30 ° C zu halten </li><li> Bestimmen die Betriebsparameter des Spektrometers: Hochspannungsdetektor 300 V, Emissions-und Anregungswellenlänge: 350 nm, Spaltbreite: 4 nm aufweist. Beachten Sie, dass viele Spektrometer das Signal automatisch einstellen zu Beginn eines Experiments zu einer certain Prozent (z. B. 60%) der maximalen. Dies führt zu einer Streusignal, so bald wie GTP wird hinzugefügt, um FtsZ polymerisieren außer Reichweite zu gehen. Es ist ratsam, zunächst die richtige Signalverstärkung-Detektor-Hochspannung für die maximale Polymerisation zu etablieren, bevor eine Reihe von Experimenten. </li><li> Programmieren Sie eine Datenerfassungs-Protokoll. Wählen zeitbasierte Erfassung, mit einer Dauer von 3,600 Sekunden. </li><li> Ein Fluoreszenz-Küvette sorgfältig reinigen mit Wasser und Ethanol, falls erforderlich-beschallen im Wasserbad bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Protokoll Küvetten mit einer Weglänge von 1 cm und einer 200 &amp;mgr; l-Volumen verwendet wurden und in der Speicherlösung (0,5-1% Hellmanex) gespeichert. Als Alternative können einzelne Verwendung UV-kompatiblen Kunststoffküvetten (UVette, Eppendorf) verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie 294 ul einer Master-Mix der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung Punkt 1) mit 10 mM MgCl 2 und 12 uM FtsZ als endgültige Konzentration für 300 ul berechnet und VORTex. </li><li> Transfer 196 ul der Polymerisation Puffer in die Küvette und es in Spektrometers. Inkubation für 2 min bei 30 ° C. </li><li> Starten Sie die Datenerfassung und warten 90 Sekunden um sicherzustellen, dass das Signal stabil ist. </li><li> Hinzufügen von 100 &amp;mgr; l 4 mM GTP oder GDP (Endkonzentration: 2 mm), um einen endgültigen Reaktionsvolumen von 200 &amp;mgr; l zu erreichen, und Abpipettieren mit einem größeren Volumen Pipette zu mischen und wieder Erfassung. </li></ol> 6. Transmissionselektronenmikroskopie <ol><li> Proben nach Vorschrift vorbereiten für die FtsZ Sedimentation Assay (das Volumen auf 10 ul endgültige Volumen reduziert werden, um Material zu sparen). </li><li> Nach der Inkubationszeit gelten 2 ul der Probe auf einem Schein-entladen 400 mesh Kohlenstoff beschichteten Kupfernetz, die Proben für 15 Sekunden. </li><li> Tupfen Sie das Gitter trocken durch leichtes Berühren oder ziehen das Netz parallel oder senkrecht auf ein Stück Filterpapier. </li><li> Färben Sie das Raster mit 4 ul einer 2% Uranyl-Acetat-Lösung. Blot das Raster trocken wie in Schritt 6.3 beschrieben. </li><li> Sehen Sie das Gitter in einem Philips CM120 Elektronenmikroskop bei 120 kV bei 39.200-facher Vergrößerung. </li></ol> 7. GTP-Hydrolyse-Assay Der Aufbau des Experiments ist in der Weise, dass die GTP-Hydrolyse von FtsZ nach verschiedenen Reaktionszeiten, indem die Reaktion mit Malachitgrün gestoppt gestalten. Auf diese Weise ist die Zeit der Farbentwicklung von Malachitgrün die gleiche für jede Probe. <ol><li> Bereiten Sie 1,5 ml 2 mM GTP in einem der Polymerisation Puffer (siehe Probenvorbereitung, Punkt 1). Bereiten Sie eine 0-40 uM Phosphat Standardverdünnungspuffer in einer Polymerisation und bereiten Arbeits Malachitgrün-Reagenz in der POMG-25H (Bio-Assays) Kit beschrieben. Alternativ können Arbeitsreagenzien im Haus nach durch Lanzetta et al. Protokolle 16 beschrieben vorbereitet werden </li><li> Bereiten Master-Mixe in einem Gesamtvolumen 360 ul: <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Ich </td><td> 24 uM FtsZ Bs, 20 mM MgCl 2, Polymerisationspuffer </td></tr><tr><td> II </td><td> 12 uM FtsZ Ec, 20 mM MgCl 2, Polymerisationspuffer </td></tr><tr><td> III (Kontrolle 1) </td><td> 24 uM FtsZ Bs, 2 mM EDTA, Polymerisationspuffer </td></tr><tr><td> IV (Kontrolle 2) </td><td> 12 uM FtsZ Ec, 2 mM EDTA, Polymerisation Puffer </td></tr></tbody></table></li><li> Je 20 ul Aliquots der Master-Mixe, 100 ul Phosphat-Standards und 180 ul von 2 mM GTP in einem qPCR 96-Well-Platte in der folgenden Reihenfolge: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td><td> E </td><td> F </td><td> G </td><td> H </td></tr><tr><td> 1 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td&gt; <td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 2 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 3 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 4 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 5 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 6 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 7 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 8 </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 9 </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 10 </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 11 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td><td> GTP </td></tr></tbody></table> PS - Phosphat-Standard </li><li> Legen Sie die qPCR Platte in einer PCR-Maschine mit dem Programm, um 40 min-Takt auf 30 ° C eingestellt </li><li> Es werden 20 ul Aliquots von malachite grünen Arbeits Reagenz in einer 96-Well-Platte. Man gibt 60 &amp;mgr; l der Polymerisation Puffer aus dem Experiment Spur 1&#39;-8 &#39;. Die Probe wird verdünnt 4x im Vergleich zu den Phosphat-Standard werden, beachten Sie bitte diese Tatsache während der abschließenden Berechnungen. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td><td> E </td><td> F </td><td> G </td><td> H </td></tr><tr><td> 1 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 2 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 3 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 4 &#39; </td> &lt;td&gt; III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 5 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 6 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 7 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 8 &#39; </td><td> III </td><td> III </td><td> Ich </td><td> Ich </td><td> IV </td><td> IV </td><td> II </td><td> II </td></tr><tr><td> 9 &#39; </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr><tr><td> 10 &#39; </td><td> PS </td&gt; <td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td><td> PS </td></tr></tbody></table></li><li> In 20 ul von GTP zu Spur 1, Pipette auf und ab zu mischen, Timer starten (dies ist der Startzeitpunkt für die 30-min-Reaktion). </li><li> Nach 10 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 2, Pipette auf und ab zu mischen (20 min Reaktion). </li><li> Nach 16 min hinzufügen GTP zu Spur 3, Pipette auf und ab zu mischen (15 Min. Reaktion). </li><li> Nach 21 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 4, Pipette auf und ab zu mischen (10 min Reaktion). </li><li> Nach 25 min hinzufügen GTP zu Spur 5, Pipette auf und ab zu mischen (7 min Reaktion). </li><li> Nach 27 min, 30 sec hinzufügen GTP zu Spur 6, Pipette auf und ab zu mischen (5 min Reaktion). </li><li> Nach 29 min hinzufügen GTP zu Spur 7, Pipette auf und ab zu mischen (4 min-Reaktion) .. </li><li> Nach 30 min Transfer 20 ul von Bahn 1 in Spur 1 &quot;, einer Pipette auf und ab zu mischen (Ausgangspunkt von Malachitgrün Farbentwicklung für die drei0 min-Reaktion). </li><li> Nach 30 min, 30 sec Transfer 20 ul von Spur 2 bis 2 &#39;, Pipette auf und ab zu mischen (Ausgangspunkt von Malachitgrün Farbentwicklung für die 20-min-Reaktion). </li><li> Wiederholen Sie den Schritt für alle 30 Bahnen 3-7 sek. </li><li> Nach 33 min, 30 sec mit 20 ul von GTP zu Spur 8, Pipette auf und ab zu mischen und übertragen 20 ul zu Spur 8 &#39;, Pipette auf und ab, um zu mischen (0 min-Reaktion und Startzeitpunkt für Malachitgrün Farbentwicklung Die Reaktion). </li><li> Nach 34 min werden 80 ul von Spur 9-9 &#39;, Pipette auf und ab zu mischen (den Startzeitpunkt für Malachitgrün Farbentwicklung für die Phosphat-Standard 1). </li><li> Nach 34 min 30 sec Transfer 80 ul von Spur 10 bis 10 &quot;, einer Pipette auf und ab zu mischen (den Startzeitpunkt für die Malachitgrün Farbentwicklung für die Phosphat-Standard 2). </li><li> Entfernen Sie alle Luftblasen aus den Proben und Inkubation der Platte bei Raumtemperatur für weitere 25 min30 sek. </li><li> Die Platte wird in 96-Well-Plattenlesegerät. </li><li> Nach 60 min messen die Platte 10x alle 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 630 nm (Malachitgrün Farbentwicklung ist jetzt 30 Minuten für die erste Reaktion). Jede Messung entspricht jedem Zeitpunkt aus den Schritten von 7,6 bis 7,12 und 7,16 und muss während einer Datenanalyse gesondert berechnet. </li><li> Berechnen Sie die freie Phosphat in jeder Probe unter Verwendung des Standard-Phosphat-Eichkurve. </li><li> Zeichnen Sie die Daten als Phosphat Freisetzung über die Zeit, und berechnen Sie die FtsZ GTP-Hydrolyse-Aktivität aus dem linearen Bereich der Kurve. </li></ol>

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Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).</li><li>Ray, S., Kumar, A., Panda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+regulates+the+interaction+between+MciZ+and+FtsZ:+a+possible+role+of+MciZ+in+bacterial+cell+division.">GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division.</a> Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).</li><li>Rivas, G., Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnesium-induced+linear+self-association+of+the+FtsZ+bacterial+cell+division+protein+monomer.+The+primary+steps+for+FtsZ+assembly.">Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly.</a> J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).</li><li>Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+FtsZ+protofilament+formation.">Structural insights into FtsZ protofilament formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Lowe, J., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+bacterial+cell-division+protein+FtsZ.">Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ.</a> Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).</li><li>Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+SOS+cell+division+inhibitor+SulA+and+in+complex+with+FtsZ.">Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).</li><li>Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+dynamics+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ.">Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).</li><li>White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+polymerization+of+Mycobacterium+tuberculosis+FtsZ.">Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.</a> J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).</li><li>Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+conformational+variability+of+FtsZ.">Structural insights into the conformational variability of FtsZ.</a> J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).</li><li>Thanbichler, M., Shapiro, L. M. i. p. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter.">a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li><li>Buske, P. J., Levin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+C+terminus+of+bacterial+cytoskeletal+protein+FtsZ+plays+fundamental+role+in+assembly+independent+of+modulatory+proteins.">Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins.</a> J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).</li><li>Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+FtsZ+assembly+by+light+scattering+and+determination+of+the+role+of+divalent+metal+cations.">Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations.</a> J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, die eine schnelle Analyse der FtsZ-Aktivität und seine Wechselwirkung mit anderen Proteinen ermöglicht. Lichtstreuung, Sedimentation und GTPase Assays sowie Elektronenmikroskopie wurden häufig verwendet, um FtsZ Polymerisation zu untersuchen. Wir haben einige Verbesserungen an bestehenden Protokollen gemacht, zeigten wir den Einfluss verschiedener Bedingungen auf FtsZ Montage, und wir schlagen Steuerelemente, die in FtsZ Studien aufgenommen werden sollten. Wir stellen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, die von der Verbindung zwischen FtsZ und seine interagierenden Proteinen aus FtsZ Polymeren gebildet große Strukturen zu unterscheiden. Diese Methode zeigt zwei Vorteile gegenüber dem Standard-Sedimentation Assay. Zunächst wird kein Hintergrund der FtsZ Polymere in der Pelletfraktion gebildet, da sie nicht nach auf 24.600 x g zentrifugiert. Zweitens kann die Menge des in der FtsZ mit einem interagierenden Protein gebildete Struktur vorhanden aus dem Gel berechnet. Zwei kritische Schritte in diesem Verfahren sind die INCUBATIonen-Zeit und die GTP-Konzentration. Es ist wichtig, um die große Proteinstruktur zu zentrifugieren, wenn es abgeschlossen ist, aber bevor es zerlegt, wenn alle GTP hydrolysiert. Die beste Kontrolle für diese Studie ist die Polymerisation von FtsZ mit BIP. Es ist eine mögliche Beschränkung des Assays. FtsZ bildet einen stabilen Komplex mit SepF, die leicht nach unten auf 24.600 x g gesponnen werden kann. Wenn die Sedimentation mit einem anderen Aktivierungsmittel oder ein Medikament, das FtsZ Polymere Bündel durchgeführt wird, kann es notwendig sein, um den Assay anzupassen. Es kann durch Änderung der Inkubationszeit oder der Erhöhung der Geschwindigkeit der Zentrifugation erfolgen. Die richtige Vorbereitung der Probe ist das wichtigste für Lichtstreuung wichtig. Proteine ​​müssen von Spinnvorgeklärt werden, und alle Puffer sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Wenn irgendwelche Aggregate in der Probe vorhanden sind, werden sie eine von FtsZ Polymere erhalten stabiles Signal zu stören. Für die Analyse der FtsZ Strukturen durch Elektronenmikroskopie wurde die Herstellung eines Gitter is die wichtigste Schritt. Die Zeit der Inkubation Probe auf dem Gitter wird die Wirkung der Herstellung von mehr oder weniger verdichtet Polymere. Zum Bündeln von FtsZ Bs, muss die Inkubationszeit kürzer als für FtsZ Ec und FtsZ Bs bei hohen KCl-Konzentration sein. Wir verwendeten eine Konzentration von 12 &amp;mgr; M für jede Probe, um die Ergebnisse zu vergleichen. Für FtsZ Bs bei 50 mM KCl eine untere FtsZ Konzentration verwendet werden, wie 12 &amp;mgr; m führte zu einer vollständigen Sättigung des Gitters. Dies macht die Polymere hoch verdichtet und schwer zu erkennen. Weniger verdichtet Polymere sind besser, sich auf EM zu erkennen. Die GTPase-Assay ist der einzige Versuch verwendet, um die Aktivität anstatt den Strukturen FtsZ studieren. Mg 2 + ist für die GTP-Umsatz in FtsZ Polymere erforderlich. Somit wird in der Abwesenheit von Mg 2 +, FtsZ nicht hydrolysieren GTP. Daher ist eine Probe ohne Mg 2 + die richtige Kontrolle in diesem Assay jedoch Kationen Mg vorhanden sindFtsZ in der Speicherpuffer. Sie können durch Zugabe von 1 mM EDTA mit der Kontrollprobe entfernt werden. Der kritische Schritt in diesem Assay ist die Inkubationszeit. Es ist wichtig, FtsZ-Aktivität nach einer bestimmten Zeit zu stoppen. Dies wird durch die Übertragung der Probe auf ein FtsZ Malachitgrün-Lösung in einer 96-Well-Platte erreicht. Jedoch ist die Entwicklung von Malachitgrün Farb ein kontinuierlicher Prozess. Somit müssen die Messungen in der gleichen Zeit für jede Probe entnommen werden. Mit einem gut geplanten GTP-Protokoll zusätzlich mit Messungen auseinander in einer festgelegten Reihenfolge genommen jede 30 Sekunden, ist es möglich, die gleiche Inkubation und Probenbearbeitungszeit für jeden Zeitpunkt zu erhalten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Wahl der Konzentration des Proteins, für das Experiment. Bei dem Experiment verwendeten wir zwei unterschiedliche Konzentrationen für FtsZ Ec und FtsZ Bs. GTP-Hydrolyse ist viel schneller für FtsZ Ec Vergleich zu FtsZ Bs. Die GTPase-Aktivität von FtsZ Ec unter gewählten Bedingungen und12 uM linear ist nur für maximal 5 min und nach dieser Zeit der Hydrolysegeschwindigkeit Plateaus. Somit ist es schwierig, Daten aus dem Experiment zu interpretieren, wenn sie unter diesen Bedingungen durchgeführt. In diesem Fall muss FtsZEc bei niedrigeren Konzentration als FtsZ B verwendet werden, um Aktivitäten der beiden Proteine ​​zu vergleichen. Die GTPase-Aktivität von FtsZs aus verschiedenen