Dieses Protokoll ist wichtig, weil es eine In-vitro-Analyse des neutrophilen Schwärmens ermöglicht, die viele Einschränkungen unserer gegenwärtigen Unfähigkeit zu experimentieren überwindet. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen einfachen Zugang zu den sezernierten Zytokinen und Lipidmediatoren bietet, die Neutrophile während des Schwarms freisetzen, und eine quantitative Bildgebungsanalyse ermöglicht. Während wir diese Technik auf Neutrophile angewendet haben, könnte sie erweitert werden, um die Migration anderer weißer Blutkörperchen wie Monozyten und T-Zellen zu analysieren.
Beginnen Sie mit der Zubereitung eines 1,6 Milligramm pro Milliliter kationisches Polyelektrothit, oder CP-Lösung, indem Sie die richtige Menge an CP-Pulver zu Wasser hinzufügen und es über Nacht auf der Rührplatte mischen oder bis alle Feststoffe gelöst sind. Auf Wunsch kann die Lösung fluoreszierend gemacht werden, indem Poly-L-Lysin mit FITC beschriftet hinzugefügt wird. Generieren Sie den Master-Siliziumwafer mit Standard-Photolithographie-Verfahren.
Das hier verwendete Design ist ein vier mal vier Milliliter rechteckiges Array mit 30 Mikrometer Durchmesser gefüllten Kreisen, mit einem 150 Mikrometer Zentrum zu Mitte Abstand, aber es kann wie gewünscht für verschiedene Anwendungen geändert werden. Verschichten Sie eine 40 Mikrometer dicke Schicht mit negativem Photowiderstand auf einen Siliziumwafer. Dann backen Sie den Wafer bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.
Und 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Setzen Sie den Wafer durch eine Chrom-Fotomaske mit 150 bis 160 Millijoule pro Zentimeter quadratisch UV-Licht aus. Backen Sie den Wafer wieder bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und 95 Grad Celsius für 10 Minuten.
Dann tauchen Sie es in photoresist Entwickler für 10 Minuten. Und spülen Sie es mit Isopropylalkohol. Das Muster sollte nun auf dem Wafer sichtbar sein.
Als nächstes ein Verhältnis von Polydimethylsiloxan oder PDMS, Prepolymer und seinem Härtungsmittel, gründlich mischen. Und gießen Sie die ungehärtete Mischung über den Master-Wafer in eine Petrischale. Vakuum behandeln sie das ungehärtete PDMS-Gemisch, bis keine Luftblasen vorhanden sind.
Dann heilen Sie es über Nacht bei 65 Grad Celsius. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Skalpell, um das Äußere des gemusterten Teils des Wafers zu schneiden. Und entfernen Sie langsam die ausgehärtete PDMS-Platte und legen Sie sie auf ein sauberes Schneidebrett mit der gemusterten Seite nach oben.
Stempeln Sie einzelne Stempel aus der PDMS-Platte mit einem acht Millimeter großen Biopsie-Punch aus und legen Sie jeden Stempel verdeckt auf das Klebeband, um Schmutz zu entfernen. Wenn diese Stempel nach oben gerichtet sind, grundiert jeder Stempel mit 100 Mikrolitern der vorgefertigten CP-Lösung, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen zwischen der Lösung und der Marke bilden. Dann die Stempel auf eine Schicht von CP-Lösung umkehren und nach einer Stunde entfernen.
Dab jeder nasse Stempel nach unten auf eine saubere Glasrutsche sechs bis acht Mal, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Dann Vakuum behandeln die Briefmarken für ein bis zwei Minuten. Befestigen Sie einen acht Bohrer mit einem Durchmesser von acht Millimetern auf einem sauberen Glasschlitten als Leitfaden für die Stempelplatzierung.
Platzieren Sie einen Stempel mit dem Gesicht nach unten auf der Glasrutsche in der Mitte jeder Bohrung des Bildraums. Legen Sie dann ein 5,6 Gramm ausgewogenes Gewicht auf jeden Stempel und lassen Sie 10 Minuten für das Stanzen. Entfernen Sie die Gewichte und die Stempel vom Schlitten und lassen Sie die CP-Schicht bei Raumtemperatur 24 Stunden trocknen, bevor Sie Biopartikel hinzufügen.
Wenn der CP mit FITC markiert ist, überprüfen Sie die Wirksamkeit der Stanzung mit einem Fluoreszenzmikroskop. Schneiden Sie eine leere PDMS-Platte auf die Größe des bildgebenden Abstandsraums und verwenden Sie den acht Millimeter großen Biopsie-Punch, um Brunnen im PDMS zu erstellen, die sich an den Brunnen des Abstandsraums ausrichten. Dann die PDMS-Platte an der Glasrutsche kleben.
