Wir danken Dr. R. Michael Sramkoski für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie, Dr. Purnima Jaiswal und Dr. Di Wu für frühere Eingang und Ilya Aylyarov Hilfe zu den Illustrationen. Unterstützt durch NIH Grant R01GM089872 und Cytometry &amp; Imaging Microscopy Core Facility des Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

Ein. Haploid Cell Growth <ol><li> Wachsen S. cerevisiae-Zellen aus dem S288C Hintergrund (BY4741) unter Standardbedingungen 10. </li><li> Transform Haploiden entweder Ausdruck von zwei auffälligen Fluoreszenzmarker 10. Die Markierungen der Wahl sind lösliche GFP im Zytoplasma exprimiert (pEG220, URA3/YIp, linearisiert mit BglII 11) und eine einzige ribosomalen Protein, RPL25 mit mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, aus A. Johnston) fusioniert. Wir erwarten, dass gleich zwei-color Aufreinigungsprotokolle konnte Verwendung anderer hell fluoreszierende Proteine, die von den haploiden parentalen Zellen synthetisiert werden können. Alternativ könnte die Zellwand mit fluoreszierenden Lektine kennzeichnen. </li><li> Am Tag vor Zygote Aufreinigung inokulieren 5 ml Kulturen von jedem Zelltyp und wachsen sie unter Schütteln über Nacht bei 23 ° C bis A600 erreichen höchstens 1,0. Wachsen GFP Transformanten (ATY4442) in kompletten synthetischen Medium mit 2% Glucose (CSM-Glucose) einernd RPL25-mCherry Transformanten (ATY4552) in synthetischer selektiver Medium ohne Uracil 10. Pflegen parallelen Kulturen jedes Zelltyps unter Schütteln bei Raumtemperatur. </li></ol> 2. Die Durchführung einer Kreuz <ol><li> Einstellen der optischen Dichte (A600) jeder Probe auf 1,0 in frischem Medium. [1 Optische Dichte Einheit ~ 3 x 10 7 Zellen / ml] </li><li> Mischen gleicher Volumina der beiden Kulturen Wirbel kurzzeitig 3 mal, um eine längere Vortex für 10 sec, gefolgt. </li><li> Bereiten CSM-Glucose-Platten. Die Platten sind identisch mit denen für die routinemäßige Wachstum verwendet und wurden 45 Minuten nach dem Gießen und Erstarren des Agars 10 getrocknet. </li><li> Verteilen so viele wie 20 ml 40-Tröpfchen des Gemisches 1 cm von der Kante der Oberfläche der CSM-Glucose-Platten. Wenn die Tröpfchen werden zunächst auf die Oberfläche aufgetragen startet den Timer zur Messung verstrichenen Zeit. Sobald die Flüssigkeit aufgesogen ist (ca. 30 min), die Platten abdecken und lassen sie ungestört bei room Temperatur. </li></ol> 3. Harvesting Vorbereitungen <ol><li> Ernteproben nach 1,75-2,5 h bei 23 ° C durch mehrmaliges Waschen einzelnen getrockneten Tröpfchen von der Platte unter Verwendung von 150 ml kaltem CSM-Glucose, halten die Platten auf Eis. Wiederholt waschen das Tröpfchen Bereich 10-20 mal mit dem gleichen Medium zur Erholung zu maximieren. Sammle in 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis. </li><li> Sonde beschallen die Proben 10x bei 60% Amplitude mit einer Fisher FB120 Ultraschallgerät (120Watt, 120Volt, Freq 20kHz) auf Eis. </li><li> Überprüfen Sie in einem Phasenkontrastmikroskop, dass nur wenige oder gar keine Aggregate bleiben. 15-50% der Zellen erwartet gebildet Zygoten an dieser Stelle haben. </li><li> Verlassen das Rohr von Zellen in einer vertikalen Position ungestört auf Eis für 10 min als weitere Sicherungsmaßnahme (damit Aggregate absetzen). </li><li> Recover den obersten 90% des Volumens und filtern sie durch ein Nylonnetz (BD Falcon Polypropylen Rohr mit Sieb Kappe (Ref 352235)). In einem typischen Experiment, 10 7 Zellenerholte sich von einer Platte waren zu diesem Zeitpunkt in 4 ml CSM-Glucose verdünnt. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie <ol><li> Sortieren Zellen unter Verwendung des Sony ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer, (Highly Automated Parallel Sort) HAPS1 mit einer 100 Mikrometer Spitze. Für GFP Anregung, den blauen Argon-Ionen, 250 Milliwatt-Laser bei 488 nm. Für mCherry Erregung, mit der 100 Milliwatt-Laser bei 561 nm. Obwohl wir noch keine Erfahrung mit anderen Maschinen, erwarten wir, dass Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx oder Beckman Coulter MoFlo XDP wäre schön, wenn sie mit den richtigen Laser ausgestattet. </li><li> Basis Sortierparameter an einem vorderen vs zurück Streudiagramm um Tor auf lebensfähigen Zellen. Stellen Sie eine Emission Grundstück von 615 + / - 30 nm Bandpassfilter (mCherry) versus 525 + / - 25 nm