Die Arbeit wird teilweise durch den Wageningen University Fund (WUF), das China Scholarship Council Program for Graduate Students und ein NWO-VIDI-Stipendium 12378 unterstützt.

1. Pflanzenanbau- und Prüfbedingungen
<ol><li>Wachsen und pflegen Pflanzen in kontrollierten Gewächshäusern oder Klimakammern im Temperaturbereich von 18-22 °C und unter natürlichem Lichtregime oder mit einem Tag/Nacht-Regime von 16 Stunden/8 Stunden. Entfernen Sie achselige Zweige, um die Pflanzen handhabbarer zu machen.</li>
	<li>Für Kartoffeln In-vitro-Pflanzen in sterilen Kunststoffgläsern mit Murashige-Skoog (MS)-Medium (20 g/L Saccharose, 5 g/L MS-Salze mit Vitaminen, 8 g/L Agar, pH 5,8) unter kontrollierten Bedingungen in Klimakammern bei 18 °C mit einem Tag/Nacht-Regime von 16 Stunden/8 Stunden für zwei Wochen aufbewahren und dann in Töpfe mit sterilisiertem Boden in geregelten Gewächshäusern übertragen.</li>
</ol>2. Agroinfiltration
<ol><li>Pflanzenmaterial: Für Nicotiana benthamiana,verwenden Sie etwa 4-5 Wochen alte Samenpflanzen. Für Kartoffeln, verwenden Sie etwa 4-5 Wochen alte Transplantationen von in vitro. Wählen Sie junge, gesunde und voll entwickelte Blätter für Infiltrationen.</li>
	<li>
Agrobacterium-Kultur:<ol>
<li>Bereiten Sie das YEB-Medium im Voraus vor (Tabelle 1). Füllen Sie die 50 ml-Röhrchen mit 10 ml YEB-Medium, ergänzt mit 1 l Acetosyringon (200 mM), 100 l MES-Puffer (2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure, 1 M) und den entsprechenden Antibiotika. Pipette 20 l Glycerinbestand der gewünschten Stämme (Tabelle 2) (enthält das Gen von Interesse) in die YEB. Initiieren Sie Kulturen für alle Agrobacterium-Stämme in diesem Test zur gleichen Zeit. Inkubieren Sie Zellen durch Schütteln für 1-2 Tage bei 28 °C und 200 Rpm auf eine OD600 von etwa 1,0.</li>
		<li>Erntezellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min. Den Überstand abgießen und das Pellet in frisch zubereitetem MMA-Medium (Tabelle 3) auf eine OD600 von 0,3 aussetzen. Wirbelzellen, um sie wieder zu suspendieren. Für die Koinfiltration von zwei Bakterienstämmen, mischen Sie die Kultur in einem 1:1-Verhältnis.</li>
		<li>Lassen Sie die Kultur auf der Bank bei Raumtemperatur für 1-6 Stunden vor infiltrationen. In der Zwischenzeit kennzeichnen Sie die zu infiltrierenden Pflanzen und das Datum des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrationen: Verwenden Sie eine 1 ml nadellose Spritze, um die Agrobacterium Suspensionen zu infiltrieren. Sorgfältig und langsam injizieren Blattplatten mit den Suspensionen aus der Spritze (aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen sollte während dieses Prozesses Augenschutz getragen werden). Infiltrieren Sie mindestens drei Pflanzen pro Sorte. Verwenden Sie drei Blätter pro Pflanze, um als Triplicate zu dienen. Hinweis: Normalerweise könnten 1 ml Agrobacterium Suspension für 3 Pflanzen von N. benthamianaausreichen. Für Kartoffeln ist mehr Suspension erforderlich, weil die Blätter der Solanum-Arten schwieriger zu infiltrieren sind. Erforderliche Mengen an Suspensionen hängen von der Solanum-Art ab. Vermeiden Sie Kreuzkontaminationen, indem Sie Handschuhe oder Sterilisationshandschuhe mit Ethanol zwischen infiltrationen wechseln und die Pflanzen erst am Tag nach der Impfung wässern.</li>
	<li>Scoring: Score makroskopische Reaktionen etwa 3 Tage nach der Infiltration, wenn der Zelltod Phänotyp klar ist (Abbildung 1). Wenn der Zelltod-Phänotyp quantitativ ist, verwenden Sie die angegebenen Kriterien (Abbildung 2). Kurz gesagt, die Skalen für die makroskopische Bewertung des Zelltodes hängen hauptsächlich von den Zelltodprozentsätzen des infiltrierten Bereichs ab. Der Prozentuale Anteil des Zelltodes wird auf einer Skala von 0% (keine Symptome) bis 100% (konfluenter Zelltod) dargestellt. Die Zwischenreaktionen reichen von schwachen Reaktionen wie Chlorose bis hin zu einem anstiegen Zelltod. Auf Wunsch kann die makroskopische Bewertung auch mit modernen Foto-Imaging-Geräten quantitativ bewertet werden.</li>
</ol>3. PVX Agroinfektion
<ol><li>Pflanzenmaterial: Für N. benthamianaverwenden Sie etwa 2-3 Wochen alte Samenpflanzen. Für Kartoffeln, verwenden Sie etwa 2-3 Wochen alte Transplantationen von in vitro. Für groß angelegte Tests verwenden Sie etwas ältere (4-5 Wochen) Pflanzen, da diese Pflanzen mehr und größere Blätter haben, um eine höhere Anzahl von Agrobacterium-Impfstellen aufzunehmen.</li>
	<li>
Agrobacterium-Kultur: <ol>
