Wir danken Chris Webster für die Durchführung der Vorversuche in Abbildung 3 der repräsentativen Ergebnisse und Jason Watts und Chris Webster gezeigt für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Finanzierung für diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Institutes of Health (USA) (R01DK074114), um JLW Verfügung gestellt. Einige Nematodenstämmen in dieser Arbeit verwendet wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, die von der NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440) gefördert wird.

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind empfindlich gegen Hitze, Licht und Sauerstoff. Daher muss darauf bei der Vorbereitung Fettsäure-Supplementierung Platten genommen werden, dass Fettsäuren nicht, um überschüssige Wärme und Licht ausgesetzt ist. NGM-Medium, enthaltend 0,1% Tergitol (NP-40) wird autoklaviert und teilweise abgekühlt, wonach Fettsäure Natriumsalze unter konstantem Rühren zugegeben. Die Platten können in der Dunkelheit trocknen. Aufnahme von Fettsäuren von C elegans kultiviert auf diesen Platten kann dann durch Gaschromatographie verfolgt werden. 1. Herstellung von Fettsäure Ergänzte Medien <ol><li> Messen Sie Media-Komponenten in einen entsprechend dimensionierten Kolben. Pro 1 L, fügen 17 g Bacto-Agar, 2,5 g Trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol gelöst und 10 ml 10% Tergitol in Wasser gelöst. </li><li> In 80% der endgültigen gewünschten Volumen von Millipore Wasser und Autoklaven werden die Medien mit leeren Glasflaschen (gleich der Anzahl der verschiedenenFettsäure-Konzentrationen getestet werden), sowie geeignete Messzylinder. </li><li> Coole Medien in einem Wasserbad auf 55 ° C eingestellt Während die Medien ist die Kühlung bereiten den Arbeitsstammlösung des Fettsäure-Natriumsalz durch Aufbrechen der Glasfläschchen mit Sicherheitsvorkehrungen und die Gewährleistung Glaspartikel nicht zu verwechseln mit den Fettsäuren. Wiegen Sie genug Fettsäure zu 100 mm Arbeits Lager zu machen. </li><li> Bringt die Fettsäurelösung bis zu einer Endkonzentration von 100 mM mit gereinigtem Wasser. Voll Auflösen des Fettsäure-Natriumsalz dauert in der Regel ca. 20-30 min. Spülen Sie die Arbeits Lager Fettsäure mit Argon oder Stickstoff, weil der Kontakt mit einem inerten Gas verhindert die Oxidation. Verschließe das Röhrchen und lagern Sie den Arbeitsvorrat im Dunkeln, bis Medien abgekühlt ist. </li><li> (Optional) Wenn RNAi Medien gewünscht wird, messen Ampicillin und Isopropyl β-D-1-(IPTG)-Lösungen hier. </li><li> Wenn der Agar auf 55 ° C gekühlt und fügen je 1 L: 1ml 1 M MgSO 4, 1 ml 1 M CaCl 2 und 25 ml Phosphatpuffer (108,3 g KH 2 PO 4 und 35,6 g K 2 HPO 4 pro 1 L Autoklaven). Fügen Sie den Filter sterilisiert Ampicillin und IPTG-Lösungen machen, wenn RNAi-Platten. Für alle Arten von Platten, fügen sterilem Wasser, um die endgültige Medien Volumen auf 1 L. bringen </li><li> In der Nähe einer Flamme, Medien zu übertragen, um eine autoklaviert und entsprechend dimensionierten Messzylinder und fügen Sie dann warme sterilem Wasser auf das gewünschte Volumen. Übertragen Sie Medien zu den ursprünglichen Kolben und mischen durch Rühren. </li><li> In der Nähe der Flamme, übertragen Medium in einer Reihe von Flaschen