Quellen kann variieren. Somit muss die richtige Konzentration ausgewählt werden. Die Konzentration für FtsZ Polymerisation sollte deutlich über der kritischen Konzentration (in der Regel 2,5 bis 10 uM) sein. Die Dynamik FtsZ Montage und Demontage ist auch wichtig. Einige Proteine ​​zeigen eine signifikante Verzögerung in der Polymerisation nach Zugabe von GTP, wie FtsZBs bei 50 mM KCl gezeigt. Es ist nützlich, um die Lichtstreuungstest vor der GTPase-Assay durchzuführen, um die Zeit der Montage und Demontage von FtsZ Polymere nähern. Danach kann die Inkubationszeit und der Konzentration des Proteins ausgewählt werden. Da die für FtsZ p gewählten Bedingungenolymerization entscheidend sind, ist es wichtig, den richtigen pH-Wert und KCl-Konzentration in den einzelnen Verfahren zu benutzen. In dieser Arbeit untersuchten wir 9 verschiedene Puffer mit einem pH im Bereich von 6,5 bis 7,5 und KCl-Konzentrationen von 0 M bis 300 mM. Wir haben festgestellt, dass die beste Voraussetzung, um FtsZs von B. analysieren subtilis und E. coli und ihre biologische Aktivität bei einem pH, die nahe physiologischer Ebene (7.5) zusammen mit einer hohen KCl-Konzentration. Bei einer hohen KCl-Konzentration hat FtsZ eine höhere GTPase-Aktivität und produziert Polymere, die besser durch Elektronenmikroskopie nachweisbar sind. Wir haben auch bestätigt, dass der physiologische pH-Wert und eine hohe KCl-Konzentration besser für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen FtsZ und regulatorische Proteine ​​als alle anderen Puffer verwendet werden, um hauptsächlich FtsZ Anordnung studieren. FtsZBs zeigt eine ähnliche Aktivität wie FtsZEc bei hohen KCl-Konzentration untersucht. Zusätzlich zu niedrigen Salzkonzentration der Einfluss des pH-Wertes ist besser sichtbar als in den Puffer mit hoher Salzkonzentration. FtsZ sometimes bei Verwendung von Puffer ohne KCl, fällt als Ergebnis sollte Puffer ohne Salz vermieden werden. Sedimentation von FtsZ Polymere ist niedrig, wenn unter Verwendung von Puffern mit hoher KCl-Konzentrationen. Dies kann ein Vorteil, wenn das Studium Wechselwirkungen zwischen FtsZ und Proteine, die FtsZ Filamente wie SepF und ZAPA montieren, da diese Strukturen höherer Ordnung sind einfach, mit Zentrifugation erkennen. In allen unseren Experimenten verwendeten wir MgCl 2 bei einer Konzentration von 10 mM. Es wurde gezeigt, dass ein relativ hoher Mg 2 +-Konzentration stabilisiert FtsZ Polymeren und verringert die GTPase-Aktivität von FtsZ. In Tabelle 2 sind Ergebnisse aus verschiedenen Studien zusammengefasst beschreiben FtsZ Polymerisation und GTPase-Aktivität bei unterschiedlichen Mg 2 +-Konzentrationen mit sonst gleichen Pufferbedingungen 27. Die gemessene Konzentration der freien zytoplasmatischen Mg 2 + ist 0,9 mm 3. Es sollte bemerkt werden, dass GTP wird eine äquivalente Menge von Mg 2 + chelatieren. Dos, die optimale Mg 2 +-Konzentration für GTPase Experimente rund 2-2,5 mM, die in der Nähe physiologischer Ebene 3 ist. Aber in unseren Experimenten verwendeten wir MgCl 2 bei einer Konzentration von 10 mM, eine leicht nachweisbare Lichtstreusignal zu erhalten und FtsZ Polymere während der Sedimentation Assay stabilisieren. Obwohl wir unsere Protokolle angewendet FtsZ aus dem Modellorganismen E. coli und B. subtilis, können sie FtsZ von jedem anderen Organismus angepasst werden. Es ist zu beachten, dass die physiologischen pH-Wert und Konzentrationen von monovalenten und divalenten Kationen unterscheiden zwischen Organismen werden. Somit können die optimalen Bedingungen für FtsZ Polymerisation variieren. Unterschiede in der Verdopplungszeit und Wachstumsbedingungen von verschiedenen Bakterien können in verschiedenen Montage-Kinetik von FtsZ und optimalen Bedingungen der Experimente führen. Allerdings bietet unser Protokoll einen guten Ausgangspunkt für die Experimente mit FtsZs aus anderen Organismen. Die Protokolleist nützlich für die Untersuchung der FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder Untersuchungen über die Auswirkungen von kleinen Verbindungen und Arzneimittel auf FtsZ sein. <table border="1"><tbody><tr><td> Quelle </td><td> Polymerisation [% der FtsZ sedimentiert] </td><td> GTPase [Pi / FtsZ / min] </td><td> Mg 2 +-Konzentration [mM] </td><td> FtsZ-Konzentration [um] </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> FtsZ Ec </td><td> ~ 28% </td><td> ~ 2.1 </td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> Diese Arbeit </td></tr><tr><td></td><td> ~ 50% </td><td> ~ 2.4 </td><td> 10 </td><td> 12,5 </td><td> 27 </td></tr><tr><td></td><td> ~ 43% </td><td> ~ 3,5 </td><td> 5 </td><td> 12,5 </td><td> 27 </td></tr><tr><td></td><td> ~ 27% </td><td> ~ 4.6 </td><td> 2.5 </td><td> 12,5 </td><td> 27 </td></tr><tr><td></td><td> ND </td><td> ~ 5.4 </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 26 </td></tr><tr><td> FtsZ Bs </td><td&gt; ~ 30% </td><td> ~ 0.8 </td><td></td><td> 12 </td><td> Diese Arbeit </td></tr><tr><td></td><td> ~ 52% (mit DEAE-Dextran) </td><td> ~ 0,5 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 11 </td></tr><tr><td></td><td> ND </td><td> ~ 2,25 </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Auswirkungen auf Mg 2 + auf FtsZ Polymerisation und GTPase. Ergebnisse aus dieser Arbeit im Vergleich zu veröffentlichten Daten. Alle Versuche wurden in 50 mM MES / NaOH, pH = 6,5, 50 mM KCl durchgeführt wird.