<li>Bereiten Sie das YEB-Medium im Voraus vor. Füllen Sie die 10 ml Tuben mit 3 ml YEB, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika. Pipette 20 l Glycerinbestand der gewünschten Stämme (Tabelle 2) (enthält das Gen von Interesse) in die YEB. Initiieren Sie Kulturen für alle Agrobacterium-Stämme in diesem Test zur gleichen Zeit. Inkubieren Sie Zellen durch Schütteln für 1-2 Tage bei 28 °C und 200 Rpm auf eine OD600 von etwa 1,0.</li>
		<li>Pipette ca. 300 l jedes Agrobacterium-Stamms und verteilen Sie sie auf LB-Festagar-Medium-Platten, die mit den entsprechenden Antibiotika ergänzt werden, und brüten Zellen bei 28 °C für 1-2 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infektionen: Verwenden Sie einen Spachtel, um die Agrobacterium-Kultur in der Platte zu sammeln. Tauchen Sie einen hölzernen Zahnstocher in der Agrobacterium-Kultur auf den Spachtel und durchbohren Sie die Blätter, um eine große Menge an Bakterien zu impfen. Ungeimpfen Sie mindestens drei Pflanzen für jede Sorte. Verwenden Sie drei Blätter pro Pflanze, um als Triplicate zu dienen. Erstellen Sie in jedem Blatt mehrere Impfstellen für jeden Stamm.</li>
	<li>Scoring: Score makroskopische Antworten etwa zwei Wochen nach der Impfung (Abbildung 3). Zeichnen Sie bei Bildschirmen mit hohem Durchsatz die qualitativen Antworten (ja/nein) für jeden Impfpunkt auf. Berechnen Sie dann den Prozentsatz der antwortenden Sites, und vergleichen Sie sie mit Steuerelementen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors.">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li><li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens.">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes.">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li><li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes,+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2.">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li><li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis.">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li><li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans.">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li><li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire.">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li><li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oomycete+genomics:+new+insights+and+future+directions.">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li><li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing.">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li><li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana.">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li><li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives. , 1-13 (2012).</li><li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms.">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li><li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes.">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li><li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9/Cf-9-induced+and+Avr4/Cf-4-induced+necrosis.">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li><li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection.">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li><li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves.">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li><li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes.">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li><li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H., Lamour, K., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics.">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. 23, 455-475 (2009).</li><li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE.">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance.">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li><li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves.">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li><li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., An&#233;, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing:+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato.">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li><li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ternary+transformation+system:+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato.">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