Eine Lösung von Biopartikeln auftauen und auf 500 Mikrogramm pro Milliliter Wasser zur Injektion verdünnen. Fügen Sie 100 Mikroliter Biopartikellösung zu jedem PDMS-Brunnen auf der Glasrutsche hinzu und schaukeln Sie die Rutsche für 30 Minuten. Spülen Sie die Brunnen gründlich mit Wasser und überprüfen Sie das Muster auf dem Dia mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Das Biopartikel-Mikroarray kann bis zu drei Monate in einer staubfreien Umgebung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie die Zellen vor, indem Sie sie bei 7,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in IMDM mit 0,4% menschlichem Serumalbumen wieder aufsetzen. Fügen Sie 100 Mikroliter der Suspension in einen PDMS-Brunnen, der das Biopartikel-Mikroarray enthält, und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension über der Oberseite des PDMS-Guts konvex ist und keine Blasen enthält.
Versiegeln Sie den Brunnen mit einem Deckelschlupf von 12 Millimetern und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, so dass die überschüssige Zellsuspension an den Rand des Brunnens entweicht, und verwenden Sie dann ein Gewebe, um den Überschuss zu entfernen. Um die Zellen abzubilden, laden Sie das Mikropartikelarray mit Zellen auf die Live-Zell-Bildgebungsstation eines Mikroskops, das mit einem Käfig-Inkubator ausgestattet ist, der auf 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 90 % relative Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Verwenden Sie Zeitraffer-, Fluoreszenz- und Lichtfeldmikroskopie, um Bilder mit 10-facher Vergrößerung alle 10 Sekunden bei 405 Nanometern, 594 Nanometern und hellem Feld aufzuzeichnen.
Die Neutrophilen in den Brunnen mit Biopartikeln bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Stunden inkubieren und Proben zu den gewünschten Zeitpunkten entnehmen. Verwenden Sie ein Hellfeldmikroskop, um zu überprüfen, ob Schwärme auf dem Mikroarray gebildet werden. Sammeln Sie das gesamte Volumen des Überstandes eines einzelnen Brunnens, und laden Sie es in ein 0,45 Mikrometer Zentrifuge-Filterrohr, um sicherzustellen, dass jeder Zeitpunkt in Dreifache zu analysieren.
Zentrifugieren Sie die Rohre bei 190 mal G und 20 Grad Celsius für fünf Minuten, und sammeln Sie das gefilterte Volumen. Dann lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius bis zur Bearbeitungszeit. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, arbeiten Sie mit photoresist und Entwickler in der Rauchhaube.
Haben Sie ein von iRB genehmigtes Protokoll, bevor Sie Blut von menschlichen Spendern entnehmen. Denken Sie daran, dass Materialien aus menschlichem Blut stammen BSL2 sind. Wenn Neutrophilen dem Biopartikel-Mikroarray zugesetzt werden, werden Neutrophile, die die Biopartikel-Cluster kontaktieren, aktiviert und initiieren die Schwarmreaktion.
Das Biopartikel-Mikroarray wurde mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie validiert, um neutrophile Migrationen zu den Biopartikelclustern zu verfolgen. Stabile Neutrophilenschwärme werden um jeden Cluster nach 30 bis 60 Minuten Exposition gebildet. Im Gegensatz dazu zeigen Neutrophilen keine kollektive Migration ohne Biopartikelcluster.
Die Fluoreszenzintensität von gefärbten neutrophilen Kernen wurde verwendet, um festzustellen, dass die durchschnittliche Schwarmgröße um die Biopartikelhaufen etwa 1490 Mikrometer quadratisch betrug. In Ermangelung von Clustern blieb die Fluoreszenz einer bestimmten Interessenregion im Laufe der Zeit konstant. Spuren der Neutrophilenmigration zeigen, dass Neutrophilen auf einem Biopartikelhaufen konvergierten, wenn man vorhanden war, aber keine Konvergenz im Kontrollsystem beobachtet wurde.
Die Geschwindigkeit von Schwärmen und nicht aktivierten Neutrophilen wurde gemessen, und es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied in den Geschwindigkeitsverteilungen festgestellt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit für schwärmende Neutrophile betrug 20,6 Mikrometer pro Minute, während die durchschnittliche Geschwindigkeit für Kontrollneutrophile zwei Mikrometer pro Minute betrug. Die Konzentrationen von 16 Proteinen, die Neutrophile während des Schwärmens freisetzen, wurden im Laufe der Zeit analysiert.
10 Proteine erhöhten die Konzentration. Zwei gingen zurück. Und die restlichen vier nahmen in der ersten Stunde des Schwarms zu, gingen danach aber zurück.
Stellen Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens sicher, dass alles sauber ist und Ihre Briefmarken richtig getrocknet werden, da diese für eine erfolgreiche Musterung der Bakterienpartikel unerlässlich sind. Die Entwicklung dieser Technik wird es den Forschern ermöglichen, neue Fragen auf dem Gebiet des neutrophilen Schwärmens zu erforschen, einschließlich der Frage, wie freie Mediatoren und extrazelluläre Vesikel in die neutrophile interzelluläre Kommunikation involviert sind.