gleich der Anzahl der durch Messung mit einer autoklavierten Konzentrationen getestet werden und entsprechend bemessen Messzylinder. Pflegen Sie die aliquotiert Medien als Flüssigkeit mit einem Wasserbad, bis die Fettsäure Arbeits Lager vollständig aufgelöst hat. </li><li> Legen Sie eine Flasche auf einem Aufsehen Platte und rühren, bis die Medien sich warm an, aber nicht heiß. Achten Sie darauf, sich selbst genug zu verlassenZeit, in der Fettsäure-Stammlösung rühren und Platten gießen, bevor die Medien beginnt sich zu verfestigen. Wenn rühren Platte Temperaturregelung, stellen Sie es auf 55 ° C </li><li> Verdünnen Sie die 100 mM Fettsäurearbeitsmaterial in den Medien für die gewünschte Endkonzentration. Stir Medien bis der weiße Niederschlag in der Lösung (ca. 1 min). Medien können noch leicht bewölkt danach. </li><li> (Optional) Falls RNAi Medien auf 0,1 mg / ml und 2 mM IPTG zu einer Endkonzentration gewünschten Add Ampicillin. </li><li> Gießen Sie Medien mit Hilfe eines automatisierten Pipette Hilfe und ein steriles 25 ml Pipette Zugabe von 8 ml Medium pro 60 mm-Platte oder 25 ml Medium pro 100 mm-Platte. Wiederholen Fettsäure Addition und Platte gießen Schritte für die restlichen Flaschen. </li><li> Nach dem Erstarren des Agars, decken Sie die Fettsäure-Platten, ergänzt mit einer Box oder bei Zimmertemperatur in einem gut belüfteten Schublade, um vor Licht Oxidation zu schützen. </li><li> Samen E. coli OP50 auf Platten zwei Tage nach Platten getrocknet sind.60 mm-Platten, Pipetten 300 ul einer Übernachtkultur OP50 (bei 37 º C gezüchtet). Wenn RNAi-Platten wurden gegossen, Saatgut mit 300 ul von RNAi-Bakterien nach der die Platten für vier Tage getrocknet. Platte Trocknungszeit muss möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der Feuchtigkeit in verschiedenen Laborumgebungen angepasst werden. </li><li> Die Platten in einer dunklen Umgebung Inkubation bei Raumtemperatur, während der Bakterienrasen trocknet. </li></ol> 2. Induktion Keimzell-Zerstörung durch Ergänzung von DGLA <ol><li> C. elegans gewachsen auf Platten, die 0,3 mM DGLA (20.03 n-6) werden aufgrund der Zerstörung von Keimzellen in beiden Larvenstadium und Erwachsenen Nematoden steril. <ol><li> Bereiten Sie eine synchronisierte Bevölkerung von L1-Larven durch die Behandlung schwangeren Hermaphroditen mit alkalischen Hypochlorit-Lösung (für ein 10 ml-Lösung: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml Haushaltsbleiche, und 7 ml H 2 O). Schütteln Sie die trächtige Hermaphroditen in dieser Lösung bis zum erwachsenen Wurms aufzulösen. Eier bleiben erhalten und können durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert werden. </li><li> Waschen Ei Zubereitung 3 mal in M9-Puffer (3 g KH 2 PO 4, 6 g Na &amp;sub2; HPO &amp;sub4;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O auf 1 L MgSO 4 In nach dem Autoklavieren). Um genügend Sauerstoff zu versorgen, zu suspendieren, die Eier in einem 15 ml Kunststoffrohr auf ein Gesamtvolumen von 5 ml M9-Puffer und Rock auf einem Schüttler über Nacht. </li><li> L1-Larven sollte zwei Tage nach der Aussaat mit OP50, oder einen Tag nach dem Ausplattieren der Bakterien an die RNAi ergänzt Platten hinzugefügt werden. Würmer Inkubation bei 20 ° C für drei Tage oder