li><li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a,+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm.">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes.">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li><li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora.">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum.">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li><li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary.">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li><li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium.">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li><li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]. , (2011).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li><li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19.">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li><li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li><li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation.">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li><li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta.">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Transiente Assays wie Agroinfiltration und Agroinfektion sind effiziente Methoden, die für die moderne molekulare Pflanzenpathologieforschung von entscheidender Bedeutung sind. Trotz einiger Einschränkungen erfüllen diese Methoden die Nachfrage nach einer effizienten und robusten Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.
Das Agroinfiltrationssystem ist ein weit verbreiteter funktioneller Assay bei einer Reihe von Pflanzenarten. Die Agroinfiltration erleichtert die Abgabe mehrerer Transgene in dieselbe Zelle mit gleichzeitiger Expression interagierender Proteine. Dies ist vorteilhaft für die Rekapitulation von R-AVR-Beziehungen, indem Agrobacterium-Stämme koinfiltriert werden, die Avr-Gene mit Stämmen ausdrücken, die die passenden R-Gene ausdrücken. Auch für bekannte R-AVR-Paare können solche Coinfiltrationen als Positivsteuerungen verwendet werden. Die Einbeziehung solcher Kontrollen ist wichtig, da bei einigen Pflanzengenotypen die Transformationseffizienz unter dem Schwellenwert liegen kann, um Reaktionen zu erkennen. Einschließlich Negativkontrollen, z. B. ein Agrobacterium-Stamm, der einen Vektor ohne Geneinsatz enthält, ist auch wichtig, um festzustellen, ob ein bestimmter Pflanzengenotyp unspezifische Abwehrreaktionen auf das Agrobacteriumauslöst. Diese Funktion tritt bei einer bestimmten Häufigkeit im Kartoffelkeimplasma auf, und nicht alle Solanum-Arten sind für dieses Agrobacterium-basierteExpressionssystem gut geeignet. Im Allgemeinen funktioniert der Agroinfiltrationstest sehr gut in N. benthamiana und den meisten Kartoffelgenotypen. Neben der Effektoromik gibt es verschiedene weitere Anwendungsmöglichkeiten für die Agroinfiltrationstechnik, wie die Produktion von Proteinen aus Transgenen und die Proteinlokalisierung in Pflanzenzellen durch konfokale Mikroskopie.
PVX-Agroinfektion ist ein hochempfindliches Screening-System und eignet sich in der Regel besser für Hochdurchsatz-Screenings. Da das Agrobacterium nur noch lokal vorhanden ist, sind unspezifische Reaktionen auf dieses Bakterium jetzt nicht sehr beunruhigend, da das PVX-Virus die weitere Ausbreitung des Transgens übernimmt. Pflanzen können jedoch resistent gegen PVX sein oder extreme Resistenzreaktionen (ER) aufführen, und in diesem Fall ist die Agroinfektionsmethode nicht geeignet. Eine weitere Einschränkung der PVX-Agroinfektionsmethode ist die Insert-Größe des gens von Interesse. Beobachtete Phänotypen von Reaktionen können von einer intensiven schwarzen Nekrose, die die Wunde umgibt, bis hin zu schwacher Nekrose in der Nähe des Impfflecks variieren. Sowohl bei den Arten N. benthamiana als auch Solanum wird die PVX-Agroinfektion als empfindlicher als die Agroinfiltration anerkannt.
Unter Berücksichtigung der Berücksichtigung des genetischen Hintergrunds der verschiedenen getesteten Pflanzengenotypen können einige Einschränkungen (siehe oben) haben wir in der Regel ähnliche Schlussfolgerungen durch PVX-Agroinfektion und Agroinfiltration. Diese Ergebnisse sind auch vergleichbar mit anderen Tests, wie Proteininfiltrationen29 und ELISA3. Unter Berücksichtigung der Vorteile und Einschränkungen beider Systeme empfehlen wir, beide Methoden zu verwenden, um sich gegenseitig zu ergänzen oder unabhängige Ergebnisse zu bestätigen.

