(; Bis MA und JDS R01GM100470 und 1R01GM095959-01A1) und einem Core Facility Zuschuss von der Indiana Clinical and Translational Sciences Institute (teilweise durch NIH Zuschusses # TR000006 UL1 finanziert, teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, um JDS).

1. Swarm Assay Medien Vorbereitung und Inokulation 4,5,7,8,11 <ol><li> Medienvorbereitung HINWEIS: Die nachfolgend beschriebene Zusammensetzung des Mediums ist auf P. aeruginosa Rankenbildung Studien. Bitte lesen Sie den Medienanforderungen in Tabelle 1 für P. aeruginosa, B. subtilis und M. xanthus Oberfläche Motilität Tests. <ol><li> Mischungs 200 ml FAB-minus (NH 4) 2 SO 4 Schwarm Medium (Werkstoff-Tabelle), 0,9 g Noble-Agar und 0,2 g Casaminosäuren (Tabelle 1) unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab. Verwenden Sie kleine Mengen (100-300 ml), um die Kohärenz zwischen den Experimenten zu verbessern. </li><li> Autoklavieren die 200 ml Agar / Mediengemisch mit einer Belichtungszeit von 22 min, Einsatztemperatur von 121,1 ° C, und einem schnellen Vent-Stellung. Die Autoklaven Einstellungen richtige Sterilisation und Agar Schmelzen zu ermöglichen, aber zu verhindern Agar Karamelisierung. HINWEIS: Edel-Agar ist anfällig für Karamellsierung; bakterielle Motilität auf karamellisierten Agar verändert. </li><li> Unmittelbar nach der Sterilisationszyklus abgeschlossen ist, schließen Sie den Deckel des Medienflasche um den Wasserverlust durch Verdunstung zu verhindern. Beachten Sie jedoch, dass die enge Begrenzung kann eine &quot;Vakuumversiegelung&quot; -ähnliche Wirkung auf die Flasche führen. </li><li> Man kühlt das Medium auf 50 ° C unter Rühren bei Raumtemperatur (RT) und mit 2 ml sterilem 1,2 M Glucose. Sie können auch den Medien in einem 60 ° C Inkubator oder Wasserbad bis zur Verwendung (bis zu 15 Stunden später), und gehen Sie wie angegeben. Um die Bildung von Blasen in den Medien zu verhindern, gründlich gemischt unter Verwendung der magnetischen Rührstab; Blasen auf der Oberfläche des Agars werden zu verhindern, selbst Schwärmen. HINWEIS: Bei anderen Assays, fügen in diesem Schritt wärmeempfindliche Komponenten, die nicht wie beispielsweise zusätzliche Nährstoffe oder Farbstoffe autoklaviert werden kann, je nach Bedarf (beispielsweise Zugabe von 8 &amp; mgr; Invitrogen Syto 63 Farbstoff pro 100 ml geschmolzene Agar Bild M. xanthus wie gezeigt in Vertreve Ergebnisse, unten). Zusatz einiger Farbstoffe können Basisschwarmverhalten, das gegenüber einer nicht-Farbstoff Steuerung überprüft werden sollte beeinflussen. </li><li> In einem Laborabzug, aliquoten 7,5 ml sterilem Medium pro 60 mm Durchmesser Petrischale aus Polystyrol und zu warten, die Platten in einer einzigen Schicht (nicht gestapelt). Bei größeren Schwärmen Oberfläche, aliquote 25 ml Medium pro 100 mm Petrischale. Es ist wichtig, um das Geschirr auf einer ebenen horizontalen Fläche zu füllen. Verwenden Sie Augenhöhe eines Stiers zu überprüfen, ob die Oberfläche eingeebnet. HINWEIS: Für P. aeruginosa-Assays, mit einem spezifischen Mediavolumen pro Platte wird die Konsistenz und Reproduzierbarkeit zu verbessern. Für B. subtilis und M. xanthus Assays Hand Gießen führt zu Ergebnissen vergleichbar spezifisches Volumen Aliquots. </li></ol></li><li> Platte Aushärtung <ol><li> Für kleine Platten (60 mm), damit das geschmolzene Agar-Medium zu heilen (beide bis halbfeste und trockene überschüssige Flüssigkeit gesetzt) ​​in der Haube aufgedeckt (dh ohne Deckel) für 30 Minuten. GrößerePlatten (100 mm) erfordern eine längere Aushärtezeit (siehe Diskussion). HINWEIS: Alternativ können einige Tests erfordern Platten auf der Tischplatte über Nacht (20-24 h) abgedeckt (dh Deckel auf) in einer einzigen Schicht (Tabelle 1) zu heilen. Das Schwärmen ist empfindlich gegenüber sowohl überschüssige und unzureichende Feuchtigkeit. Die Feuchtigkeit, Luftströmung und Temperatur eines jeden Labors kann Schwankungen erfordern zur Platte, um eine optimale Heilung Schwärmen Sie Bakterium zu fördern. </li><li> Impfen Platten unmittelbar nach der Trocknungszeit ist vorbei. Die Platten für die weitere Verwendung aufbewahren. <ol><li> Führen Sie die &quot;Tintenausbreitungstest&quot; durch Spotting eine Testplatte mit 10 ul Gemisch von 0,50% (v / v) Higgins Wasserdicht Schwarz Tusche und Bakterieninokulum 11. Wenn die Tinte / Inokulum Gemisch ausbreitet leicht (dh nicht Tröpfchenform zu halten) auf der Oberfläche des Mediums, werden die Medien zusätzliche Zeit zum Trocknen brauchen. HINWEIS: Für die Arten, die besonders empfindlich gegenüber Feuchtigkeit sind (&lt;em&gt; zB P. aeruginosa), werden Sie schnell ein &quot;Tintenausbreitungstest&quot; 11 zu bestimmen, ob die Platten trocken genug. </li></ol></li></ol></li><li> Swarm Assay Impfung <ol><li> Impfen Sie 6 ml Brühe Kulturmedien (siehe Tabelle 1 für Details) mit einer Einzelkolonie von einer frischen (&lt;5 Tage alt, wenn bei Raumtemperatur belassen) LB-Medium (LB) Plattenkultur. Bouillonkulturen über Nacht (≤18 h) Inkubieren bei 30 ° C oder 37 ° C mit horizontalen Schütteln (240 rpm). </li><li> Impfen Schwarm Platten durch Spotting mit 1-5 ul der Übernbouillonkultur oder durch &quot;Stossen&quot; der Agar mit einer sterilen Zahnstocher oder Draht Impfnadel. HINWEIS: Wir bevorzugen die letztere Methode, weil es verringert die Wahrscheinlichkeit des Spritzens des Inokulums und verhindert, dass das Hinzufügen zusätzlicher Feuchtigkeit auf der Schwarm Fläche. </li></ol></li><li> Swarm Assay Incubation <ol><li> Für allgemeine Assay inkubiert Schwarm Testplatten bei 30 °C oder 37 ° C (oder 42 ° C für B. subtilis; Tabelle 1) -Dies ist Bakterium spezifisch. Kehren Sie die Platten während der Inkubation, so dass überschüssige Feuchtigkeit kondensiert am Deckel, nicht der Agar. HINWEIS: Die Temperatur kann Phänotyp als auch die Kinetik beeinflussen. Für P. aeruginosa Schwärmen, Inkubation bei 37 ° C führt zu einem schnelleren Wachstum und Schwarmausdehnung als eine Inkubation bei 30 ° C; aber die Morphologie dieser Schwärme unterscheidet sich oft mit dieser Temperaturänderung. </li><li> Für Zeitraffer-Bildgebung, Inkubation Schwarm Platten bei der entsprechenden Temperatur, bevor sie in der Bilderzeugungsstation (siehe Tabelle 1 für weitere Details) übertragen. ANMERKUNG: Diese Vorabbildungs ​​Inkubation ermöglicht Schwärme, um ihre Entwicklung zu beginnen und bevor sie an eine neue Umgebung, die möglicherweise nicht optimal für Schwärmen Motilität können bewegt etabliert. </li></ol></li></ol> 2. makroskopischen Abbildung von Oberflächen Motilität Tests 7,8 &lt;ol&gt; <li> Für Zeitraffer-Bildgebung nach den Vorabbildungs ​​Inkubationszeit Ort Schwarm Testplatten auf einer klaren Bildplatte in einem kommerziellen In-vivo-Imaging-Station. Bild bis zu sechs, Durchmesser 60 oder vier mm, Durchmesser 100 mm Platten auf einmal. Da die Kamera Bilder von unterhalb der Bildebene, kehren die Platten, so daß der optische Weg nicht behindert 8. Alternativ Inkubieren bei 30 ° C oder 37 ° C (Tabelle 1) für die Dauer des Experiments, und entfernen sich die Platten aus dem Inkubator zu festgesetzten Zeitintervallen abgebildet werden. </li><li> Legen Sie die Deckel der Petrischalen aufrecht auf der Oberseite der Platte, die das Gegenstück impften Medien hält. Füllen Sie die Deckel der Petrischalen mit Wasser zu übermäßiger Austrocknung während der Bilderzeugung zu verhindern, und die gesamte Einrichtung mit einem anderen klaren Tray Feuchtigkeit während des Experiments zu erhalten. </li><li> Mit Molecular Imaging (MI) Software 12, führen Assay (n) bei Raumtemperatur mit Hilfe der imAltern in der Tabelle 2 beschriebenen Einstellungen. Für Zeitraffer-Bildgebung, die Einrichtung eines Protokolls mit den notwendigen Schritten und Spezifikationen. </li></ol> 3. Datenverarbeitung und Interpretation 7,8 <ol><li> Bildverarbeitung <ol><li> Verwenden MI Software Batch-Export Bilder als 16-Bit-TIFF-Dateien: Datei&gt; Exportieren oder Export Multiple&gt; Datei (en) auswählen, um den Export und Exportstandort. </li><li> Verwenden ImageJ, um ein einzelnes Bild zu öffnen oder importieren Sie eine Zeitraffer-Serie: <ol><li> Öffnen Sie ein einzelnes Bild: Datei&gt; Öffnen </li><li> Import Zeitraffer-Bildfolge: Datei&gt; Importieren Sequenz, und wählen Sie &quot;Namen numerisch sortieren&quot;. <ol><li> Für größere Zeitraffer-Dateien, wählen Sie &quot;virtuellen Stack&quot; im Fenster &quot;Import Sequence&quot;, um die exportierten Bilder in entsprechenden Kategorien (dh GFP, RFP, etc.) zu stapeln. </li></ol></li></ol></li><li> Falls erforderlich, Bilder von 16-Bit-Dateien in 8-Bit-Dateien ändern: Bild&gt; Typ&gt; 8-Bit- HINWEIS: Einige ImageJ Werkzeuge erfordern 8-Bit-Bilder. </li><li> Ermitteln, ob der Intensitätssignals für ein Bild oder einer Zeitablaufsequenz muss invertiert werden. Setzen Sie den Cursor auf einem hellen Fleck auf dem Bild (zB fluoreszenzmarkierten Wachstum) und beachten Sie die Signalintensität &quot;Wert&quot; aus dem ImageJ Symbolleiste. Dann setzen Sie