bis sie das Erwachsenenstadium erreichen. </li></ol></li><li> Erwachsene Würmer für Sterilität mit einem Binokular mit einer ausreichend hohen Vergrößerung zu entwickelnden Embryonen in der Gebärmutter zu visualisieren erzielt werden. Erfolgreiche Keimzellverlust wird als klare Leere des Uterus Eier erscheinen. </li><li> Worms kann auch durch Fixierung und Färbung mit dem Nukleinsäure eine gewertetcid Farbstoff diamindinophenylindole (DAPI), die die Visualisierung von Kernen in Keimzellen und sich entwickelnden Embryonen ermöglicht. Eine schnelle DAPI-Färbung wird durch Wahl Würmer in einem Tropfen M9 Puffer auf einem Uhrglas 9 gelöst. <ol><li> Flood Uhrglas mit 1 ml einer 0,2 ng / m. DAPI in 95% Ethanol-Lösung, lassen Sie sich für ca. 5 min. </li><li> Wählen Würmer in einen Tropfen Vectashield auf einer Folie und dann mit einem Deckglas abdecken. </li><li> Seal Deckglas und bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln für eine optimale Färbung, jedoch gleitet auch sofort eingesehen werden. Note auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Keimzellkerne mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer UV-Lampe und Filter. </li></ol></li></ol> 3. Bestätigung Fettsäureaufnahme durch Gaschromatographie Gesamtfettsäurezusammensetzung C. elegans kann durch Herstellung von Fettsäuremethylester (FAME), die dann getrennt und quantifiziert mit Gas chr bestimmt werdenomatography 4. <ol><li> Sammeln 500-1.000 erwachsenen Würmer durch Waschen aus der Platten mit Wasser und Übertragen auf den silanisierten 13 mm x 100 mm Glasschraube Oberrohr. </li><li> Lassen Würmer nieder durch die Schwerkraft, und entfernen Sie so viel Wasser wie möglich mit einer Glaspasteurpipette. </li><li> Würmer einmal mit Wasser waschen, und dann wieder entfernen, so viel Wasser wie möglich. </li><li> FAME werden durch Zugabe von 1 ml 2,5% H 2 SO 4 in Methanol, und dann Erhitzen auf 70 º C für 1 Stunde in einem Wasserbad ausgebildet. </li><li> Die Küvetten aus dem Wasserbad abkühlen und für 1 min. </li><li> Auszug FAME durch Zugabe von 1,5 ml Wasser und 0,25 ml Hexan. </li><li> Recap Rohre und kräftig schütteln. </li><li> Zentrifugenröhrchen in einer Tischklinikzentrifuge für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zu Hexan von wässrigen Lösungsmittel trennen. </li><li> Übertragen Hexan (obere Schicht) zu einem GC-Vial Einsatz in einem GC-Vial, vorsichtig zu einem der wässrigen Phase nicht zu übertragen. Für GC einnalyse wird 1-2 ul FAME in Hexan auf einer polaren Kapillar-Gaschromatographie-Säule geeignet für FAME-Analyse injiziert. Agilent 7890 GC-Injektor wird auf 250 º C eingestellt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,4 ml / min, und die GC-Ofen wird für eine Anfangstemperatur von 130 ° C, die 1 Minute lang gehalten wird, programmiert. Anschließend wird die Temperatur hochgefahren 10 ° C / min bis 190 ° C, und dann rampenförmig wieder auf 5 ° C / min bis 210 ° C und für weitere 1 min gehalten. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Aufnahme von DGLA aufgetreten FAME Analyse von Flammenionisationsdetektor (FID) oder Massenspektrometrie (MS) Detektion unter Verwendung authentischer Standards für die Identifizierung des C elegans-Fettsäuren. </li></ol>

