Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse HL108801 P01, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, AMK Choi unterstützt. S. Ryter erhielt Unterstützung von der Gehalts Lovelace Respiratory Research Institute.

Hinweis: Die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss am Brigham and Womens Hospital / der Harvard Medical School Raums zugelassenen die folgenden Verfahren. 1. Blinddarm-Ligation und Punktion Verwenden Mäusen des gleichen Hintergrund (C57Bl / 6), männlich, 8-10 Wochen alt. Weibliche Mäuse sind widerstandsfähiger als Männer gegen die Sepsis-induzierten Letalität. Mäuse älter als 8 Wochen produzieren weniger unterschiedliche Ergebnisse als jüngere Mäuse in Bezug auf die Überlebensrate nach CLP. Etwa N = 10 Mäuse pro Gruppe sollte im Vergleich zur Überlebensanalyse verwendet werden. N = 3-5 Mäusen ist ausreichend für die Autophagie-Assays. <ol><li> Verwenden Sie sterile kleine chirurgische Instrumente (nämlich Skalpell, Schere und Pinzette stumpf anatomische), die für Nager Chirurgie geeignet sein sollte. </li><li> Bereiten Anästhesie Mischung: Um 7.95 ml PBS hinzufügen 150 ul Xylazin (AnaSed Injektion von 100 mg / ml) und 700 ul von Ketamin (Ketaset &#160; CIII, 100 mg / ml). </li><li> Um aseptischen Bedingungen während des Verfahrens zu gewährleisten, Handschuhe, Gesichtsmaske und OP-Kittel. </li><li> Wiegen Tiere. Anesthetize sie durch die Injektion intraperitoneal (ip) die in Schritt 3 in einer Dosierung von ul (10x Körpergewicht in g) genannten Mischung. Zum Beispiel für eine Maus mit einem Gewicht von 22 g, zu verwalten 10x22 = 220 ul der Mischung von Anästhetika. Somit werden die endgültigen Dosen von Xylazin und Ketamin 17 und 80 mg / kg Körpergewicht. Stellen Sie sicher, dass die Narkose ausreichend ist, keine Beugung der Extremität sollte nach Zehe Prise hergestellt werden. Hinweis: Verwenden Sie Augensalbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Zeigen Tiere auf eine saubere Arbeitsfläche auf dem Rücken. Tails und Hinterpfoten sind auf die Ermittler ausgerichtet. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Alkohol (70% EtOH-Lösung). Hinweis: Chirurgische Bereich sollte komplett rasiert werden, um eine Verunreinigung der Wunde durch den Kontakt mit vermeidenFell. Auch optimal, eine zirkulierende Warmwasser-Pad sollte zur Normothermie von betäubten Mäusen während der Operation beibehalten werden. </li><li> Durch die Verwendung eines Skalpells, machen Sie einen kleinen Hautschnitt in Längsrichtung parallel und ca. 1 cm links der Mittellinie. Noch nicht eindringen in die Bauchhöhle. Verwenden Sie kleine Schere, um die anfängliche Schnitt verlängern. </li><li> Identifizieren Bauchmuskeln und zu zerlegen, den Zugang in die Bauchhöhle zu gewinnen. </li><li> Durch die Verwendung von stumpfen anatomische Pinzetten, identifizieren den Blinddarm und verschieben Sie sie aus der Bauchhöhle. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße beschädigen (dies kann zu tödlichen Blutungen führen kann). </li><li> Ligieren 60% der Blinddarm, eine Mitte-Grade-Sepsis zu erzielen. Ligation von gleich oder mehr als 75% des Blinddarms führt in der Regel hochwertige Sepsis, während Ligation von gleich oder weniger als 25% der Blinddarm Ergebnisse in low-grade Sepsis. Achten Sie darauf, die lleozökalklappe (dies könnte die Darmkontinuität zu blockieren) zu ligieren. </li><li> Durch die Verwendung eines21 G Nadel perforieren Blinddarm von einem durch und durch Punktion (zwei Löcher) in der Nähe der Ligation. Die Richtung der Perforation sollte der mesenterialen der Anti mesenterialen Seite des Blinddarms sein. Seien Sie vorsichtig, nicht zu mesenterialen Blutgefäße durchstechen. </li><li> Entfernen Sie die Nadel. Drücken Sie vorsichtig die ligiert Blinddarm, um die Durchgängigkeit durch die beiden Löcher zu bestätigen, nur eine kleine Menge von Fäkalien sollte durch sie extrudiert werden. </li><li> Bewegen Sie den ligiert und punktiert Blinddarm in die Bauchhöhle. Hinweis: Für Schein Mäuse, überspringen Sie die Schritte von 1,10 bis 1,12. </li><li> Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchmuskulatur zu schließen. Verwenden Seide chirurgisches Nahtmaterial 6-0 mit Schneid Nadel Bauchhaut zu schließen. </li><li> Spritzen 1 ml vorgewärmten (37 ° C) normaler Kochsalzlösung ip, Wärme-und Flüssigkeitszufuhr während des Verfahrens verloren zu ersetzen. Legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe, bis ihre Lungen-Wiederbelebung. Hinweis: Optimal ist ein sicherer Wärmegerät (such als zirkulierendes warmes Wasser Pad) kann anstelle einer Wärmelampe verwendet werden. </li><li> Postoperativ injizieren Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht sc). Analgesie zu erreichen. Hinweis: Ein Tier sollte nicht unbeaufsichtigt bleiben, bis er wieder zu Bewusstsein kam, um ausreichend Brustlage zu halten. Ein Tier, das eine chirurgische Behandlung unterzogen wurde, nicht auf die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig zurückgewonnen. </li><li> Zeigen Tiere zurück in ihre Käfige mit unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser. Mäuse eingeschläfert werden, wenn sie moribund (von klinischen Zeichen wie Fehler zu bewegen, wenn sie berührt oder Zyanose bezeichnet) zu werden. Überprüfen Mäuse alle 4 Stunden zu vermeiden, dass sie vor der Euthanasie sterben. </li></ol> 2. Tissue Ernte und Fixation <ol><li> Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung: Um 889 ml PBS hinzufügen 111 ml 37% PFA. </li><li> Sacrifice Mäuse entweder mit CO 2-induzierte Narkose oder Ketamin / Xylazin slösung in einer hohen Dosierung. </li><li> Immobilisieren die Mäuse auf eine saubere Arbeitsfläche. Sprühen Sie die Bauch-und Brusthaut mit 70% EtOH-Lösung, um es zu desinfizieren. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell und eine kleine Schere, um den Bauch-und Brusthaut sowie die Haut, die den Luftröhrenbereich zu entfernen. </li><li> Reveal Luftröhre durch Entfernen der umliegenden Gewebe (Muskeln und Bindegewebe). </li><li> Legen Sie eine Naht (ohne Schneid Nadel) um die Luftröhre. Weiß noch nicht festziehen. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen peripheren Venenkatheter (20 G) auf &#39;intubieren &quot;Luftröhre. Seien Sie vorsichtig, während der Katheter an Luftröhren Träne zu vermeiden. Beachten Sie, dass der größte Durchmesser der Luftröhre ist gerade unterhalb des Ringknorpels. </li><li> Ziehen Sie den Faden um die Luftröhre / Katheter. Nach Entfernen der Nadel so dass nur die Kunststoffkanüle der Katheter in die Trachea. Nadel diente nur als Führungsdraht zum Einsetzen der Kunststoffkanüle. </li><li> Nachdem die Kunststoffkanüle in die Luftröhre gesichert, schneiden the Bauchmuskulatur, öffnen Sie den Bauch und zeigen die Membran. </li><li> Mit einer Nadel punktieren die Membran Pneumothorax (dh Einsetzen von Luft in die Brusthöhle) zu produzieren. Lungen sollten dann zusammengelegt werden. </li><li> Mit einer kleinen Schere, entfernen Sie die Membran entlang des Brustbeins (Sternotomie) schneiden, entfernen Sie den Brustkorb und zeigen das Herz und die Lunge. </li><li> Durch die Kunststoffkanüle in die Trachea eingeführt, fixieren die Lungen mit der Formaldehydlösung unter 30 cm H 2 O Druck. </li><li> Entfernen Sie die Lungen und legen Sie sie in die 4% PFA für 24 h und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung. </li><li> Suchen und entfernen Sie Herz, Leber und Nieren. In gleicher Weise stellen sie in 4% PFA für 24 Stunden und anschließend in 70% EtOH-Lösung bis zur Verarbeitung. </li></ol> 3. GFP-Mäuse und Anzeigen von GFP Slides <ol><li> Führen CLP-und Scheinoperation auf GFP-LC3-Mäuse wie in Schritt 1 und postoperative Verfahren beschriebens wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben. </li><li> Betten Sie das Gewebe (insbesondere Lunge, Herz, Leber und Nieren) in Paraffin und schneiden Sie sie in Serien 5 um Abschnitte. </li><li> Wenn Sie bereit sind für GFP-Färbung, Inkubation bei 60 ° C für 30-60 Minuten, bis Paraffin schmilzt und Gewebe scheint scheinend. </li><li> Entparaffinieren mit Standard abgestufte Reihe von Xylol oder Xylol ersetzt, 5 min Xylol 1, 2 Xylol und Xylol 3 dann 3 min Inkubation in abgestuften Reihe von EtOH: 100%, 95%, 75%, und dann spülen in destilliertem Wasser. Hinweis: Nach Entparaffinierung vermeiden Gewebeaustrocknung, die Probe Hintergrund erhöht. </li><li> Antigen-Wiedergewinnung durchzuführen unter Verwendung von Zitronensäure-Puffer (10 mM Natriumcitrat Säure, 0,05% Tween 20, pH 6,0), durch die Mikrowelle für 10-20 min. Achten Sie darauf, in regelmäßigen Abständen zu ersetzen, um Puffergewebeaustrocknung zu vermeiden. </li><li> Anschließend Lösung für 20 Minuten auf der Bank zu kühlen, um Antigen-Retrieval abzuschließen. </li><li> 2-3x Waschen mit PBS. Überschüssigen Puffer und transfer gleitet von der Zahnstange in die horizontale Position in einer Dia-Box oder anderen feuchten