Der wesentliche bakterielle Protein FtsZ ist die am besten charakterisierte Protein der bakteriellen Zellteilung Maschinen. FtsZ ist die prokaryotische Homolog von Tubulin und polymerisiert in vitro in einer GTP-abhängigen Weise. FtsZ ist ein sehr attraktives Ziel für neue Antibiotika aufgrund seiner konservierten Natur und Einzigartigkeit, um Bakterien zu 1,2. Zu Beginn der Zellteilung bildet FtsZ eine zytokinetischen Ring midcell, das als Gerüst für die Montage der anderen Zellteilung Proteine ​​dient. Bildung der Z-Ring ist von entscheidender Bedeutung für die korrekte Lokalisierung der Trennungsebene. Die Montage Dynamik der FtsZ werden von mehreren Hilfsproteine, wie (je nach Bakterienarten) MinC, SepF, ZAPA, UgtP, und Esra 2 geregelt. FtsZ Polymerisation wurde intensiv in vitro und viele verschiedene Strukturen, einschließlich Protofilamenten gerade, gebogen Protofilamenten, Platten aus Filamenten, Bündel von Fäden und Rohre von Filamenten untersucht wurden described je nach Montagepuffer, Nukleotid, und zusätzliche Proteine ​​in dem Test 3 enthalten. Die Architektur des FtsZ Protofilamenten in vivo ist noch nicht vollständig verstanden, obwohl Elektronen cryotomography Experimente in Caulobacter crescentus vermuten, dass die Z-Ring ist aus relativ kurzen, nicht-kontinuierlichen Einzel Protofilamenten ohne umfassende Bündelung 4 montiert. In vitro, die Polymerisation Eigenschaften FtsZ und die Interaktion von FtsZ mit regulatorischen Proteinen reagieren empfindlich auf die Zusammensetzung der Reaktionspuffer. Zum Beispiel kürzlich beschrieben wir die Interaktionsstelle für SepF am FtsZ C-Terminus und zeigte, daß ein FtsZ Bs Δ16 C-terminalen abgeschnittenen nicht mehr bindet SepF 5. In einer früheren Studie über die SepF-FtsZ Bs Interaktion, truncate eine ähnliche FtsZ Bs Δ16 noch mit SepF, die vorgeschlagen, dass SepF bindet an einen sekundären Standort auf FtsZ cosedimented <sup&gt; 6. Der Unterschied zwischen diesen Studien war die Zusammensetzung der Reaktionspuffer bei pH 7,5-es gab keine cosedimentation von SepF mit der FtsZ abschneiden, während bei pH 6,5 war cosedimentation. Gündoğdu et al. SepF beachten, dass nicht funktions und fällt bei pH 6,5 7 zeigt, dass die beobachtete cosedimentation bei pH 6,5 wird wahrscheinlich durch Ausfällung SepF anstatt Wechselwirkung mit dem FtsZ Bs Δ16 C-terminalen abgeschnittenen verursacht werden. Der Einfluß des pH-Werts und KCl-Konzentration auf die Polymerisation von FtsZ zuvor untersucht worden. Polymere von E. coli FtsZ (FtsZ Ec) bei pH 6,5 sind länger und häufiger als bei neutralem pH-Wert 8,9 ist. Tadros et al. haben die Polymerisation von FtsZ Ec in Gegenwart von einwertigen Kationen Feststellung, dass K +-Bindung an FtsZ Ec Polymerisation verbunden und ist entscheidend für die Aktivität FtsZ 10 untersucht. Der pH-Wert ist critical, wenn die Wechselwirkung von FtsZ mit anderen Proteinen untersucht, wie im vorherigen Beispiel der SepF, und der pH-Abhängigkeit der Hemmwirkung von MinC auf FtsZ 11 gezeigt. Da beide pH-Wert und Salzkonzentration kann die Wechselwirkung von FtsZ mit anderen Proteinen beeinflussen, ist es wichtig, die richtigen Bedingungen und Kontrollen für die FtsZ Polymerisation Studien zu wählen. Hier beschreiben wir Protokolle FtsZ Polymerisation und GTPase-Aktivität durch Lichtstreuung, Elektronenmikroskopie, Sedimentation und GTPase Assays zu untersuchen. Rechter Winkel Lichtstreuung ist eine Standardmethode, um FtsZ Polymerisation in Echtzeit 12 studieren. Wir führten ein paar Verbesserungen an der Sedimentation und GTPase-Assay. Wir präsentieren im Detail, wie Proben für die Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie vorzubereiten. Mehrere Puffer in der Literatur verwendet, um FtsZ Polymerisation zu untersuchen, wurden getestet und beschreiben wir die besten Voraussetzungen für jedes Experiment. Wir zeigen auch, welche sollte kontrollierteingeführt, um die besten Daten zu erhalten. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle Untersuchung der FtsZ Polymerisation, Aktivität und Interaktion mit anderen Proteinen mit einfachen Methoden und Geräte, die in den meisten Labors zur Verfügung steht. Weitere anspruchsvolle Methoden, um FtsZ Polymerisation studieren existieren, aber häufig Zugang zu spezialisierter Ausrüstung und / oder Verändern des FtsZ mit fluoreszierenden Markierungen 8,13,14. Die in diesem Dokument beschriebenen einfachen Methoden werden mit FtsZ aus B. dargestellt subtilis und E. coli, die häufigste Gram + und Gram-Modellorganismen. Die Protokolle können zu jedem anderen FtsZ Protein angepasst werden. Basierend auf ersten Tests mit diesen neuen FtsZs, leichte Veränderungen in Bezug auf Zeit-, Puffer-oder Temperatur der Inkubation kann, die für ein optimales Ergebnis sein. Die hier beschriebenen Experimente sollen in die Suche nach diesen optimalen Bedingungen zu unterstützen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1048">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">GTP</td>
			<td style="width:381px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10106399001</td>
			<td style="width:167px;">Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thickwall Polycarbonate Tubes</td>
			<td style="width:381px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">343776</td>
			<td>Part 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Optima MAX-XP Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">393315</td>
			<td>Part 2, 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyallomer Tube with Snap-on Cap</td>
			<td style="width:381px;">Beckman Coulter</td>
			<td align="right">357448</td>
			<td>Part 3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">AIDA Bio-package, 1D, 2D, FL</td>
			<td style="width:381px;">Raytest Isotopenmessger&#228;te GmbH</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15000001</td>
			<td>Part 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Luminescence Image Analyzer LAS-4000</td>
			<td style="width:381px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part 4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:381px;">Thermo Spectronic AMINCO-Bowman Luminescence Spectrometer</td>
			<td style="width:381px;">Spectronic Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Fluorescence Cell</td>
			<td>Hellma Analytics</td>
			<td>105-250-15-40</td>
			<td>Part 5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square 400 Mesh, Copper, 100/vial</td>
			<td style="width:381px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">G400-Cu</td>
			<td>Part 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CM120 Electron Microscope Operating at 120 kV</td>
			<td style="width:381px;">Philips</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 ml x 0.2 ml Plate</td>
			<td style="width:381px;">BIOplastics</td>
			<td style="width:119px;">B70501</td>
			<td>Part 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Malachite Green Phosphate Assay Kit</td>
			<td style="width:381px;">BioAssay System</td>
			<td style="width:119px;">POMG-25H</td>
			<td>Part 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerWave HT Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:381px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ftsz polymerization assays: simple protocols and considerations

Während der bakteriellen Zellteilung montiert der essentielles Protein FtsZ in der Mitte der Zelle, um den sogenannten Z-Ring bilden. FtsZ polymerisiert in lange Filamente in Gegenwart von GTP in vitro, und die Polymerisation wird durch mehrere Hilfsproteine ​​reguliert. FtsZ Polymerisation wurde ausgiebig in vitro unter Verwendung von Grundverfahren, einschließlich Lichtstreuung, Sedimentation, GTP-Hydrolyse-Assays und elektronenmikroskopisch untersucht. Pufferbedingungen beeinflussen sowohl die Polymerisation von FtsZ Eigenschaften und die Fähigkeit von FtsZ mit regulatorischen Proteinen interagieren. Hier beschreiben wir Protokolle für FtsZ Polymerisation Studien und bestätigen Auflagen und Kontrollen unter Verwendung von Escherichia coli und Bacillus subtilis als Modell FtsZ Proteinen. Eine niedrige Geschwindigkeit der Sedimentation Test wird eingeführt, die die Untersuchung der Wechselwirkung von FtsZ ermöglicht mit Proteinen, die zu bündeln oder tubulate FtsZ Polymere. Eine verbesserte GTPase-Assay-Protokoll beschrieben, das Testen ermöglichtGTP-Hydrolyse im Laufe der Zeit unter Verwendung von verschiedenen Bedingungen in einer 96-Well-Platte Aufbau mit standardisierten Inkubationszeiten, die Variation in der Farbentwicklung in der Phosphatnachweisreaktion aufzuheben. Die Herstellung der Proben für die Lichtstreuung und Elektronenmikroskopie-Studien beschrieben. Mehrere Puffer werden verwendet, um die passenden Puffer pH-Wert und Salzkonzentration für FtsZ Polymerisation Studien zu etablieren. Eine hohe Konzentration von KCl ist das Beste für die meisten Experimente. Unsere Methoden stellen einen Ausgangspunkt für die in-vitro-Charakterisierung von FtsZ, nicht nur aus E. coli und B. subtilis, aber von einem anderen Bakterium. Als solche können die Verfahren für die Untersuchung der Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder die Prüfung der antibakteriellen Arzneimitteln, die FtsZ Polymerisation beeinflussen, verwendet werden.