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A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy.">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li><li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mediator+subunit,+MDT-15,+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans.">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li><li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans.">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans.">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li><li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80/HNF4+in+C.+elegans.">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ARC/Mediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis.">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Ergänzung von C. elegans mit ungesättigten Fettsäuren. Wie oben erwähnt, muß bei der Herstellung von PUFA ergänzt Platten genommen werden, da die reaktive Natur der Doppelbindungen in PUFAs bewirkt diese Fettsäuren oxidationsempfindlich sein, durch Hitze und Licht 11. Um Oxidation zu vermeiden, ist es wichtig, die PUFA zu dem flüssigen Agar-Medium hinzugefügt, nachdem das Medium auf 55 ° C und speichert Platten in einer dunklen Umgebung gekühlt. <...

Fettsäuren sind wesentliche strukturelle Bestandteile von Membranen sowie effiziente Energiespeichermolekülen. Zusätzlich können Fettsäuren aus Zellmembranen durch Lipasen gespalten werden und enzymatisch modifiziert, um Signalisierungs Effektoren 1 herzustellen. Natürlich vorkommenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) zwei oder mehr cis-Doppelbindungen. Die Omega-3-Fettsäuren und die Omega-6-Fettsäuren sind voneinander unterscheiden, basierend auf den Positionen der Doppelbindungen in Bezug auf die Methylende der Fettsäure. Gesunde Ernährung benötigen sowohl Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren. Allerdings sind westliche Ernährung besonders reich an Omega-6-Fettsäuren und arm an Omega-3-Fettsäuren. Eine Omega-6-zu Omega-3-Fettsäure-Verhältnis mit einem erhöhten Risiko von kardiovaskulären und entzündlichen Krankheiten, jedoch werden die genauen positiven und negativen Funktionen bestimmter Fettsäuren nicht gut verstanden 2 verbunden. Die Fadenwurm Caenorhabditis elens ist nützlich bei der Untersuchung Fettsäure-Funktion, weil sie synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6 und Omega-3-Fettsäuren, mit einem Omega-3-Desaturase, eine Aktivität, die bei den meisten Tieren 3,4 fehlt erzeugen. Mutanten, denen Fettsäure-Desaturase-Enzyme nicht auf spezifische PUFAs produzieren, was zu einer Reihe von Entwicklungs-und neurologische Defekte 6.4. Um die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren zu studieren, haben wir eine biochemische Assays mit genetischen Analyse entwickelt kompatibel mit sowohl Mutante und RNAi-Knockdown-Techniken in C. elegans. Ergänzung mit spezifischen PUFAs durch Zugabe einer Fettsäure-Natriumsalz-Lösung auf die Agar-Medium vor dem Gießen erreicht. Dies resultiert in PUFA-Aufnahme durch den E. coli Nahrungsquelle, wo es in den Bakterienmembranen ansammelt. C elegans einnehmen PUFA-haltigen Bakterien, und diese Nahrungsergänzung ist ausreichend, um die schad rettents von PUFA-defizienten Mutanten. Ergänzung der meisten Fettsäuren hat keine nachteiligen Auswirkungen auf Wildtyp-Tiere, jedoch bestimmte Omega-6-Fettsäuren, insbesondere Dihomo-Gamma-Linolensäure (DGLA 20:3 n-6) zu einer dauerhaften Zerstörung von C. elegans Keimzellen 7,8. Gaschromatographie verwendet wird, um die Aufnahme des ergänzten Fettsäure in der bakteriellen Nahrungsquelle (entweder OP50 oder HT115) sowie in der Nematoden zu überwachen. Die Zugabe der Waschmittel Tergitol (NP-40) in den Medien ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung der Fettsäuren durch die gesamte Platte und effiziente Aufnahme der Fettsäuren durch die E. coli und die Nematoden. Wir haben gefunden, daß ungesättigte Fettsäuren leicht von Bakterien und C aufgenommen elegans, aber die Aufnahme von gesättigten Fettsäuren ist viel weniger effizient. Dieser Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie Sie die Agar-Medien mit Fettsäuren zu ergänzen, als auch, wie man die Fettsäureaufnahme in th überwachenE Nematoden mittels Gaschromatographie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bacto-Agar</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">214010</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tryptone</td>
			<td style="width:128px;">Difco</td>
			<td style="width:155px;">211705</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3624-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Tergitol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">NP40S-500mL</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">C8667-25G</td>
			<td style="width:275px;">(5 mg/mL in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">MgSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">2504-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">CaCl2</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">1311-01</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3254-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">3246-05</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sodium dihomogamma linolenate</td>
			<td style="width:128px;">NuCHEK</td>
			<td style="width:155px;">S-1143</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Warm sterile Millipore water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile water for collecting worms</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Nuclease-free Water for DGLA stock solution</td>
			<td style="width:128px;">Ambion</td>
			<td style="width:155px;">AM9932</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP1760-25</td>
			<td style="width:275px;">100 mg/ml in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:128px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:155px;">12481C100</td>
			<td style="width:275px;">1 M in water (for RNAi plates)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">HSO4</td>
			<td style="width:128px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:155px;">9681-03</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Methanol</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">A452-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Hexane</td>
			<td style="width:128px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">H302-4</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">diamindinophenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">VectaShield</td>
			<td style="width:128px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:155px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Glass Flask</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4980-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass bottles with stirbars</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">FB-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Autoclaveable Glass Graduated Cylinder</td>
			<td style="width:128px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:155px;">08-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Stir Plate</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">97042-642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Waterbath at 55+ &#176;C</td>
			<td style="width:128px;">Precision Scientific Inc.</td>
			<td style="width:155px;">66551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Screwcap Brown Glass Vial</td>
			<td style="width:128px;">Sun SRI</td>
			<td style="width:155px;">200 494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Argon gas tank</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Automated Pipette aid</td>
			<td style="width:128px;">Pipette-Aid</td>
			<td style="width:155px;">P-90297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:208px;">Sterile Serological Pipettes (25 ml)</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Bunsen Burner</td>
			<td style="width:128px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">89038-534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:128px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">TLB3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Silanized glass tube</td>
			<td style="width:128px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">STT-13100-S</td>
			<td>for FAMEs derivitization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PTFE Screw caps</td>
			<td style="width:128px;">Kimble-Chase</td>
			<td style="width:155px;">1493015D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Clinical tabletop centrifuge</td>
			<td style="width:128px;">IEC</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Crimp Vial</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial Insert</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">GC Vial cap</td>
			<td style="width:128px;">SUN SRi</td>
			<td style="width:155px;">200 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Gas Chromatograph</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Mass Spectrometry Detector</td>
			<td style="width:128px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">5975C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:208px;">Column for gas chromatography</td>
			<td style="width:128px;">Suppelco</td>
			<td style="width:155px;">SP 2380</td>
			<td>30 m x 0.25 mm fused silica capillary column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in caenorhabditis elegans