Kammer, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Block 45-60 min bei Raumtemperatur mit 10% normalem Eselserum (auch 5% Rinderserumalbumin, oder bevorzugt Serum aus dem Tier, in dem der sekundäre Antikörper erzeugt wurde) in PBS. </li><li> Verwendung von Primär GFP Antikörper inkubieren einer Verdünnung von 1:100 in PBS über Nacht bei 4 ° C in der feuchten Kammer. Kleine Stücke von Parafilm über Gewebe sanft an mit Antikörper homogene Kontakt mit dem Gewebe fördern und verhindern, dass die Verdunstung. Hinweis: Verbleibende Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. </li><li> 5x Waschen mit PBS, um überschüssige primäre Antikörper zu entfernen. Inkubieren mit sekundärem Antikörper 1:500-1:1,000 in PBS für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> 5x Waschen mit PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Falls gewünscht, Gegenfärbung der Objektträger bei diesem Schritt. </li><li> Wenn unter Verwendung von fluoreszierenden sekundären Antikörper, Inkubation 0,1% Sudan Schwarz in 70% EtOH foder 15-20 min auf Autofluoreszenz zu reduzieren. Wischen Sie überschüssiges Sudan Schwarz aus aller Gewebe und waschen 5x mit PBS über 20 min. </li><li> Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat. </li></ol> 4. Alternative Protokoll: Direkter Nachweis von GFP-LC3 <ol><li> Kanülieren und blasen Lunge mit ~ 500 ml 50/50 v / v Oktober PBS. </li><li> Im Oktober, indem eine kleine Menge von Oktober in den Boden einer cryomold einbinden. </li><li> Legen Sie das seziert Lungenkomplex in der Form. </li><li> Langsam frieren unter Verwendung von Trockeneis über Methyl gekühlt. </li><li> Noch Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt und eingefroren solide. Halten Sie auf Trockeneis und bei -80 ° C </li><li> Mit einem Kryomikrotom, schneiden 5-10 um dicke Schnitte Schutz der Abschnitte aus Licht. Speicherabschnitte und die verbleibenden Gewebe bei -80 ° C. </li><li> Um Folien für die Bildgebung vorzubereiten, entferne Abschnitt aus dem Gefrierschrank und einem Tropfen PBS sofort anwenden, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Fix für 30 min mit 4% PFA. Mit PBS waschen. </li><li> Bewerben DAPI / Hoechst für 10 min. 3x Waschen mit PBS. </li><li> Montieren Probe mit Deckglas und horizontal zu speichern, bis Montagelösung gesetzt hat. </li><li> Bild mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop. Proben bei 4 ° C für bis zu einem Monat. </li></ol> 5. Herstellung von Seiden für Elektronenmikroskopie <ol><li> Schneiden Gewebe in etwa 1 mm Würfel zur Befestigung. </li><li> Fix das Gewebe in 2% Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,4. </li><li> Waschen mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 1-2 Std. Hinweis: Fest Gewebe in 0,1 M Natriumcacodylat bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Sende fix in 1% Osmiumtetroxid in 0,2 M Natriumcacodylatpuffer für 1 Stunde. </li><li> Spülen in 0,2 M Natriumkakodylat-Puffer für 10 min 3x. </li><li> Entwässern in 70% EtOH, 20 min 2x. Entwässern in 90% EtOH, 10 min 2x. Entwässern in 100% EtOH,2x 20 Minuten. </li><li> Inkubation mit Propylenoxid (Epoxy Propan) für 10 min 2x. </li><li> Inkubieren mit Propylenoxid / Epoxyharz-Mischung (50:50) für 1 Stunde. Das Epoxidharzgemisch ist: 24 g Agar 100 Harz, 13 g Dodecenylbernsteinsäureanhydrid, 13 g Methylnadinsäureanhydrid und 1 ml N-Benzyldimethylamin. Gründlich mischen in einem Einweg-Becher mit einem Holzspatel. </li><li> Inkubation mit Epoxidharz über Nacht unverschlossen in Fläschchen (dies kann jeder restliche Propylenoxid verdampfen). </li><li> Bei markiertem Kapseln mit frisch zubereiteten Harz einbetten. Polymerisation bei 60 ° C für 48 Stunden. </li><li> Foto Gewebeschnitten unter Verwendung eines Transmissions-Elektronenmikroskops bei 80 oder 60 kV auf Elektronenmikroskop Film. Drucken Sie die Bilder auf Fotopapier oder als digitale Medien zu speichern. </li><li> Analysieren Autophagosom Bildung in intakten Zellen Kern mit. Niedriger Energiefelder (e. G. 2.000-4.000 X) kann verwendet werden, um kernhaltigen Zellen zu identifizieren. Typischerweise 6,800-10,000 X Bilder für th verwendetist Autophagosom Quantifizierung. Graf Autophagosomen pro Flächeneinheit von 15 bis 30 Felder für entsprechende statistische Darstellung. Autophagosomen haben Doppel-Membran-Struktur, in der späten Phase autophogosomes glich gefüllter Vakuolen. </li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine finanziellen Interessen im Wettbewerb zu erklären

