Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es unseres Wissens das erste ist, das ein neues zentrifugenbasiertes Metall für die kinetische Polysomenreinigung aus symbiotischen Sojabohnenknollen beschreibt. Der große Vorteil dieser Technik ist, dass in Kombination mit RNA-Seq die Untersuchung der Beziehung ermöglicht und in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knoten organisiert ist. Wiegen Sie zunächst etwa 0,2 Gramm intakte Knötchen in einer Waagschale und geben Sie sie in ein vorgekühltes Zwei-Milliliter-Rohr.
Dann fügen Sie 1,2 Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu, lassen Sie die Probe zwei Minuten auftauen und homogenisieren Sie mit einem Gewebemahlwerk bis zur vollständigen Auflösung und Homogenisierung der Knötchen. Als nächstes inkubieren Sie die Proben auf Eis mit leichtem Rühren für 10 Minuten oder bis alle Proben verarbeitet wurden, und zentrifugieren Sie bei 16.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Trümmer zu pelletieren. Stellen Sie dann den Überstand wieder her und wiederholen Sie den Zentrifugenschritt.
Nach sorgfältiger Rückgewinnung des geklärten zytosolischen Extrakts wird ein 200-Mikroliter-Aliquot zur vollständigen Isolierung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dann gießen Sie 4,5 Milliliter der 33,5% igen Saccharoseschicht in die Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 4,5 Milliliter der 12%-Schicht vorsichtig und langsam mit einer P-1000-Mikropipette hinzu. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf Eis, bis der geklärte zytosolische Extrakt hinzugefügt wird.
Laden Sie einen Milliliter des geklärten zytosolischen Extrakts auf das Saccharosekissen, indem Sie vorsichtig auf die Seitenwand des Röhrchens pipettieren. Dann die Ultrazentrifugenröhrchen in vorgekühlte Eimer geben und bei 217, 874 g zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach Verwerfen des verbleibenden zytosolischen Extrakts und des Saccharosepolsters wird das polysomale Pellet mit 200 Mikrolitern vorgekühltem Resuspensionspuffer wieder suspendiert.
Als nächstes 30 Minuten auf Eis inkubieren und dann die polysomale Resuspension in 1,5 Milliliter vorgekühlte Röhrchen überführen, um mit der RNA-Extraktion fortzufahren. Nach der Homogenisierung der Proben mit 750 Mikrolitern des RNA-Isolierreagenz für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter kaltes Chloroform hinzu und schütteln Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig.
Als nächstes 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zur Phasentrennung und überführen Sie 500 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein sauberes Röhrchen, ohne die rosa organische Phase zu stören. Dann fügen Sie 375 Mikroliter kaltes Isopropanol und 0,5 Mikroliter RNAs freies Glykogen hinzu.
Danach gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten. Dann verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie den RNA-Niederschlag mit einem Milliliter kaltem 75% Ethanol.
Durch kurzes Wirbeln mischen. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 7, 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft.
Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter RNA-freiem Wasser auf und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Die RNA-Konzentration und -Integrität wird mit hochempfindlicher Kapillarelektrophorese und/oder Elektrophorese auf einem 2%RNAs-freien Agarosegel beurteilt. Nach der Schätzung des Probenvolumens fügen Sie 0,1 Volumina von drei molaren Natriumacetat, drei Volumina kaltes Ethanol und 0,5 Mikroliter RNAs, freies Glykogen hinzu.
Dann mischen Sie sie gründlich. Die Kapillarelektrophorese wurde für mehrere totale und polysomal assoziierte RNA-Probenfraktionen durchgeführt, die scharfe ribosomale RNA-Banden ohne verschmiertes Aussehen zeigten. Dies spiegelt sich jedoch nicht in den RIN-Werten wider, da sie zwischen 5,9 und 7,5 liegen, was nicht intakten Stichproben entspricht.
Der Bioanalysator konnte die 18S- und 25S-Peaks, wie sie in den Elektropherogrammen zu sehen sind, nicht identifizieren, sowohl für Gesamt- als auch für Polysom-assoziierte RNA-Proben. Es gab keine visuellen Anzeichen für eine Verschlechterung der Probe. Es wurde jedoch eine Probe analysiert, um das Ergebnis einer fast vollständig degradierten Probe zum Vergleich zu visualisieren.
Das Wichtigste ist, während des gesamten Protokolls unter Polysomen- und RNA-erhaltenden Bedingungen zu arbeiten. Nach der Sequenzierung der Gesamt- und Par-RNA-Fraktionen können Standardmuster für die analysierte Genexpression verwendet werden, um differentielle Exprimierungsgene auf Transkriptions- und Translationsebene zu identifizieren.