den Cursor in einem dunklen Ort außerhalb der Plattenfläche und beachten Sie die Signalstärke. Wenn die Signalintensität für den dunklen Fleck größer als die Intensität des hellen Flecks, muss die Bildsignalstärke zu invertieren (Folgeschritte 1-2 unten). <ol><li> Kehren Sie die Intensitätssignale: Bearbeiten&gt; Umkehren </li><li> Kehren Sie die Lookup-Tabelle: Bild&gt; Suchtabellen&gt; Umkehren LUT </li></ol></li><li> Ziehen Sie den Hintergrund: Prozess&gt; Ziehen Sie den Hintergrund, und verwenden Sie ein &quot;Rollkugelradius&quot; mit einem Pixel-Radius, der die Hälfte einer Bilddimension (ist zB 1000 Pixel für eine 2000 x 2000 pIxel Bild). </li><li> Künstlich Farbe ein Bild oder Zeitraffer-Reihenfolge: Bild&gt; Suchtabellen, und wählen Sie die gewünschte Farbe aus der Liste Optionen. </li><li> Bei Filmen mit zwei oder mehr Kanäle, zusammenführen und vor dem Speichern als Film (Bildverarbeitung, Schritt 8) das Gleichgewicht der Farben. Um Bilder miteinander verschmelzen, öffnen alle Bildstapel in ImageJ, und wählen Sie Bild&gt; Farbe&gt; Kanäle zusammenfügen, und weisen Sie jedem Stapel zu einem Farbkanal. </li><li> Sparen Sie Zeitraffersequenz als AVI oder Quicktime-Film: Datei&gt; Speichern unter, und wählen Sie gewünschte Format und Spezifikationen. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Der Erwerb Bakterielle Oberflächenwachstumsfeld zu quantifizieren Expansion Rate <ol><li> Offene Bild (er) in ImageJ </li><li> Für die Berechnung der Durchmesser der Platte in Pixel, ziehen Sie eine Linie über die Mitte einer Testplatte mit dem &quot;Straight&quot; Werkzeug aus der und messen die Länge: Analysieren&gt; Messen </li><li> Die Standard-Maßeinheit in ImageJ ist die pixel. Besorgen eines Umwandlungsfaktors durch Dividieren des Durchmessers der Testplatte (zB 60 für eine 60 mm-Platte), die durch die Pixellänge in dem vorhergehenden Schritt erhalten. </li><li> Ändern Sie die Maßeinheit von Pixel zu mm: Bild&gt; Eigenschaften <ol><li> Ändern Sie den &quot;Längeneinheit&quot; auf &quot;mm&quot;, und die &quot;Pixel Breite&quot;, &quot;Pixel Height&quot; und &quot;Depth Voxel&quot; auf den Umrechnungsfaktor im vorherigen Schritt berechnet. Wählen Sie das &quot;Global&quot; Kästchen, um diese Umrechnungsfaktor über mehrere Bilder zu erhalten. HINWEIS: Wenn ImageJ geschlossen und wieder geöffnet, oder das Sichtfeld eines Bildes geändert wird (das heißt, ein Bild wird in mehr als eine andere herausgezoomt), ist der Umwandlungsfaktor neu berechnet werden. Alternativ führen Sie alle Analysen in Pixel und dann in mm. </li></ol></li><li> Für jeden Rahmen zu verfolgen und messen Sie die Schwarm-Bereich mittels &quot;Freihand-Auswahl&quot; in der Werkzeugleiste, um den ou verfolgentline des Schwarms und messen Sie den Bereich mit: Analysieren&gt; Messen. Dies erzeugt eine Messung protokolliert, die können zur weiteren Analyse in Microsoft Excel oder ähnlichen Programmen gespeichert werden: Datei&gt; Speichern unter </li></ol></li><li> Der Erwerb Bakterielle Oberflächenwachstumsintensität zu quantifizieren Oberflächen Growth Rate <ol><li> Sobald der Hintergrund subtrahiert (Bildverarbeitung, Schritt 5), verwenden Sie das letzte Bild der Sequenz, die maximale Fläche von Schwarm (Datenanalyse, Schritt 1) ​​zu bestimmen. </li><li> Verwenden Sie das &quot;Oval&quot; Auswahl-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um einen Rahmen um das bakterielle Oberflächenwachstum zu ziehen. </li><li> Stellen Sie den mittleren Intensitätsmessung der Pixel in der Box mit: Analysieren&gt; Set Messungen, und wählen Sie &quot;Mittlerer Grauwert&quot;. </li><li> Um Intensität Signalmessungen für jedes Bild in der Zeitraffer-Sequenz zu erhalten, während auf dem ersten Bild der Sequenz gehen Sie zu: Analysieren&gt; Messen. Dies erzeugt eine Messung protokolliert, die können zur weiteren Analyse in Mi gespeichert werdencrosoft Excel oder ähnlichen Programmen: Datei&gt; Speichern unter </li></ol></li><li> Alternative zum vorhergehenden Abschnitt (Datenanalyse, Schritt 2). Verwenden Sie die Makros ImageJ Plugin zu installieren und führen Sie einen Makro Oberflächenwachstum Intensitätsmessung Skript. <ol><li> Einrichtung eines automatisierten Mess Skript, um mehrere Bilder gleichzeitig zu analysieren: Plugin&gt; Neu&gt; Makro, und fügen Sie den bereitgestellten Skript (unten) in das Feld und speichern Sie als ImageJ Makro Textdatei: Datei&gt; Speichern unter, und speichern Sie mit dem ImageJ Anwendungsordner unter &quot; Makros &quot;. numberOfFrames = N for (i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { laufen (&#39;Measure&#39;); laufen (&#39;Next Scheibe [&gt;]&#39;); } Anmerkung: Hier wird die Variable &quot;N&quot; ist für eine unbestimmte Anzahl von Rahmen. </li><li> Bearbeiten Sie die &quot;numberOfFrames&quot; in der Macros-Plugin für jedes Experiment, um die Anzahl der Bilder in der Bildsequenz vor der Ausführung des Skripts zu reflektieren. Verwendung: Plugin&gt; Makros&gt;Bearbeiten, und geben Sie die richtige Anzahl von Rahmen in der Sequenz und speichern (Datei&gt; Speichern). </li><li> Folgen Sie Schritte 1-3 in Datenanalyse-Schritt 2, und während auf dem ersten Bild der Sequenz führen Sie das Makro-Plugin: Plugin&gt; Makros&gt; Ausführen. Dies erzeugt eine Messung protokolliert, die können zur weiteren Analyse in Microsoft Excel oder ähnlichen Programmen gespeichert werden: Datei&gt; Speichern unter </li></ol></li></ol></li></ol>

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Erzielung reproduzierbarer Schwärmen in einem Labor kann eine Herausforderung sein, wie Schwarm Assays sind sehr empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen, wie Feuchtigkeit und verfügbaren Nährstoffen. Der kritischste Aspekt einer Oberfläche Motilität Plattenassay ist Feuchtigkeit auf der Agaroberfläche. Vor der Beimpfung müssen Schwarm Medien trocken genug, um Bakterienzellen vom Schwimmen über die Oberfläche Flüssigkeit zu verhindern, aber nicht so trocken wie zu hemmen wimmelt Motilität 5 sein. Die Inkubation sollte in einem ausreichend feuchten Umgebung zu nehmen: zu wenig Feuchtigkeit im Test Austrocknen während der Inkubation führen, während zu viel Feuchtigkeit kann zu künstlichen oder Artefakt Oberfläche Verbreitung führen. Es sei denn, eine feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator zur Hand, kann Inkubator und Labor Feuchtigkeit drastisch ändern. Folglich könnte ein weiterer Wasservorratsbehälter, einen Luftbefeuchter oder ein Entfeuchter im Inkubator ist zur Übertrocknung oder die Ansammlung von überschüssiger Feuchtigkeit zu verhindern, während die relat werdenive Feuchtigkeit in der Nähe von 80%. Die Aufrechterhaltung dieses ideale Luftfeuchtigkeit kann sich als Herausforderung, wenn saisonale Feuchtigkeitsschwankungen signifikant sind. Wenn dies der Fall ist, wird der Schwarm Assay-Protokoll einige Anpassungen erfordern, um saisonale Änderungen in der Feuchtigkeit zu berücksichtigen. Wir haben festgestellt, dass eine Veränderung der Schwarm Medien Trockenzeit ist der einfachste Weg, um für die saisonale Feuchtigkeitsschwankungen anzupassen. Konstantfeuchteüberwachung sowohl innerhalb als auch außerhalb des Inkubators, wird empfohlen. Ferner ist es empfehlenswert, dass die Forscher zu kalibrieren und zu bestätigen ihre Instrumente, Inkubatoren, Schuppen, etc. als kleinere Fehler in der Temperatur, Volumen oder Mengen von Medienkomponenten können Reproduzierbarkeit dieser Assays beeinträchtigen. Es sollte auch beachtet werden, dass die Art und die Größe der Platte in dem Assay verwendet werden kann, Plattenfeuchtigkeit beeinflussen und somit Schwärmen werden. Airtight Platten nicht auslassen überschüssige Feuchtigkeit, was ermutigend Schwimm Beweglichkeit. Im Gegensatz dazu offenflächigen Platten erlauben zu viel Feuchtigkeit entweichen. Eine Petrischalebietet eine ideale Umgebung, weil es Öffnungen off genug überschüssige Feuchtigkeit zu verhindern, dass Flüssigkeit aufzubauen, behält aber genug Feuchtigkeit, um das Medium vor dem Austrocknen zu verhindern. Diese Methode nennt eine Oberfläche Motilität Assay-Protokoll, das für hohe Bildqualität ermöglicht. Um den Agar klar für die Bildgebung 60 mm Durchmesser Gerichte werden mit 7,5 ml Agar-Medien gefüllt zu halten. Wenn detaillierte Bildgebung nicht benötigt wird, können Mengen von bis zu 20 ml auch reproduzierbare Ergebnisse. Während wimmelt Beweglichkeit kann auf eine breite Palette von Agar-Konzentrationen erreicht werden, der optimale Bereich von Agar zum Schwärmen ist abhängig von der Spezies. Insgesamt höhere Agar Konzentrationen hemmen wimmelt Beweglichkeit und damit die benötigte Zeit, um eine Bild-ready Schwarm Steigerungen zu produzieren. P. aeruginosa schwärmt der Regel auf Agar-Konzentrationen zwischen 0,4-0,7% 1, jedoch finden wir, dass optimale Schwärmen in einem viel engeren Bereich (0,4-0,5%) auftritt. Andere, wie B. subtilis und S. Darm-ein Schwarm mit 0,6% Agar und Vibrio parahaemolyticus in 1,5% Agar 