Der große Vorteil des CLP ist, dass es erlaubt Forschern, Sepsis unterschiedlicher Schweregrade (dh von Low-bis Mid-und High-grade) zu untersuchen. Der Schweregrad der induzierten Sepsis wird durch die Länge der Blinddarm ligiert (was die wichtigste Determinante) betroffen, die Größe der Nadel für die Punktion verwendet, und die Anzahl der Löcher 15 durchgeführt. Darüber hinaus kann die Maus-Stamm und Geschlecht von der Schwere der Sepsis beeinflussen; mehrere Stämme sind anfälliger als and...

Sepsis, eine systemische entzündliche Reaktion auf eine Infektion, eine der häufigsten Todesursachen bei kritisch-kranken Patienten ein. Intra-abdominale Infektionen, die oft polymikrobiellen Sepsis führen, entfallen 20% der Sepsisfälle, die erhebliche Sterblichkeit von bis zu 60% 2 haben. Sepsis-assoziierte Mortalität resultiert im Wesentlichen aus Multi-Organ-Dysfunktion mit anschließender Organversagen 3,4. Weitere Untersuchungen in den Pathomechanismus dieser Erkrankung ist dringend erforderlich, um die Entwicklung neuer und wirksamere Therapien zu fördern. Die Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Modellierung von Sepsis in vivo. Wie der Blinddarm ist voll von Bakterien, seiner Punktion ergibt polymikrobiellen Peritonitis, Translokation von Bakterien in das Blut (Bakteriämie), septischer Schock, Multi-Organ-Dysfunktion und schließlich Tod 5. Es ist allgemein anerkannt, daß CLP reflektiert klinischenRealität genauer als frühere Verfahren, wie Injektion von Endotoxin oder gereinigten Bakterien in Nagetieren Somit CLP wird als Goldstandard (wenn auch nicht ohne Einschränkungen) 6 für die experimentelle Induktion und somit die Untersuchung der Pathogenese von Sepsis. In dieser Monographie, beschreiben wir Protokolle entwickelt, um zu beurteilen, ob pathogene Mechanismen der Sepsis sind Autophagie. Autophagy eine evolutionär konservierte zelluläre Prozess erleichtert den Umsatz von beschädigten Proteinen und Organellen, wie Mitochondrien und spielt eine wichtige Rolle bei der Clearance von intrazellulären Pathogenen wie Bakterien 7,8. Während Autophagozytose sind cytosolische Proteine ​​oder Organellen in die Doppelmembran-Vesikel gebunden genannt autophagosomes, die anschließend zu den Lysosomen zum Abbau 9 geliefert werden abgetrennt. Eine Reihe von Proteinen, wie den Säugerhomologen Autophagozytose-Genen (ATG) identifiziert,ursprünglich in der Hefe, die den Prozess der Autophagie regulieren identifiziert. Die Umwandlung von Mikrotubuli-assoziierten Protein-1-Leichtketten-3B (LC3B) (Homolog Atg8) aus LC3B-I (freie Form) zu LC3B-II (Phosphatidylethanolamin-konjugierter Form) stellt einen wichtigen Schritt in Autophagosom Bildung 9. Autophagische Dysfunktion ist mit dem Altern und der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen 10 zugeordnet. Darüber hinaus wirkt sich die Autophagie angeborenen und erworbenen Immunität, wie Antigen-Präsentation, Lymphozytenentwicklung und Zytokin-Sekretion von Immunzellen 8. So scheint es sinnvoll, dass die Autophagie könnte auch in der systemischen Entzündungsreaktion auf eine Infektion (zB bei Sepsis) eine Rolle spielen. Bisher mehrere Verfahren beschrieben worden, um die Rolle der Autophagie in Gewebeverletzung in vivo zu beurteilen. Dazu gehören der Einsatz der grünen Fluoreszenz-Protein (GFP)-LC3 exprimierenden Mäusen und die Quantifizierung der AutoPhagosomen in Gewebe durch Elektronenmikroskopie (Diese beiden Verfahren werden in dieser Monographie beschrieben). Weitere Methoden sind die Quantifizierung von Autophagie-Protein-Expression in Gewebehomogenaten, und die Analyse der Autophagie Fluss (wie an anderer Stelle beschrieben), 11-13. Das Ziel dieser Überprüfung ist es, für die Beurteilung der aktuellen Protokolle Autophagie in vivo im Rahmen der experimentellen Sepsis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >GFP-LC3 Transgenic Mice</td>
			<td >Riken (Japan)</td>
			<td >RBRC00806</td>
			<td >GFP-LC3#53</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >568-0606</td>
			<td>Xylazine HCl Injection Vet</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >995-2949</td>
			<td>Ketaset Inj 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A405-20</td>
			<td>Histology Grade</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EtOH</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>A407-1</td>
			<td>For Sterilizatiion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >silk surgical sutures 6-0</td>
			<td >Owens &#38; Minor</td>
			<td >2300-0078OG, 017624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >buprenorphine-HCl</td>
			<td >Henry-Schein</td>
			<td >614-5157</td>
			<td>Buprenex Ampules</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paraformaldehyde (37%) solution</td>
			<td >JT Baker</td>
			<td >S898-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >xylenes</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP monoclonal antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>G10362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hoescht</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>944403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OCT</td>
			<td >VWR scientific</td>
			<td >25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan Black</td>
			<td >Santa Cruz</td>
			<td >sc-203760</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate</td>
			<td >Electron microscopy Sciences</td>
			<td>15960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >propylene oxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>240397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar 100 resin</td>
			<td >Agar scientific</td>
			<td > R1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dodecenylsuccinic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>46346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >methylnadic anhydride</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >N-benzyldimethylamine</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>185582</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cecal ligation and puncture-induced sepsis as a model to study autophagy in mice