Reinigung von FtsZ aus verschiedenen bakteriellen Quellen ist in der Literatur beschrieben worden und ist in Tabelle 1 zusammengefasst. <table border="1"><tbody><tr><td> Quelle </td><td> Verfahren </td><td> Änderung </td><td> Ausbeute [mg / l Kultur]&gt; </td><td> Referenzen </td></tr><tr><td> B. subtilis </td><td> 1) Ammoniumsulfat-Fällung / Ionenaustausch-Chromatographie </td><td> nicht </td><td> 40 </td><td> Diese Arbeit, 11,15 </td></tr><tr><td> 2) Die Affinitätschromatographie </td><td> His-Tag </td><td> ND </td><td> 17 </td><td></td></tr><tr><td> E. coli </td><td> 1) Ammoniumsulfat-Fällung / Ionenaustausch-Chromatographie </td><td> nicht </td><td> 35 </td><td> Diese Arbeit, 11,15 </td></tr><tr><td> 2) Calciumfällung, Ionenaustauschchromatographie </td><td> nicht </td><td> 40 </td><td> 18 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Methanococcus jannaschii </td><td> 1) Die Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen / Rückfaltung / Ammoniumsulfat-Fällung / Gel-Filtration </td><td> His-Tag </td><td> 1.3 </td><td> 19 </td></tr><tr><td> 2) Die Affinitätschromatographie / Gel-Filtration </td><td> His-Tag </td><td> ND </td><td> 20 </td><td></td></tr><tr><td> Thermotoga maritima </td><td> Ionenaustausch-Chromatographie / Gel-Filtration </td><td> nicht </td><td> 6,7 </td><td> 19 </td></tr><tr><td> Pseudomonas aeruginosa </td><td> Affinitäts-Chromatographie / Gel-Filtration </td><td> Strep-Tag, His-Tag </td><td> ND </td><td> 21 </td></tr><tr><td> Mycobacterium tuberculosis </td><td> 1) Affinity / Ionenaustausch-Chromatographie </td><td> nicht </td><td> ND </td><td> 22 </td></tr><tr><td> 2) Die Affinitätschromatographie / Gel-Filtration </td><td> nicht </td><td> 30 </td&gt; <td> 23 </td><td></td></tr><tr><td> Aquifex aeolicus </td><td> Affinitäts-Chromatographie / Gel-Filtration </td><td> His-Tag-, C-terminale Verkürzung (331-367) </td><td> ND </td><td> 24 </td></tr><tr><td> Caulobacter crescentus </td><td> Ionenaustausch-Chromatographie / Ammoniumsulfat-Fällung / Gel-Filtration </td><td> nicht </td><td> ND </td><td> 25 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. FtsZ Reinigungsprotokolle beschrieben. ND: nicht bestimmt. Sedimentation von FtsZ Polymere Zunächst verwendeten wir zwei verschiedene Geschwindigkeiten zu FtsZ Polymere Spin-Down. Wir fanden, dass nur mit einer Geschwindigkeit von 350.000 xg einzelnen Polymere der FtsZ Ec nach unten (Abbildung 1) gesponnen, während bei 190.000 xg nur Bündel von FtsZ Bs in der Pelletfraktion (Daten nicht gezeigt) vorhanden sind. Daher wurde 350.000 xg in unserem Fell verwendetther Experimenten. Der Anteil der polymerisierten FtsZ Ec und FtsZ Bs ist ähnlich bei 50 mM KCl, auch wenn die Lichtstreuung Experimente zeigten eine viel höhere Streusignal für FtsZ Bs. Dies ist aufgrund Bündel von FtsZ Bs gebildet, die mehr Licht als einzelne Polymere von FtsZ Ec streuen. Es war nicht möglich, eine hohe Menge von FtsZ Polymere in der Pelletfraktion in dem Experiment mit 300 mM KCl sowohl für FtsZ Ec und FtsZ Bs (Abbildung 1) zu erhalten. Wir führen dies auf eine Kombination von schnellen Demontage der FtsZ Strukturen und verringerte Bündelung der Filamente. Sedimentation von FtsZ-SepF Tubuli Um die Interaktion von FtsZ mit bestimmten Aktivatoren Sedimentation Tests können bei niedrigeren Geschwindigkeiten Zentrifugation durchgeführt werden, zu analysieren. Bei dieser Geschwindigkeit nur die großen Strukturen der FtsZ kann pelletiert werden, z. B. durch die großen Tubuli SepF gebildet klingelt eind FtsZ Filamente Bs 5, oder die von FtsZ und ZAPA gebildet Bundles. Wir verwendeten unteren Zentrifugation (24.600 × g), um die Machbarkeit dieses Ansatzes für die von FtsZ und SepF gebildet Tubuli demonstrieren. FtsZ im Pellet über Hintergrundgehalte gewonnen, wenn beide SepF und GTP in der Probe vorhanden ist (Fig. 2) sind, und die Anwesenheit von SepF nicht beeinflusst FtsZ GTPase-Aktivität 7 zeigt, dass FtsZ in Gegenwart SepF voll aktiv. Spezifische Sedimentation SepF und FtsZ ist in etwa 45% der Gesamt SepF und 15% der Gesamt FtsZ (im Vergleich zu sedimentieren Material, als das BIP wird hinzugefügt). Dies zeigt, dass die SepF FtsZ-Tubuli enthalten mehr als SepF FtsZ. Das kann sein, weil viele SepF Ringe organisieren die FtsZ-SepF Tubuli 5,7. Die genaue Stöchiometrie SepF-FtsZ in diesen Röhren ist nicht bekannt, aber unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mehr als FtsZ SepF vorhanden. FtsZ Ec und FtsZ Bs polymerizatIonen-und Bündelungseigenschaften Um die Effizienz der Polymerisation von FtsZ Bs und FtsZ Ec in verschiedenen Puffern analysierten wir beide Proteine ​​um 90 ° Winkellichtstreuung zu charakterisieren. Bei 50 mM KCl, gibt FtsZ Bs 