Bandpassfilter (GFP), um die Ereignisse in vier Quadranten unterteilt, &quot;Rot + Grün-&quot;, &quot;Rot + Grün +&quot;, &quot;Red- Green-&quot;und&quot; Rot-Grün + &quot;(Abbildung S2). Verwenden nichtfluoreszierenden Zellen als Standard foder Bestimmung der &quot;Red-Green-Quadranten&quot;. </li><li> Sortieren von Zellen mit einer Hülle Druck von 21,5 psi, ein Tröpfchen Frequenz von 43.400 Tropfen / sec und einer Probe Druck von 20,5 psi. </li><li> Initial Sort (&quot;Recovery Mode&quot;): Die Proben in ein gekühltes Eppendorf-Röhrchen mit 250 ml kaltem CSM-Glucose. Sediment 10 sec bei Höchstgeschwindigkeit in einem gekühlten Mikrofuge (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) und saugen Sie den Flow-Lösung (Durchflusszytometrie Mantel-Lösung (PBS mit 1 mM EDTA) BioSure Katalog Nr. 1027). Resuspendieren in 500 ml kaltem CSM-Glucose. </li><li> Zweitens Sort (&quot;Purity Mode&quot;): Führen Sie die Art wie für die ursprüngliche Art, mit der &quot;Reinheit Modus&quot;. Sediment das gereinigte Zellen und Resuspendieren der Pellets in 500 ml 1,0 ml-CSM-Glucose. Schütteln für 15 min in 24-Well-Platten bei 23 ° C, um metabolische Erholung zu ermöglichen. </li></ol> 5. DeltaVision Microscopy <ol><li> Bereiten Agarose Pads wie folgt: Bringen Sie eine Suspension von 1,5% Agarose (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) in CSM-Glukose aufkochen, kurz vortexen und wenden dann 0,3 ml Proben des Agarose-Lösung auf die Oberfläche des horizontalen Standard-Glas-Dias und decken Sie sie auf einmal mit einem zweiten Schlitten (ohne Ausüben von Druck). </li><li> Nach dem Abkühlen für 10 min, entfernen Sie vorsichtig die obere Schieber, indem es horizontal, kümmert um eine glatte Oberfläche zu verlassen und nicht auf die Agarose-Schicht zu stören. (Wenn die obere Folie entfernt worden ist, so sollte die Probe von Zellen innerhalb von 1-2 min angewendet werden. Wenn in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur ohne Entfernen der oberen Folie gehalten, Pads für gespeichert werden bis zu einem Tag vor der Verwendung.) </li><li> Sedimentproben und Kaution 1 ml Aliquots des Pellets auf Agarose-Pads (ohne Berührung der Oberfläche). Sofort die Probe mit einem quadratischen Nr. 1 Deckglas. Schneiden Sie überschüssige Agarose mit einer einseitig geschliffenen Rasierklinge. Verschließen Sie die Präparate mit Vaseline aus einer Spritze verzichtet. </li><li> Bild mit Deltavision (Applied Precision) mit einem 100x Ölimmersionsobjektiv ohne Binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z-Stacks mit dem Softworx 5.0.0 Programm ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) und verarbeiten minimal. Sukzessive z-Ebenen wurden im Allgemeinen bei 0,2-0,4 Mikron Abständen entnommen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Fluoreszenzintensität Ebenen in transformierten haploiden Zellen: Die Höhe der Fluoreszenz in den Haploiden ist in Abbildung S1 dargestellt. Bevor das Kreuz, Epifluoreszenz Untersuchung zeigte, dass im Wesentlichen alle GFP Transformanten grün waren und dass alle mCherry Transformanten, obwohl oft schwächer, waren rot. Um sicherzustellen, dass alle Zellen für das Kreuz verwendet tatsächlich um fluoreszierende, nutzten wir die Subpopulation mit dem hellsten Fluoreszenzsignal. Rendite: Aach der ersten Art, die Rot + Grün + Probe (Abbildung S2) umfasst in der Regel 8-20% des Eingangs Anzahl der Zellen und eine übermäßige Anzahl von haploiden Zellen, vielleicht wegen der anhaltenden Zell-Zell-Adhäsion. Da hohe Anreicherung nicht mit einer einzigen Art erreicht, sollte die teilweise gereinigte Probe sein Sonde resuspendiert und zweimal mit 60% Amplitude durch Umsortieren gefolgt. (Recovery Arten dauern in der Regel zwischen 1-2 Stunden, während die zweite Art benötigt nur 15 min.) Von den Zellen der zweiten Art ausgesetzt, enthalten die Rot + Grün + Proben 23-52% der eingesetzten Zellen. Phase mikroskopische Untersuchung: Prüfung durch Phasenkontrast-Mikroskopie zeigte, dass die Reinheit des Endproduktes Zygote Vorbereitung ca. 90%, gemittelt über 21 Präparate (von 86% auf 91%). Die Verunreinigungen waren entweder grün oder rot Haploiden, oder Paare von Haploiden, die in Kontakt miteinander sind. Abbildung 3 tabellarisch den Prozentsatz von Zygoten, die habenkeine Knospe, medialen Knospen (Med), seitlichen Knospen (Lat) oder Endknospen (Term), die Anzahl von gepaarten Haploiden der gleichen Farbe (&quot;2Same&quot;) oder andere Farbe (&quot;2Hap&quot;), sowie einzelnen Haploiden ( Hap). Wenn die Zellen nach 1,75 h geerntet wurden, wurden mehr als 50% unbudded und die weitere Unterkategorien (mit medialen, lateralen oder Endknospen) waren gleichermaßen vertreten. Nach 2,5 Stunden waren ca. gleiche Anzahlen von Zygoten in jeder der vier Kategorien (unbudded mit medialen, lateralen oder terminalen Knospen). Mikroskopische Beobachtungen (Abbildung 4): Die Struktur der Zygoten scheint zu bleiben während der Reinigung unverändert. Nach der Dauer des Kreuzes hatte der Population unterschiedliche Anteile unbudded und geknospten Zygoten, wie oben erläutert. Da sowohl die grünen und roten Haploiden zeigten erhebliche Unterschiede im Fluoreszenzsignal Intensität, waren einige Zygoten überwiegend rot während andere überwiegend grün, wie Comparin beobachtet wirdg die einfarbigen Bilder auf die kombinierten Bilder in 4. Man beachte auch, dass der GFP (MW 26kDa) den Kern eintritt und kann im Kern selbst wenn die Kerne haben nicht fusioniert gefunden werden. Vakuolen stehen als schwarze nicht-fluoreszierenden Kugeln. Das Endprodukt der Reinigung ergibt eine diverse Population in verschiedenen Stadien der Entwicklung. Zygoten mit A nicht durchlaufen Fusion. Typ B Zygoten werden unbudded. Typ C haben eine kleine Knospe. Typ D haben eine größere Knospe, und Typ E Zygoten sind dabei Zytokinese unterziehen. Man beachte auch, dass viele der zuvor Zygoten immer noch eine nicht fluoreszierende medialen Teilungslinie (*), und dass die vakuoläre &quot;Vererbung Struktur&quot; (I) 12 kann oft gesehen aus der Zygote in der Knospe zu verlängern. In manchen Fällen hat der grüne Signal in den Partner zu einem viel größeren Ausmaß, dass das Rotsignal umverteilt. Dies spiegelt die Verzögerung der Übertragung charakteristischen Polysomen (Tartakoff, in Vorbereitung) ist. 6 Zygoten, was ausreichend ist für viele Immunoblots unter Verwendung Chemilumineszenznachweis Verfahren. Verwendung von Phenol-Chloroform isoliert Protokollen wir extrahieren etwa 1,5 mg RNA aus dieser Anzahl von Zellen. Da die gereinigten Zygoten haben gekühlt worden, vor der weiteren Analyse empfiehlt Inkubation bei 23 ° C in Wachstumsmedium. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chronologie der Zygote Bildung. Zygotes als Vermittler zwischen Haploiden und Diploiden. Dieses Diagramm zeigt die klassische Aktivierung (shmooing) der Haploiden, ihre Fusion und die Bildung der ersten Knospe. Knospen kann entweder mediale (M), laterale (L) oder Terminal (T). <imgalt = &quot;Abbildung 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Schematischen der Zygote Aufreinigungsprotokolls. Nach Inkubation auf die Oberfläche von Agarplatten in Vollmedium mit Glucose, das Zellgemisch wurde durch Waschen gewonnen und dann auf einen Anfangswert Sortierung in &quot;Wiederherstellungsmodus&quot; durch eine zweite Art in &quot;Reinheit Modus unterzogen. &quot; Die gelbe Farbe bedeutet, dass sowohl mCherry und GFP-Signale sichtbar in den Zygoten waren. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Abbildung 3. Sorten von Zygoten in den gereinigten Fraktionen. Mating Mischungen wurden nach 1,75 oder 2,5 h bis Fraktionen in einem relativ frühen vs relativ reifer Zygoten angereichert erholen geerntet. Acht unabhängigen Experimenten, die von den unterschiedlichen Farben bezeichnet, wurden für jeden Zeitpunkt ausgeführt. Die Diagramme zeigen die relative Anzahl von Zygoten, dass have räumlich unterschiedlichen Mustern der Knospenbildung. Angesichts der kurzen Dauer der Inkubationszeit (weniger als 2,5 Stunden bei Raumtemperatur) alle Knospen beobachtet wurden, sind erste zygotischen angehenden Ereignisse. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Abbildung 4. DeltaVision Prüfung angereicherten Fraktionen. Ein typisches wurde von Deltavision Mikroskopie untersucht. Die Abbildungen zeigen entweder beide rot und grün oder einzelne Farben. Die rote entspricht der Polysomen Etikett (Rpl25p-mCherry) und der grün cytosolische GFP. Beachten Sie die hohe Anreicherung von Zygoten, und die benannten subzelluläre Merkmale: die Vakuolen (v), Knospen (b), Kern (n), Vakuole &quot;Vererbung Struktur&quot; (i), und die Partition (*), die die elterliche Trennung scheint Domänen in relativ frühen Zygoten. Ihre variablen Gesamtfarbe spiegelt die relative Intensität der Haploiden, die fusioniert. In Fällen, in denen die beiden elterlichen Domains behalteneine deutliche Farbe war Äquilibrierung der Marker (cytoplasmatische GFP-markierten Polysomen mCherry) unvollständig. Zeitraffer-Studien im Gange zeigen, dass lösliche GFP verteilt vor Polysomen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Ergänzende Legends <img alt="Abbildung S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> Abbildung S1. Fluoreszenz von haploiden Zellen Ganz links:. Zellen, mCherry-markierten Polysomen wurden untersucht, um ein grünes Signal zu erkennen. Das rechteckige Fenster wurde eingestellt, um die negativen Zellen zu vermeiden. Mittlere Kurve: Zellen, die cytosolische GFP analysiert wurden, zeigt die deutlich heller Ballungszentren Positives. Ganz rechts: Zellen, die mCherry-markierten Polysomen wurden analysiert. Das Rechteck (identisch mit der auf dem ganz links) enthält die hellsten Zellen und ermöglicht allenNegative zu vermeiden. Die Bezeichnung &quot;R2&quot; bedeutet den Prozentsatz an Zellen innerhalb des vorgegebenen Rechtecks ​​zurückgewonnen. <img alt="Abbildung S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Abbildung S2. Zellverteilung in ersten und zweiten Sortierung. Diese zweifarbigen Flächen geben den Anteil der Grün + rot + Zellen in dem oberen rechten Quadranten (R5). Dieser Anteil erhöht sich auf 52% in der zweiten Sorte. Horizontale Achse: grünes Signal. Vertikale Achse: rotes Signal.

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	<li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+age+and+the+life-span+of+zygotes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).</li><li>Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+and+genome+encounter+during+yeast+zygote+formation.">Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).</li><li>Azpiroz, R., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+mitochondrial+sorting+in+yeast+zygotes.">Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes.</a> Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).</li><li>Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+fusion+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).</li><li>Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).</li><li>Sprague, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+yeast+mating+reaction.">Assay of yeast mating reaction.</a> Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).</li><li>Ydenberg, C. A., Rose, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mating:+a+model+system+for+studying+cell+and+nuclear+fusion.">Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion.</a> Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).</li><li>Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+mating+in+yeast.">Synchronous mating in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).</li><li>Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).</li><li>Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FUS1+regulates+the+opening+and+expansion+of+fusion+pores+between+mating+yeast.">FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).</li><li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelles+on+the+move:+insights+from+yeast+vacuole+inheritance.">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Verfügbarkeit von gereinigtem Zygoten sollten biochemische Untersuchungen einschließlich Transkriptom, Proteom und Lipidomics sowie Untersuchung der Mechanismen, durch die Zygoten unterziehen Zellzyklus re-entry, Zellwand Umbau, angehende und Vererbung Eigenschaften, etc. Alternativ zu erleichtern, könnte Zygoten die ausgehend werden mit Stämmen, die charakteristische Mutationen in einem oder beiden Elternteilen. Darüber hinaus können die gereinigten Zygoten, wie für haploide oder diploide Zellen, können in ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz / Equipment </td><td> Quelle </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, kodierend cytoplasmatischen GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, Kodierung RPL25 fusioniert mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher FB120 Sonicator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Polypropylenröhrchen mit Sieb cap </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Gekühlte Mikrozentrifuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Durchflusszytometrie Abtrennlösung </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Dekonvolution Mikroskop </td><td> Applied Precision </td><td></td></tr><tr><td> Upright Epifluoreszenzmikroskop </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM Glukose Formulierung Hinweise: Für Agarplatten, einfach zählen 2% Agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygoten sind wesentliche Zwischenprodukte zwischen haploiden und diploiden Zustände im Lebenszyklus vieler Organismen, einschließlich Hefe (Abbildung 1) 1. S. cerevisiae Zygoten resultieren aus der Fusion von haploiden Zellen unterschiedlicher Paarungstyp (MATa, MATalpha) und führen zu entsprechenden stabilen Diploide erzeugen, die nacheinander so viele wie 20 diploiden Nachkommen als ein Ergebnis ihrer asymmetrischen auffallend mitotische Teilungen 2. Zygote Bildung wird durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen orchestriert: In diesem Prozess binden lösliche Paarungsfaktoren an Rezeptoren verwandt, Auslösung Rezeptor-vermittelten Signalkaskaden, die Unterbrechung des Zellzyklus und gipfeln erleichtern Zell-Zell-Fusion. Zygoten kann als ein Modell für die Vorläufer-oder Stammzellen-Funktion sein. Obwohl viel über die Bildung von Zygoten gelernt und obwohl Zygoten wurden verwendet, um Zellen molekulare Fragen von allgemeinem signif untersuchenicance fast alle Studien haben den Einsatz der Paarung Mischungen, in denen Zygoten mit einer Mehrheit der Bevölkerung von haploiden Zellen 3-8 vermischt sind. Viele Aspekte der Biochemie der Zygote Bildung und der anhaltenden Lebens der Zygote bleiben daher unerforscht. Berichte der Reinigung von Hefe Zygoten beschreiben Protokolle auf ihren Sedimentationseigenschaften 9 basiert, aber diese Sedimentation-basierten Verfahren nicht erzielen fast 90% Reinheit in unseren Händen. Darüber hinaus hat es den Nachteil, dass Zellen auf Sorbit hypertonischen freiliegen. Wir haben daher eine vielseitige Reinigungsverfahren entwickelt. Zu diesem Zweck waren Paare von haploiden Zellen, rot oder grün fluoreszierende Proteine ​​coinkubiert um Zygote Formation, zu verschiedenen Zeiten geerntet und die resultierenden Zygoten wurden unter Verwendung eines auf Basis der Durchflusszytometrie Sortier-Protokoll zu ermöglichen. Diese Technik bietet eine bequeme visuelle Beurteilung der Reinheit und Reifung. Die durchschnittliche Reinheitder Fraktion beträgt ca. 90%. Gemäß der Zeitsteuerung der Ernte können Zygoten unterschiedlicher Reifegrade rückgewonnen werden. Die gereinigten Proben bieten eine bequeme Ausgangspunkt für &quot;-schaftlichen&quot; Studien, für die Wiederherstellung der ursprünglichen Nachkommen und für eine systematische Untersuchung dieser Progenitorzellen.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Um Zygoten zu reinigen<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Wurden haploiden Zellen der entgegengesetzten Paarungstyp ausgeführt, um rot oder grün fluoreszierende Proteine, Co-inkubierten um Zygote Formation ermöglichen, und fraktioniert über eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll auszudrücken. Das hoch angereicherte Fraktion ermöglicht anschließenden &quot;-schaftlichen&quot; Studien, die Verwertung von ersten Nachkommen, und systematische Untersuchung der Zygote Morphogenese.

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

flow-cytometry-based-purification-of-s-cerevisiae-zygotes

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Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K Aufrufe.  Case Western Reserve University School of Medicine. Um Zygoten zu reinigen S. cerevisiae Wurden haploiden Zellen der entgegengesetzten Paarungstyp ausgeführt, um rot oder grün fluoreszierende Proteine, Co-inkubierten um Zygote Formation ermöglichen, und fraktioniert über eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll auszudrücken. Das hoch angereicherte Fraktion ermöglicht anschließenden "-schaftlichen" Studien, die Verwertung von ersten Nachkommen, und systematische Untersuchung der Zygote M...

Serie: Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

Studieren Altersabhängige genomische Instabilität mit der S. cerevisiae Chronologisch Lebensdauer Modell

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;