Effectoromics, ein hochdurchsatzfähiger funktioneller Genomik-Ansatz, hat sich vor kurzem als ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von Resistenzen (R) Genen in Kulturpflanzen und übereinstimmenden Avirulence -Avr) Genen von Krankheitserregern1-4herauskristallisiert. Im Gegensatz zur zeitaufwändigeren stabilen Transformation mit R-Genen basiert die Effektoromik-Strategie auf transienten Assays von Pathogengensequenzen.
Seit der Genomik-Ära wurden Genome von Pflanzenpathogenen weit erforscht. Zum Beispiel für Oomyceten, die die verheerendsten Pflanzenpathogene enthalten, wurden große Sammlungen von Sequenzen erzeugt und auf Gene analysiert, die eine Rolle bei der Interaktion mit der Pflanze5-10spielen. Eine Klasse von pathogenen Proteinen stellt Effektoren dar, die die Struktur und Funktion der Wirtszellen manipulieren, entweder um eine Infektion zu erleichtern (Virulenzfaktoren) oder um Abwehrreaktionen (Avirulenzfaktoren)auszulösen 11-13. Die Expression von Avr-Genen in Pflanzenzellen, die R-Gene enthalten, führt in der Regel zur überempfindlichen Zelltodreaktion (HR)14,15. Bei der Plantaexpression von R- und Avr-Genen kann mit transienten Expressionssystemen wie Agrobacterium tumefaciens -basierende transiente Transformation (Agroinfiltration)16erreicht werden. Diese transiente Transformation kann auch in Kombination mit viralen Expressionssystemen (Agroinfektion)17,18angewendet werden.
Für die Agroinfiltration ist das am häufigsten verwendete Mittel A . tumefaciens, ein weites Wirtsland von Dikotpflanzen. A . tumefaciens enthält ein tumorinduzierendes (Ti) Plasmid. Transfer-DNA (T-DNA) aus einem Ti-Plasmid wird in die Pflanzenzellen transloziert, nachdem die Virulenzmaschinerie des Bakteriums aktiviert wurde. Dies kann in verwundeten Pflanzenzellen ausgelöst werden, durch die freigesetzten niedermolekularen Phenolverbindungen und Monosaccharaide in einer leicht sauren Umgebung19. Das Virulenz-Gen wird nach der Infiltration von Agrobacteriumsuspensionen in Blattplatten aktiviert, die von großen Venen definiert werden. Dann werden Pflanzenzellen in den Blattpaneelen transformiert und exprimieren die Transgene, die im T-DNA-Bereich enthalten sind.
Die Agroinfektion basiert auf gewickelten Agrobacterium, das die Translokation eines Virus in Pflanzenzellen vermittelt. Das Virus breitet sich dann weiter auf benachbarte Pflanzengewebe aus, in Abwesenheit von Agrobacterium. Für die Agroinfektion können mehrere Pflanzenviren verwendet werden. RNA-Viren sind ideale Vektoren für die Genexpression, da sie sich in infizierten Pflanzen zu sehr hohen Konzentrationen vermehren können. Unter den pflanzlichen RNA-Viren ist Potato Virus X (PVX) weit verbreitet für Effektoromik-Bildschirme. Um funktionelle Tests für ein eingefügtes Gen zu erleichtern, wurden binäre Vektoren, die das PVX-Genom enthalten, flankiert vom Cauliflower-Mosaikvirus 35S-Promotor und dem Nopaline-Synthase-Terminator, in die T-DNA von A. tumefaciens20geklont. Nachdem die T-DNA in Pflanzenzellen übertragen wurde, wird das in der T-DNA enthaltene PVX-Genom vom 35S-Promotor transkribiert. Dann verbreiten sich Viruspartikel systemisch in den infizierten Pflanzen, was zur Expression des eingefügten Gens führt. Diese Methode, die sowohl auf Agrobacterium als auch auf PVX basiert, wird als PVX-Agroinfektion bezeichnet.
Hier zeigen wir Beispiele für die Agroinfiltration und PVX-Agroinfektionstests. Als Wirtspflanzen verwenden wir Kartoffelkeimplasma (Solanum-Sektion Petota), für das Effektoromik-Ansätze Pionierarbeit geleistet und sich als erfolgreich erwiesen haben3,4. Wir verwenden auch Nicotiana benthamiana, die als Modellpflanze in Solanaceous Pflanzen bekannt ist14,21,22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="955">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Beef extract</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">B4888</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Bacteriological peptone</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0037</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:267px;">Oxoid</td>
			<td style="width:219px;">LP0021</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MgSO4</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">208094</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MS salts (without vitamins)</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M0221</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">MES</td>
			<td style="width:267px;">Duchefa Biochemie</td>
			<td style="width:219px;">M1503</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">LB broth powder</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">L3022</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:267px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:219px;">D134406</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Syringe (1 ml)</td>
			<td style="width:267px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Incubator</td>
			<td style="width:267px;">Infors HT</td>
			<td style="width:219px;">Multitron II</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Heraeus</td>
			<td style="width:219px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:252px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:219px;">Biophotometer 6131</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agroinfiltration and pvx agroinfection in potato and nicotiana benthamiana

Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind zwei effiziente transiente Expressions-Assays zur funktionellen Analyse von Kandidatengenen in Pflanzen. Das am häufigsten verwendete Mittel für die Agroinfiltration ist Agrobacterium tumefaciens, ein Erreger vieler Dikotpflanzenarten. Dies impliziert, dass Agroinfiltration auf viele Pflanzenarten angewendet werden kann. Hier stellen wir unsere Protokolle und erwarteten Ergebnisse bei der Anwendung dieser Methoden auf die Kartoffel (Solanum tuberosum), die verwandte wilde Knollen tragende Solanum-Arten (Solanum Abschnitt Petota) und die Modellpflanze Nicotiana benthamiana. Neben der funktionellen Analyse einzelner Gene, wie Resistenz -R) oder Avirulence (Avr) Gene, ist der Agroinfiltrationstest sehr geeignet, um die R-AVR-Wechselwirkungen im Zusammenhang mit spezifischen Wirtspathogen-Wechselwirkungen zu rekapitulieren, indem r- und Avr-Transgene einfach in dieselbe Zelle geliefert werden. Einige Pflanzengenotypen können jedoch unspezifische Abwehrreaktionen auf Agrobacteriumerhöhen, wie wir beispielsweise bei mehreren Kartoffelgenotypen beobachtet haben. Im Vergleich zur Agroinfiltration ist der Nachweis der AVR-Aktivität mit PVX-Agroinfektion empfindlicher, höherer Durchsatz in Funktionsbildschirmen und weniger empfindlich gegenüber unspezifischen Abwehrreaktionen auf Agrobacterium. Es kann jedoch eine unspezifische Abwehr von PVX auftreten, und es besteht die Gefahr, Dassregungen aufgrund einer vireninduzierten extremen Resistenz zu verpassen. Trotz dieser Einschränkungen sind agroinfiltration und PVX Agroinfection unserer Erfahrung nach sowohl geeignete als auch komplementäre Assays, die gleichzeitig verwendet werden können, um die Ergebnisse des jeweils anderen zu bestätigen.