Fettsäuren sind für eine Vielzahl von Zellfunktionen unerlässlich. Sie dienen als effiziente Energiespeichermoleküle bilden den hydrophoben Kern von Membranen, und beteiligen sich an verschiedenen Signalwege. Caenorhabditis elegans synthetisiert alle notwendigen Enzyme, um eine Reihe von Omega-6-und Omega-3-Fettsäuren zu produzieren. Dies, kombiniert mit der einfachen Anatomie und Umfang der verfügbaren genetischen Werkzeugen, machen es zu einem attraktiven Modell zur Fettsäure-Funktion zu untersuchen. Um die genetischen Ursachen, die die physiologischen Wirkungen von Nahrungsfettsäuren vermitteln zu untersuchen, haben wir ein Verfahren, um die C ergänzen entwickelten elegans Diät mit ungesättigten Fettsäuren. Nahrungsergänzung ist ein wirksames Mittel, um die Fettsäurezusammensetzung von Würmern zu ändern und kann auch verwendet werden, um Defekte in Fettsäure-Mutanten zu retten. Unsere Methode verwendet Nematoden Wachstumsmedium-Agar (NGM) mit Fett acidsodium Salze ergänzt. Die Fettsäuren in den Platten ergänzt werden InkorporationTED in den Membranen der Bakterienlebensmittelquelle, die dann von der C aufgenommen elegans ergänzt, die auf den Bakterien ernähren. Wir beschreiben auch ein Gaschromatographie-Protokoll, um die Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung, die ergänzt Würmer auftreten überwachen. Dies ist eine effiziente Möglichkeit, die Diäten von großen und kleinen Populationen von C. ergänzen elegans, so dass für eine Reihe von Anwendungen für diese Methode.

Ergänzung des C. elegans Diät wird durch die Fähigkeit der bakteriellen Nahrungsquelle in der Bakterienmembran zu integrieren Aufnahme und Fettsäure beschränkt. Um die Fähigkeit von E. bestimmen coli OP50 verschiedenen Fettsäuren in ihre Membranen aufzunehmen, OP50 wurde auf Medien ohne Ergänzung, 0,1 mM und 0,3 mM Konzentrationen von Stearinsäure (18.00), Natriumoleat (18.01 n-9) und Natrium DGLA (20 plattiert : 3n-6). Die Platten wurden bei Raumtemperatur für 2 Tage im Dunkeln getr...

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Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

&lt;em&gt; Caenorhabditis ele &lt;/ em&gt; ist ein nützliches Modell, um die Funktionen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Entwicklung und Physiologie zu erforschen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Ergänzung des &lt;em&gt; C. elegans &lt;/ em&gt; Ernährung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren.

Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

17.0K Aufrufe.  Washington State University.  Caenorhabditis ele ist ein nützliches Modell, um die Funktionen der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Entwicklung und Physiologie zu erforschen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Ergänzung des C. elegans Ernährung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren. 

Serie: Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Forschung

Biologie

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...