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode, die Sepsis verursacht polymikrobiellen induziert werden. Hier wird ein Protokoll vorgesehen, um Sepsis unterschiedlichen Schweregrades in Mäusen zu induzieren mit der CLP Technik. Autophagie ist ein Grundgewebereaktion auf Stress und Krankheitserreger Invasion. Zwei Stromprotokollen zu Autophagozytose in vivo im Rahmen des experimentellen Sepsis beurteilen sind auch hier vorgestellt. (I) Transgene Mäuse, grün fluoreszierendes Protein (GFP)-LC3-Fusionsprotein exprimieren, werden CLP unterworfen. Lokalisierten Erhöhung der GFP-Signal (puncta), entweder durch immunhistochemische Assays getestet oder konfokalen kann verwendet werden, um verbesserte Bildung Autophagosom erfassen und somit verändert Aktivierung der Autophagie werden. (II) Verbesserte autophagischen Vakuole (Autophagosom)-Bildung pro Einheit Gewebebereich (als Marker der Autophagie Stimulation) kann mit Hilfe der Elektronenmikroskopie quantifiziert werden. Das Studium der Autophagie Antworten auf Sepsis ist eine kritische Layoutonent Verständnis der Mechanismen, durch die Gewebe reagieren auf eine Infektion. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztendlich zum Verständnis der Pathogenese der Sepsis, die ein großes Problem in der Intensivmedizin stellt beitragen.