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Experiment der Agroinfiltration mit 7 verschiedenen Effektoren (E1-E7) in Kartoffeln und N. benthamiana. Der Zelltod tritt in den infiltrierten Blattplatten etwa 3 Tage nach der Infiltration auf. Das Ausmaß des Zelltod-Phänotyps muss mit den Kontrollen verglichen werden. Als Positivkontrolle wurde eine Mischung aus dem Agrobacteriumstamm AGL1(pVirG)23 mit pBINplus-R3a und pK7WG2-AVR3a als Positivkontrolle24,25verwendet, während AGL1(pVirG) als Negativkontrolle verwendet wurde. Die Abbildungen 1A und 1B zeigen gute Beispiele für die Agroinfiltration im Kartoffelgenotyp MaR8 (Mastenbroek R8)26 bzw. N. benthamiana, die für die Agroinfiltration sehr gut geeignet sind. Es gibt einen konfluenten Zelltod im Blattpanel, das mit positiver Kontrolle geprägt ist, während keine Zelltodreaktion mit Negativkontrolle oder pBINplus-R3a auftritt. In MaR8 induzieren zwei Effektoren AVR3a (E2) und AVR4 (E3) einen Zelltod, während die anderen Effektoren (E1 und E4-E7) dies nicht tun. In N. benthamiana induzieren keine der getesteten Effektoren eine Zelltodesreaktion. Die Abbildungen 1C und 1D zeigen Beispiele für die Agroinfiltration in der Wildkartoffel Solanum berthaultii 483-1 und Solanum rechei 210-5, die für die Agroinfiltrationstechnik nicht gut geeignet sind. In S. berthaultii 483-1 zeigt das Blattgewebe eine unspezifische Nekrose zu Negativen kontrollen sowie zu allen getesteten Effektoren. In S. rechei 210-5 zeigen infiltrierte Blattpaneele eine sehr schwache Zelltodreaktion auf eine positive Kontrolle.
Abbildung 2 zeigt eine Reihe von Bewertungsskalen, die verwendet werden können, um die Reaktion auf agrofiltriertes Agrobacteriumzu quantifizieren. Prozentsätze des Zelltodes werden auf einer Skala von 0-100% dargestellt. Die beobachteten Phänotypen reichen von makroskopisch nicht sichtbaren Symptomen (0%), über eine Reihe von Zwischenreaktionen, die Chlorose und steigende Zellsterblichkeitsraten zeigen, bis hin zum konfluenten Zelltod (100%).
Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Experiment nach der PVX-Agroinfektion in Kartoffeln. Normalerweise kann die Ausweitung des Zelltodes an den Standorten etwa zwei Wochen nach der Zahnpickungsimpfung gefunden werden. Wie in beiden Abbildungen dargestellt, ist der expandierende Zelltod an den Stellen vorhanden, die mit pGR106-CRN2 (positive Kontrolle mit dem Effektor crinkler Crn2) geimpft wurden, einem allgemeinen Zelltod, der ein Gen von P. infestans27darstellt. Abgesehen von einer geringfügigen Reaktion auf Verwundungen wird an den Stellen, die mit dem pGR106-leer (negativer Kontrolle) geimpft wurden, kein expandierender Zelltod festgestellt. In Abbildung 3A, die den Kartoffelgenotyp MaR3 (Mastenbroek R3) darstellt, haben zwei pGR106-Effektoren (E1 und E2) keinen Zelltod induziert. In Abbildung 3Bwird ein positives Ergebnis des Effektor-Screenings im wilden Solanum huancabambense 354-1 dargestellt; Die Zelltodreaktion wurde bei zwei pGR106-Effektoren (E1-E3, die Elicitinen darstellen)beobachtet 28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Abbildung 1. Beispiele für Agroinfiltration in Kartoffeln und N. benthamiana. Pflanzen einschließlich (A) kartoffelgenotyp MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, ( C) Solanum berthaultii 483-1 und (D) Solanum rechei 210-5 wurden mit einer Mischung des Agrobacterium-Stamms AGL1(pVirG) 23 mit pBINplus-R3a und pK7WG2-AVR3a (Positivkontrolle), AGL1(pvirG) (Negativkontrolle), pBINplus-R3a, und sieben Effektoren (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Abbildung 2. Quantifizierung der Agroinfiltrationsreaktionen. Das Foto zeigt repräsentative Bewertungsskalen für den Zelltod, die von 0% (keine Symptome) bis 100% (konfluenter Zelltod) reichen. Die Zwischenreaktionen reichen von schwachen Reaktionen wie Chlorose bis hin zu einem anstiegen Zelltod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Abbildung 3. Beispiele für PVX-Agroinfektion in Kartoffeln. Kartoffelgenotyp MaR3 (Mastenbroek R3) (A) und Solanum huancabambense 354-1 (B) Zahnpickel geimpft mit pGR106-CRN2 (Positivkontrolle), pGR106-leer (Negativkontrolle) bzw. pGR106-E1-2 (Effektoren) bzw. pGR106-E1-E3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
Tabelle 1. YEB mittel
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>destilliert H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>Saccharose</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>Rindfleischextrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>bakteriologischer Pepton</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>Hefeextrakt</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. Vektoren und Stämme für die Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion. Es können mehrere binäre Vektoren verwendet werden. Vektoren in der Liste unten erlauben eine hohe Expression der Kandidatengene und haben gut in unseren Händen funktioniert. Wir bevorzugen die Verwendung des Agrobacterium-Stamms GV3101(pMP90)29 in N. benthamiana und finden AGL130 mit dem Helfer-Plasmid pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 besser geeignet in Kartoffel31. Weitere Stämme wurden in anderen Gruppen auf verschiedenen Modellpflanzen analysiert, einschließlich N. benthamiana, aber nicht in Kartoffel32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: Gateway Version36
Tabelle 3. MMA-Medium. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Stellen Sie den pH-Wert auf 5,6 ein.