10. Die erforderliche Agarkonzentration wird auch durch die Art und Marke Agar bestimmt. Höhere Reinheit Nährböden, wie Edel Agar, stark verbessern schwärmen in P. aeruginosa und werden bevorzugt Agar 13,14 über granuliert. Jedoch sind diese gereinigte Versionen von Agar auch anfälliger für Karamelisierung während der Autoklav-Sterilisationszyklus; je nach Gerät, eine verkürzte / modifiziert Sterilisation Sequenz (die Abgaszyklus möglicherweise ändern, um längere Hitzeeinwirkung zu verhindern) kann erforderlich sein Schwarm Medien vorzubereiten mit Edel-Agar werden. Medienzusammensetzung spielt auch eine Rolle bei der beobachteten Schwarm Phänotyp 3. P. aeruginosa wimmelt Motilität Studien werden in der Regel unter Verwendung von minimal Nährmedien. Wir bevorzugen FAB Medium 4,8 (Werkstoff-Tabelle), aber auch andere Medien, wie M9, LB oder leichte Abweichungen zu diesen gemeinsamen Medien,erfolgreich 9,15,16 verwendet. Rankenbildung am besten zu FAB mit Glukose als Kohlenstoffquelle und Casaminosäuren (CAA) ergänzten Minimalmedium erreicht, jedoch ohne eine zusätzliche Stickstoffquelle (das heißt, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Wenn Rankenbildung oder Morphologie ist nicht der Schwerpunkt der Studie, dann FAB-Minimalmedium (Werkstoff-Tabelle, Tabelle 1) frei von CAA empfohlen, so dass die Auswirkungen von bestimmten Kohlenstoffquellen und / oder zusätzliche Nährstoffe können im Detail untersucht werden. Andere Arten, wie B. subtilis (hier vorgestellten), sind vielseitig Schwärmer, der fähig ist Schwärmen auf LB-Agar und granuliert. Diese Arten Schwarm einfach und erfordert nur ~ 10 Stunden, um eine vollständige Schwarm zu entwickeln. Diese schnelle wimmelt Rate macht nach dem Fortschreiten der Schwarm möglicherweise schwierig, aber unser Protokoll macht solche Tracking sehr machbar. Die Fähigkeit, Schwarm Zeitraffer-Bildgebung durchführen stellt eine substanliche Leichtigkeit in Schwarm Datenerfassung, insbesondere von solchen begeisterter Schwärmer. Wir stellen eine robuste, umfassende, Zwei-Phasen-Protokoll und Richtlinien zur Verbesserung der Durchführung und Reproduzierbarkeit der Bakterienoberfläche Motilität Forschung ausgerichtet und wurden in erster Linie betont Aspekte wichtig, Flagellen-vermittelte Schwärmen zu untersuchen. Dieser Schwarm Testprotokoll ausführliche Informationen zu wichtigen Aspekten der Medienzusammensetzung und den Umgang mit Oberflächenbeweglichkeit Platten, um eine größere Konsistenz und Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Forschungsgruppen bieten. Dies wird die Grundlage des Vergleichs zwischen den verschiedenen Forschungsstudien zu verbessern. Darüber hinaus bietet die vorgestellte Ansatz und das Protokoll mittels Forschung zu Schwärmen und Oberflächenbeweglichkeit weniger anfällig gegenüber Umweltänderungen zu machen, indem die Forscher wissen, dass diese Faktoren wirken sich auf ihre Arbeit und Bereitstellung von Lösungsmöglichkeiten (zum Beispiel, wie kleine Veränderungen in Agar beeinflussen wimmelt 4,5 ). Darüber hinaus, um das Protokoll vorgesehenquantifizieren makroskopischen Aspekte Schwärmen, bietet die Möglichkeit, viele Eigenschaften von bakteriellen Oberflächenwachstum, die bisher nicht quantifizierbar waren zu messen. Wir haben nicht alle Oberflächen bewegliche Bakterien in der Entwicklung dieses Protokolls untersucht. Als solches wird erwartet, dass das Protokoll Modifikationen werden für die hier nicht dargestellten Spezies erforderlich sein. Die Effizienz dieses Protokolls wird durch die inhärenten Beschränkungen der Ausrüstung und der verwendeten Materialien beschränkt. Beispielsweise sind Temperatur Studien nicht möglich, da noch mit dem Bruker Abbildungsstation, da die Temperatursteuerung nicht ein Merkmal der Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung von Farbstoffen (wie Nilrot um Rhamnolipide zu färben) kinetische und Konzentrationsbeschränkungen 8 haben. Diese Technik stützt sich stark auf die Verarbeitung und Auswertung von Digitalbildern; verbesserte Automatisierung der Datenanalyse (zB durch zusätzliche Macros Skriptfunktion in ImageJ) würde die Zeit für die Analyse benötigt reduzierenund erweitern Sie die Nützlichkeit der Daten. Schließlich, aufgrund der Robustheit der Bildgebungsprotokoll, zukünftige Anwendungen sollte die Erweiterung dieser Technik auf weniger einheitliche Wachstumsoberflächen können, die für Oberflächen von Umwelt- und pathogenen Bakterien besiedelt sind, untersuchen wollen.