20-40-fach höhere Lichtstreuung als Signal FtsZ Ec je nach pH-Puffer (3A und B) bestätigt Ergebnisse der Buske et al. 26. Erhöhung der KCl-Konzentration im Puffer nicht signifikant Einfluss der Lichtstreuungssignal FtsZ Ec (Fig. 3D), aber das Signal von FtsZ Bs verringert ~ 80-fach bei pH 7,5 ~ 30-fach bei pH 6,8 und ~ 45-fach bei pH 6,5 in 300 mM KCl (Fig. 3C) gegen mit 50 mM KCl (Fig. 3A) puffert. Zerlegen FtsZ Polymere schneller bei höheren KCl-Konzentration für beide Proteine ​​(3C und D </strong&gt;). Studium der Pacheco-Gómez et al. zeigen, dass E. coli FtsZ Polymerisation und Bündelung ist pH-abhängig. Die Autoren fanden heraus, dass in einem Puffer mit 50 mM KCl das Lichtstreusignal von FtsZ Polymerisation war höher, und Demontage von FtsZ dauerte länger bei pH 6,0 im Vergleich zu pH 7,0 8. Diese Ergebnisse sind nicht in Übereinstimmung mit unseren Daten aus der Polymerisation von FtsZ Ec bei 50 mM KCl (3B), aber es ist zu beachten, dass wir drei verschiedene Puffer (HEPES, MES und Rohre) eingesetzt werden, wo Pacheco-Gómez et al. nur verwendet werden, MES. So wirkt sich nicht nur der pH-Wert, sondern auch Puffer-Zusammensetzung (Ionenstärke) die Kinetik der FtsZ Polymere bei 50 mM KCl. Allerdings bei 300 mM KCl weder Pufferzusammensetzung noch pH-Wert in einer nachweisbaren Weise beeinflusst FtsZ Ec Montage. Ein Lichtstreuung Experiment von FtsZ Bs in Puffer ohne KCl war nicht möglich, da eine Ausfällung des protein unter diesen Bedingungen. Wenn die Konzentration des FtsZ B wurde auf 3 &amp;mgr; M verringert wird, hat Präzipitation nicht auf. Jedoch ist 3 &amp;mgr; M nicht die physiologische Konzentration von FtsZ in der Zelle. In Kunststoff-Küvetten hat FtsZ Bs nicht bei 12 &amp;mgr; M bei pH 7,5 ausgefällt, aber bei pH 6,8 und 6,5 FtsZ noch in Abwesenheit von KCl gefällt. Morphologien von FtsZ Strukturen aus E. coli und B. subtilis Die von FtsZ gebildeten Strukturen wurden durch TEM untersucht. FtsZ Bs montiert in eng verdichtet Polymere, die das gesamte Netz in allen Puffern bei niedrigen Salz (Abb. 4A-C) abgedeckt. FtsZ Ec gebildet lange Fäden, Kabel und Bündel in allen Puffern bei niedrigen Salz (Abb. 4D-F). Allerdings ist die Menge der beobachtbaren Polymere durch FtsZ Ec gebildet wurde, war niedriger als die von FtsZ Bs gebildete Menge. In der Hochsalzpuffer mehr gebildet FtsZ BsEinzelstrang-Protofilamenten, die nicht in Bündeln zu assoziieren hat (Abb. 4G-I). Während FtsZ Bs Protofilamenten verändert Struktur bei höheren Salzkonzentration gebildet FtsZ Ec Strukturen nicht von denen der Niedrigsalzpuffer (Abbildungen 4J-L). Es gab keine beobachtbaren pH Einfluss auf die Polymerisation von FtsZ Ec aber FtsZ Bs bildet mehrere Bündel bei pH 6,5, die so genau verdichtet Polymere und Blätter (4B) sichtbar sind. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unserer Lichtstreuung und TEM bisher veröffentlichten Arbeit 8,11,26. Die GTPase-Aktivität von FtsZ bei hohen und niedrigen Konzentrationen KCl Die GTP-Hydrolyse-Aktivität von FtsZ wurde unter verschiedenen Bedingungen mit einem Farbtest für freie Phosphat gemessen. Wie berichtet bisher 15 der GTPase-Aktivität von FtsZ mit steigender KCl concentration: je nach dem verwendeten Puffer FtsZ Bs. zeigte eine 3-7 fache Erhöhung und FtsZ Ec zeigten eine 1,5-2,5 fache Erhöhung der GTPase-Aktivität bei 300 mM KCl im Vergleich zu 50 mM KCl. Die reduzierte GTPase-Aktivität bei 50 mM KCl ist auf Bündelung von FtsZ Bs Filamente. Bei 50 hatte mM KCl FtsZ Ec eine 6.3-fach höhere Aktivität als GTPase FtsZ Bs durch schnellere Demontage der FtsZ Ec Polymere. Der Unterschied in der GTP-Hydrolyse-Aktivität zwischen FtsZ Bs und FtsZ Ec wurde bei 300 mM KCl, möglicherweise aufgrund der reduzierten Bündelung der Filamente FtsZ B (Fig. 5) reduziert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. Quantifizierung FtsZ Polymerisation durch Sedimentation. (A) 12 uM FtsZ wurde in Gegenwart von 2 mM GTP oder polymerisierteBIP bei pH 7,5 (schwarze Balken), 6.8 (graue Balken) oder 6,5 (weiße Balken). Die Menge an Protein wurde pelletiert durch densitometrische Analyse von Coomassie-gefärbten Gelen bestimmt. BIP diente als Kontrolle für eine spezifische Sedimentation und der Prozentsatz der FtsZ BIP sedimentiert wurde aus dem Prozentsatz der FtsZ mit GTP sedimentiert, um die Werte in der graphischen Darstellung aufgetragen bekommen subtrahiert. Links: FtsZ bei 50 mM KCl sedimentiert, rechts: FtsZ bei 300 mM KCl sedimentiert. (B) Repräsentative Ergebnisse aus Coomassie gefärbten Gelen. Polymerisation von FtsZ Bs (obere Gel) und FtsZ Ec (untere Gel) bei 50 mM KCl. (S) Überstand (P) Pellet-Fraktionen aus dem Experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Sedimentation