Watch this Scientific Journal Video about Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana at JoVE.com

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind routinemäßige funktionelle Assays für die transiente ektopische Expression von Genen in Pflanzen. Diese Methoden sind effiziente Assays in Effektoromik-Strategien (schnelle Resistenz und Avirulenz-Gen-Entdeckung) und entscheidend für die moderne Forschung in der molekularen Pflanzenpathologie. Sie erfüllen die Nachfrage nach robuster Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

JoVE Journal

Biology

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

20.1K Aufrufe.  Wageningen University. Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind routinemäßige funktionelle Assays für die transiente ektopische Expression von Genen in Pflanzen. Diese Methoden sind effiziente Assays in Effektoromik-Strategien (schnelle Resistenz und Avirulenz-Gen-Entdeckung) und entscheidend für die moderne Forschung in der molekularen Pflanzenpathologie. Sie erfüllen die Nachfrage nach robuster Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.

Serie: Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Forschung

Biologie

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Quantifizierung der Initiierung des Zelltods durch kontinuierliche Bildgebung

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as the formation of cell death zones on inoculated leaves. Here, a protocol for studying the rate of cell death initiation by imaging inoculated leaves in the time between the cell death initiation and the cell death appearance using a digital microscope is presented. The digital microscope enables a continuous imaging process in desired intervals, which allows an accurate determination of cell death initiation rate up to minutes exactly, as opposed to hours in traditional methods. Imaging with the digital microscope is also independent of light and can therefore be used during day and night without disturbing the circadian rhythm of the plant. Different pathosystems resulting in programmed cell death development could be studied using this protocol with minor modifications. Overall, the protocol thus allows simple, accurate, and inexpensive identification of cell death initiation rate.

Autor im Rampenlicht: Ein optimierter Ansatz zur Untersuchung der Initiierung des Zelltods bei hypersensitiver Reaktion 

Here we present a protocol for studying the rate of programmed cell death initiation by continuously imaging inoculated leaves following cell death induction.

Untersuchung der Initiierung des Zelltods mit einem digitalen Mikroskop

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and diseases of the CPB are conducted during active feeding stages. Nonetheless, there are fewer studies on resting stages, although these beetles spend most of their life cycle in a state of winter diapause (hibernation). In this work, a method for investigating CPB hibernation under natural conditions was developed and tested, offering an opportunity to collect a sufficient number of individuals in winter. In this article, CPB survival was assessed, and infectious agents at different stages of hibernation were identified. CPB mortality increased during the hibernation, reaching a maximum in April-May. Entomopathogenic fungi (Beauveria, Isaria, and Lecanicillium) and bacteria Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, and Serratia were isolated&#160;from the dead insects. The survival rate of the beetles for the entire hibernation period was 61%. No frozen or desiccated beetles were found, indicating the success of the presented method.

Here we present a method for studying Colorado potato beetle hibernation under the natural conditions of the temperate zone as well as a technique for collecting beetles in winter. This method allows to obtain a desired number of overwintering individuals for various analyses at any stage of hibernation.

Eine experimentelle Studie zur Überwinterung des Kartoffelkäfers unter natürlichen Bedingungen

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

Resilienzanalyse von Kartoffeln unter klimabedingten Belastungen

High Throughput Image-Based Phenotyping for Determining Morphological and Physiological Responses to Single and Combined Stresses in Potato

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions over time. By using multiple imaging sensors, many traits of interest can be assessed, including plant biomass, photosynthetic efficiency, canopy temperature, and leaf reflectance indices. Plants are frequently exposed to multiple stresses under field conditions where severe heat waves, flooding, and drought events seriously threaten crop productivity. When stresses coincide, resulting effects on plants can be distinct due to synergistic or antagonistic interactions. To elucidate how potato plants respond to single and combined stresses that resemble naturally occurring stress scenarios, five different treatments were imposed on a selected potato cultivar (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) at the onset of tuberization, i.e. control, drought, heat, waterlogging, and combinations of heat, drought, and waterlogging stresses. Our analysis shows that waterlogging stress had the most detrimental effect on plant performance, leading to fast and drastic physiological responses related to stomatal closure, including a reduction in the quantum yield and efficiency of photosystem II and an increase in canopy temperature and water index. Under heat and combined stress treatments, the relative growth rate was reduced in the early phase of stress. Under drought and combined stresses, plant volume and photosynthetic performance dropped with an increased temperature and stomata closure in the late phase of stress. The combination of optimized stress treatment under defined environmental conditions together with selected phenotyping protocols allowed to reveal&#160;the dynamics of morphological and physiological responses to single and combined stresses. Here, a useful tool is presented for plant researchers looking to identify plant traits indicative of resilience to several climate change-related stresses.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Reaktionen von Pflanzen auf abiotischen Stress mit der Roboterplattform PlantScreen

We designed an image-based phenotyping protocol to determine the morphological and physiological responses to single and combined heat, drought, and waterlogging treatments. This approach enabled the identification of early, late, and recovery responses at a whole plant level, particularly above-ground parts, and highlighted the necessity of using multiple imaging sensors.

Bildbasierte Hochdurchsatz-Phänotypisierung zur Bestimmung morphologischer und physiologischer Reaktionen auf Einzel- und Kombinationsbelastungen bei Kartoffeln

High throughput image-based phenotyping is a powerful tool to non-invasively determine the development and performance of plants under specific conditions ...