Viele Bakterien bewegen auf Oberflächen mit verschiedenen Mitteln der Selbstantrieb. Einige Motilität Phänotypen kann im Labor mit Plattentests, die von der flüssigen Umgebung mit dem halbfesten Platten-Assay Zusammensetzung assoziiert betroffen sind recherchierbar. Eine Untergruppe der Nutzfläche Motilität Plattentests weiter beinhalten eine Gasphase-typischerweise Raumluft. Dementsprechend wird der Ausgang eines bestimmten Oberflächen Motilität Assay erfordert eine sorgfältige Steuerung der Schnittstelle aus drei Phasen: die örtlichen Umwelt festen Oberfläche, flüssigen Umgebung und Gasumgebung Eigenschaften. Die am häufigsten untersuchten Motilität Modus derart dreiphasigen Assay wird wie Schwärmen bekannt. Schwärmen Beweglichkeit ist die koordinierte Gruppe Bewegung von Bakterienzellen, die durch ihre Geißeln durch dünne Flüssigkeitsfilme auf Oberflächen 1 angetrieben werden. Es wird üblicherweise in Laboratorien mit halbfesten Plattentests, die 0,4% -0,8% (w / v) Agar 1 studiert. Eine Anordnung vonHumanpathogene nutzen diese Motilität Verhalten zu erforschen und zu besiedeln den menschlichen Wirt. Zum Beispiel nutzt Proteus mirabilis wimmelt Motilität zu bewegen auf der Harnröhre und erreichte und Kolonisierung der Blase und Nieren 2. Schwärmendes Motilität wird allgemein als Vorläuferschritt zu Biofilmbildung, die primäre Ursache der Pathogenese bei vielen menschlichen Pathogenen 3. Das Schwärmen Phänotyp ist sehr unterschiedlich zwischen den Bakterienarten; experimentelle Erfolg und Reproduzierbarkeit stark verlassen sich auf Faktoren wie Nährstoffzusammensetzung, Agar Art und Zusammensetzung, Sterilisation Protokoll (zB Autoklavieren), halbfeste Medien Aushärtung und Umgebungsfeuchtigkeit (zB Wechsel der Jahreszeiten), unter anderem 3-5. Die Variabilität der Motilität Antworten Oberfläche betont die Herausforderungen in diesen Studien und den maßgeblichen Einfluss Medien und Umwelt ausüben kann auftreten. Für einige schwärmen Arten, wie Pseudomonas, wimmelt motility kann auf einer Vielzahl von Medien-Zusammensetzungen auftreten, obwohl der beobachtete Phänotyp und Begleit Schwarm Ausdehnungsrate wird erheblich 3 variieren. In Kombination können diese Faktoren machen Oberfläche Motilität Studien extrem schwierig. Saisonale Schwankungen in einem Labor können diese Dreiphasen-Assays beeinflussen: Tests können besser in der feuchten Luft des Sommers und noch schlimmer in der trockenen Luft des Winters funktionieren. Hier präsentieren wir die allgemeinen Leitlinien zu einigen der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung von Oberflächenbeweglichkeit Platte Studien zu umgehen. Für einige Oberflächen Motilität Studien, ist von großem Interesse die Entwicklung von spezifischen Phänotypen. Die meisten, aber nicht alle veröffentlichten Studien zu Schwärmen von P. prüfen aeruginosa zeigen die Bildung von Ranken oder Fraktale strahlenförmig von einer Impfung Center 9.3. Die Unterschiede zwischen P. aeruginosa-Stämme wurden dokumentiert 5,8, aber viel von der Gegenwart oder Abwesenheit von Ranken können zur spezifi zurückzuführenc Medium und das Protokoll für diesen Schwarm Motilität Platte Assays verwendet. Hier sind Informationen, wie man Ranke bildenden Schwärmen für P. fördern aeruginosa. Da P. aeruginosa ist nur eine von vielen schwärmenden Bakterien, auch wir Informationen für unsere Verfahren zu Schwärmen von Bacillus subtilis und Gleiten von Myxococcus xanthus zu untersuchen. Wie P. aeruginosa, der aktuellen Forschung auf B. subtilis und M. xanthus umfasst eine Reihe von Themen, wie Forscher arbeiten, um Aspekte der Sporenbildung, Motilität, Stressantwort und Übergangsverhalten 1,10 zu erkennen. Es besteht ein Bedarf, die Muster und die Dynamik des spezifischen Verhaltens (s) für diese Zellen in Schwärmen Gruppen zu quantifizieren. Oberflächenbeweglichkeit Datenerfassung, können Analyse und Interpretation umständlich und qualitativ sein. Wir haben ein Verfahren für die detaillierte makroskopische Analyse der bakteriellen Schwärmen, die zusätzlich zur Verfügung stellt Zone Morphologie und s Schwarm entwickeltenize (zB Durchmesser), quantitative dynamische Informationen zum Schwarm Expansionsrate und bakterielle oder Bioprodukt Dichteverteilung 7. Darüber hinaus kann dieses Verfahren die Vorteile der verfügbaren fluoreszierenden Proteinen, Lumineszenz, und Farbstoffe, um einen umfassenden Überblick der bakteriellen Interaktionen 8 zu erhalten, sowie um die Synthese von Bioprodukten (zB Rhamnolipid P. aeruginosa 7,8) innerhalb eines Schwarms zu verfolgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

Bakterielle Oberflächenbeweglichkeit, wie das Schwärmen, wird üblicherweise im Labor mit Plattentests, die spezifische Konzentrationen von Agar und manchmal Aufnahme spezifischer Nährstoffe in dem Nährmedium notwendig sucht. Die Herstellung von solchen expliziten Medien und Wachstumsbedingungen Fläche dient, die günstige Bedingungen, die nicht nur das Wachstum von Bakterien, aber koordinierte Motilität der Bakterien gegenüber diesen Oberflächen innerhalb dünnen Flüssigkeitsfilmen ermöglichen. Die Reproduzierbarkeit der Schwarm Platte und andere Oberflächenbeweglichkeit Plattentests kann eine große Herausforderung sein. Speziell für mehr &quot;gemäßigten Schwärmer&quot;, die Beweglichkeit nur innerhalb Agar Bereiche von 0,4% -0,8% (G / V), kleine Änderungen in Protokoll oder Laborumgebung können Schwarm Untersuchungsergebnisse stark beeinflussen aufweisen. &quot;Wettability&quot;, oder des Wassergehalts in der Flüssigkeits-Feststoff-Luft-Grenzfläche dieser Plattentests, ist oft eine wichtige Variable kontrolliert werden. Eine weitere Herausforderung bei der Beurteilung Schwärmen ist, wie man o quantifizierenbserved Unterschiede zwischen zwei (oder mehr) Experimenten. Hier werden wir ausführlich ein vielseitiges Zweiphasen-Protokoll zu erstellen und Bild Schwarm Assays. Wir sind Leitlinien für die Herausforderungen häufig mit Schwarm Assay Medienvorbereitung und Quantifizierung von Daten aus diesen Tests verbundenen umgehen. Wir haben uns speziell zeigen unsere Methode mit Bakterien, die fluoreszierende oder Biolumineszenz genetische Reporter wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), Luciferase (lux-Operon) zum Ausdruck bringen oder Mobil Flecken auf Zeitraffer-optische Bildgebung ermöglichen. Wir zeigen weiter die Fähigkeit unseres Verfahrens zu verfolgen konkurrierenden Schwärmen Spezies in dem gleichen Experiment.