von SepF / FtsZ Tubuli mit geringer Geschwindigkeit. (A) 12 uM FtsZ Bs wurde mit 2 mM BIP (weiße Balken) oder GTP (schwarze Balken) polymerisiert. Die Menge an Protein wurde pelletiert durch densitometrische Analyse von Coomassie-gefärbten Gelen bestimmt. Die Zeichen + und - im Rahmen der x-Achse auf das Vorhandensein oder Fehlen von FtsZ und SepF in der Reaktion. (B) Repräsentative Ergebnisse aus einer Coomassie gefärbten Gel. Polymerisation von FtsZ Bs in Gegenwart und Abwesenheit von SepF. Als eine Kontrolle ohne SepF FtsZ verwendet wurde. Die Polymerisation wurde mit GTP und GDP durchgeführt. (S) Überstand (P) Pellet-Fraktionen aus dem Experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig3.jpg" width="600px" /> 3. Licht Streuung von 12 uM FtsZ Ec und 12 uM FtsZ Bs. FtsZs wurden in Gegenwart von 2 mM GTP und Polymerisation gebaut wurde durch 90 ° Lichtstreuung verfolgt. Polymerisation von FtsZ B (A) und FtsZ Ec (B) bei 50 mM KCl bei pH 7,5, pH 6,8, pH 6,5. Polymerisation von FtsZ Bs (C) und FtsZ Ec (D) bei 300 mM KCl bei pH 7,5, pH 6,8 und pH 6,5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig4.jpg" width="600px" /> 4. Strukturen von FtsZ Bs und FtsZ Ec Polymere, die durch Elektronenmikroskopie sichtbar. (AL) Bilder von 12 uM FtsZ Bs (AC </strong&gt; und GI) und FtsZ Ec (DF) und (JL) mit 2 mM GTP polymerisiert. (AC) FtsZ Bs in Puffer mit 50 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. (DF) FtsZ Ec in Puffer mit 50 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 sind. (GI) FtsZ Bs in Puffer mit 300 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. (JL) FtsZ Ec in Puffer mit 300 mM KCl und pH 7,5, 6,8 und 6,5 auf. Maßstab:. 100 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50844/50844fig5.jpg" width="600px" /> 5. GTP-Hydrolyse während FtsZ Polymerisation in 6 verschiedenen Puffern. In allen Experimenten 2 mM GTP wwie gewohnt. Als eine Kontrollprobe ohne MgCl 2 verwendet wurde. Aktivität FtsZ ohne MgCl 2 wurde aus den von FtsZ in Gegenwart von MgCl 2 subtrahiert. Auf der linken Seite: GTPase-Aktivität von FtsZ bei 50 mM KCl, rechts:. GTPase-Aktivität von FtsZ bei 300 mM KCl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50844/50844fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Polymerisation von FtsZ ist für bakterielle Zellteilung. In diesem Bericht haben wir ausführlich einfache Protokolle zu FtsZ Polymerisation Aktivitäten zu überwachen und zu diskutieren den Einfluss der Pufferzusammensetzung. Die Protokolle können verwendet werden, um die Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder antibakterielle Medikamente, die Polymerisation beeinträchtigen FtsZ untersuchen.

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

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15.2K Aufrufe.  University of Groningen.  Polymerisation von FtsZ ist für bakterielle Zellteilung. In diesem Bericht haben wir ausführlich einfache Protokolle zu FtsZ Polymerisation Aktivitäten zu überwachen und zu diskutieren den Einfluss der Pufferzusammensetzung. Die Protokolle können verwendet werden, um die Wechselwirkung von FtsZ mit regulatorischen Proteinen oder antibakterielle Medikamente, die Polymerisation beeinträchtigen FtsZ untersuchen. 

Serie: FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be infected with polyhedra by droplet feeding and diet plug-based bioassays. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents, including discussion of the pros and cons for use of baculoviruses as insecticides, and progress made in genetic enhancement of baculoviruses for improved insecticidal efficacy.

In this video, we demonstrate oral infection techniques of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protokolle für orale Infektion von Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Forschung

Biologie

Protocols for Microapplicator-assisted Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. . This video shows how lepidopteran larvae can be infected with microapplicator techniques in the gut with baculovirus polyhedra and in the hemolymph with budded virus. This accompanying Springer Protocols section provides an overview of the baculovirus lifecycle and use of baculoviruses as insecticidal agents.  Formulation and application of baculoviruses for pest control purposes are described elsewhere.

In this video, we demonstrate two microapplicator techniques used to infect of lepidopteran larvae with baculovirus in order to determine insecticidal efficiency.

Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. . This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

Zusammenfassung

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