Bakteriämie bei Mäusen vorhanden ist, so früh wie 6 Stunden nach der CLP-induzierten Sepsis 14. Klinische Zeichen einer Sepsis (einschließlich Schüttelfrost, Tachypnoe und eingeschränkte motorische Aktivität) erscheinen etwa 12 Stunden nach dem Eingriff. Mäuse CLP unterworfen beginnen bei rund 18 Stunden nach Induktion der Peritonitis sterben. Je schwerer ist die Sepsis die mehr erhöht ist die Letalität 15. Im Detail führt hochwertige Sepsis 100% Mortalität innerhalb von 2-3 Tagen, wäh...

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Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie.

Blinddarm-Ligation und Punktion-induzierten Sepsis als Modell zur Autophagie in Mäusen untersucht

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

cecal-ligation-puncture-induced-sepsis-as-model-to-study-autophagy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.1K Aufrufe.  Brigham and Women's Hospital.  Experimentelle Sepsis in Mäusen mit der Blinddarm-Ligation und Punktion (CLP)-Methode ausgelöst werden. Aktuelle Protokolle Autophagozytose in vivo im Rahmen des CLP-induzierten Sepsis beurteilt werden hier vorgestellt: Ein Protokoll für die Messung unter Verwendung Autophagozytose (GFP)-LC3 Mäuse und ein Protokoll für die Messung Autophagosom Bildung durch Elektronenmikroskopie. 

Serie: Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for establishing new therapeutic approaches in this field. Therefore, animal models are required that are able to closely mimic the human disease and also sufficiently deal with scientific questions. The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. In this model, a small stent is surgically inserted into the ascending colon of mice or rats leading to a continuous leakage of intestinal bacteria into the peritoneal cavity. The procedure results in peritonitis, systemic bacteraemia, organ infection by gut bacteria, and systemic but also local release of several pro- and anti-inflammatory cytokines. The lethality of CASP can be controlled by the diameter of the inserted stent. A variant of this model, the so-called CASP with intervention (CASPI), raises opportunity to remove the septic focus by a second operation according to common procedures in clinical practice. CASP is an easily learnable and highly reproducible model that closely mimics the clinical course of abdominal sepsis. It leads way to study on questions in several scientific fields e.g. immunology, infectiology, or surgery.

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

The Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) is a highly standardized model for polymicrobial abdominal sepsis in rodents. This article describes the surgical procedure of CASP. The CASP model and its variants allow the systematic investigation of various problems concerning the subject of sepsis.

Colon ascendens Stent Peritonitis (CASP) - ein standardisiertes Modell für polymikrobiellen Abdominal Sepsis

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Eine kontrollierte Mausmodell für neonatale Sepsis Biofilm

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Design von Cecal Ligation und Punktion und Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...