Variation der Plattenherstellung kann einen großen Einfluss auf die Motilität Schwärmen. Die Härtung bzw. Trocknung nach dem Gießen von geschmolzenem Agar-Medium wirkt sich auf die Oberflächenbeweglichkeit Assays und der bakteriellen Motilität im Laufe der Zeit die dünne Flüssigkeit Film. Veränderungen in der Nährstoffzusammensetzung beeinflussen auch Schwärmen mehrere Bakterien. 1A zeigt eine kurzfristige Wirkung Trocknungszeit beim Verteilen von Tusche und Ausbreitung eines anfänglichen Inokulum von Bacillus subtilis 11. 1B zeigt die Wirkung der Trocknungsdauer und 1C zeigt die Wirkungen von Ammoniumsulfat [(NH 4) 2 SO 4] bei der nachfolgenden Entwicklung mit Ranken Schwärmen P. aeruginosa 5. Zeigt quantifizierbare Daten von Endpunkt-Bilder der Oberfläche Motilität unter Verwendung mehrerer Imaging-Strategien erreicht werden. Abbildung 2 repräsentative Oberflächenwachstum Ergebnisse für <em&gt; P. aeruginosa wimmelt und der zugehörigen Bild GFP-Fluoreszenz, B. subtilis Schwärmen und die zugehörige Bild Biolumineszenz; und xanthus Oberflächenwachstum und die damit verbundene roten Fluoreszenzbild SYTO 64-gefärbten Zellen. Expansion der Datenerfassung über die reine Untersuchung und Bilddarstellung von Endpunktergebnisse können zur Untersuchung des dynamischen Verhaltens (n) für die Oberflächen wachsenden Bakterien, Fig. 3 7 zeigt ein Beispiel von P. aeruginosa Schwärmen (abgebildet auf GFP-exprimierenden Zellen) und die damit verbundenen Rhamnolipid Produktion (aufgenommen mit Nile Red Lipid-Färbung) -die Quantifizierung von Daten aus diesen Bildern wird ebenfalls angezeigt, um die Expansionsrate des P. zeigen aeruginosa Schwärmen. Video 1 zeigt eine Zeitraffer von B. subtilis Schwärmen aufgenommen mit Lumineszenz einer lux exprimierenden Stammes. Video 2 8 zeigt eine Zeitraffer-P. aeruginosa </em&gt; (grün-GFP) und Salmonella enterica Serovar Typhimurium (rot-exprimierenden Lux) in einem kompetitiven Assay-Schwarm. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> Abbildung 1: Beispiele für die Faktoren in der Oberflächenbeweglichkeit Assay Zubereitung, Assay Ergebnisse Wirkung von (A) Agar Trocknungszeit auf Agar Oberflächenfeuchte beeinflussen und Ausbreitung von Inokulum für B.. subtilis (Ref 8), (B) Agar Trocknungszeit auf P. aeruginosa Schwärmen, und (C) Anwesenheit oder Abwesenheit von Ammoniumsulfat auf P. (aus Lit. 5 Nachdruck mit freundlicher Genehmigung) aeruginosa Schwärmen und Rankenbildung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> Abbildung 2: Alternative Ansätze zur Abbildungsoberfläche Wachstum und Motilität der Bakterien unter Verwendung eines Bruker Abbildungsstation. seitigen Seiten Bild einer Kamera (links) und Bruker Bildes (rechts) zeigt, (A) P. aeruginosa, die GFP-bebilderten Verwendung der grünen Fluoreszenz Einstellungen, (B) B. subtilis lux Ausdruck Biolumineszenz Reporter bebilderten mit Lumineszenz-Einstellungen, und (C) M. xanthus mit SYTO gebeizt 64 aufgenommen mit roter Fluoreszenz II-Einstellungen. Siehe Tabelle 2 für die Einstellung Details. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> Abb. 3: Qualitative und quantitative Analyse einer Oberfläche Motilität Assay (A) Zeitraffer-Analyse von Zelldichteverteilung, mit Hilfe des Red-Fluoreszenz abgebildet Rhamnolipid Produktion (Nilrot LipidfleckIch Einstellungen; Balken = 15 mm), und (B) Quantifizierung der Expansionsrate von Zelldichteverteilung Bilder eines P. aeruginosa Schwarm. (Nachdruck aus Lit. 6 mit Genehmigung.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">Video 1.</a> Zeitraffer-Bildgebung eines B. subtilis Schwarm. B. subtilis Ausdruck Lux und aufgezeichnet mit den Lumineszenz-Einstellungen. Siehe Tabelle 2 für die Einstellung Details. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">Video 2.</a> Interspezies Wettbewerb Zeitraffer-Bildgebung sichtbar gemacht. Schwärme von P. aeruginosa (grün; GFP-exprimierenden und aufgezeichnet mit den Grün-Fluoreszenz-Einstellungen) und S. Ella enterica Serovar Typhimurium (rot; expressingen Lux und aufgezeichnet mit den Lumineszenz-Einstellungen). Siehe Tabelle 2 für die Einstellung Details. (Nachdruck mit Genehmigung aus Lit. 7). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> P. aeruginosa </td><td> P. aeruginosa Rankenbildung Studien </td><td> B. subtilis </td><td> M. xanthus </td></tr><tr><td> Übernachtung Brühe Kulturmedien </td><td> FAB plus 30 mM Glucose </td><td> FAB plus 30 mM Glucose </td><td> PFUND </td><td> CTT </td></tr><tr><td> Übernachtung Bouillonkultur Inkubationstemperatur </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 h bei 30 ° C </td></tr><tr><td> Swarm Medien </td><td> FAB </td><td> FAB minus (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (wt / vol) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>Swarm Medien: Zusatzkomponenten </td><td> 12 mM Glucose ein </td><td> 10% (wt / vol) CAA, 12 mM Glucose a </td><td> n / a </td><td> SYTO® 64 a </td></tr><tr><td> Agar-Typ </td><td> Agar, Edle </td><td> Agar, Edle </td><td> Granulierte Agar </td><td> Agar, Edle Affymetrix </td></tr><tr><td> Agar-Konzentration (G / V) </td><td> 0,45% </td><td> 0,45% </td><td> 0,60% </td><td> 1,50% </td></tr><tr><td> Swarm Plattengröße </td><td> 60 mm </td><td> 60 mm </td><td> 100 mm </td><td> 150 mm </td></tr><tr><td> Medienlautstärke pro Platte </td><td> 7,5 ml </td><td> 7,5 ml </td><td> Hand gegossen </td><td> Hand gegossen </td></tr><tr><td> Swarm Medieneinstellung / Trocknungsverfahren </td><td> Hood; Platten aufgedeckt </td><td> Hood; Platten aufgedeckt </td><td> Benchtop; Platten abgedeckt </td><td> Benchtop; Platten abgedeckt </td></tr><tr><td> Swarm Medieneinstellung / Trockenzeit </td><td> 30 Minuten </td><td> 30 Minuten </td><td> Übernachtung (20 -24 h) </td><td> Übernachtung (20 -24 h) </td></tr><tr><td> Swarm Assay Inkubationstemperatur </td><td> 30 oder 37 ° C </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Inkubation für Zeitraffer-Bildgebung </td><td> 30 ° C für mindestens 4 Stunden </td><td> 30 ° C für mindestens 4 Stunden </td><td> 37 ° C 2 h </td><td> RT für 12 h </td></tr><tr><td> Zeitraffer-Aufzeichnungslänge </td><td> 24-Stunden- </td><td> 24-Stunden- </td><td> 10 Stunden </td><td> 66 Stunden </td></tr><tr><td> Zeitraffer-Einstellung </td><td> 1 Bild / 10 min </td><td> 1 Bild / 10 min </td><td> 1 Bild / 6 min </td><td> 1 Bild / 10 min </td></tr><tr><td colspan="3"> a Hinzugefügt nach dem Autoklavieren. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Technische Daten für Oberflächen Motilität Assay Vorbereitung Inklusive OberflächenMotilität Assay Vorbereitung Spezifikationen für P. aeruginosa, B. subtilis und M. xanthus. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Signal </td><td> Grüne Fluoreszenz </td><td> Rote Fluoreszenz I </td><td> Rote Fluoreszenz II </td><td> Lumineszenz </td></tr><tr><td> Protein oder Farbstoff </td><td> Grüne Fluoreszenz Protein (GFP) </td><td> mCherry Protein oder Nilrot Rhamnolipid Fleck </td><td> SYTO® 64 </td><td> Luciferase von lux-Operon </td></tr><tr><td> Anregungswellenlänge (nm) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> Ab </td></tr><tr><td> Emissionswellenlänge (nm) </td><td> 535 ± 17,5 </td><td> 600 ± 17,5 </td><td> 670 ± 17,5 </td><td> Kein Filter </td></tr><tr><td> Belichtungszeit (sec)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> f- Stopp </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2.5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (mm) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Brennebene (mm) </td><td> 27,5 </td><td> 27,5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Binning (Pixel) </td><td> Die Sonne Geht Auf </td><td> 2 x 2 </td><td> Die Sonne Geht Auf </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Imaging Spezifikation Bruker Abbildungsstation Spezifikationen für rote und grüne Fluoreszenz und Lumineszenz-Imaging von bakteriellen Oberflächenwachstum..

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays at JoVE.com

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Aufrufe.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Serie: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Forschung

Biologie

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Gastrointestinale Motilität Monitor (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienschwärmen und kollektive Stressreaktion

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...