Diese Arbeit wird von der Lupus Research Institute (New York, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 und NIH UL1-TR00165 gesponsert. Wir danken Dr. Robert P. Kimberly für seine fortwährende Unterstützung.

Alle Spender für diese Studie rekrutiert gab schriftliche Einwilligung und die Studie wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Review Board genehmigt. 1. HUVEC Erste, Kultur und Subkultur <ol><li> Kultur menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) in vitro in komplettem Wachstumsmedium, das von Endothelzellen Grundmedium besteht (siehe Liste der Materialien) mit einer endothelialen Zellwachstumsfaktoren ergänzt. Anmerkung: Die Wachstumsfaktoren, die in dieser Studie verwendet werden, umfassen: 5 ng / ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml Hydrocortison, 50 mg / ml Gentamicin und 50 ng / ml Amphotericin-B (GA-1000), 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Basis mit Heparin (hFGF-B), 20 ng / ml menschlichem rekombinantem Insulin-like Growth Factor ( R 3-IGF-1), 1 &amp;mgr; g / ml Ascorbinsäure und 22,5 ug / ml Heparin. Das Komplettmediumzunächst bei 37 ° C hergestellt und dann bei 4 ° C für die Verwendung innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung gelagert werden. </li><li> In einen Kolben für Zellen herzustellen, wird komplettem Wachstumsmedium auf eine 75 cm 2-Gewebekulturkolben (1 ml / 5 cm 2) und dann der Kolben lässt man auf 37 ° C / 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für äquilibrieren hinzugefügt mindestens 30 min. Menschliche HUVEC direkt in diesem äquilibriert Kulturkolben in einer Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm 2 ausgesät werden. </li><li> Während die Medien ausgleich, schnell auftauen Lager HUVEC Kryoröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad. Dispergieren der Zellen in der ursprünglichen Speicherfläschchen durch Vortexen und fügen sie direkt zu dem Kulturkolben mit dem voräquilibriert HUVEC komplettem Wachstumsmedium, um eine Dichte von 2.500-5.000 Zellen / cm 2 zu erreichen. Die Flasche vorsichtig rocken gleichmäßig zu verteilen und die Zellen dann die Flasche zurück in den Inkubator. Diese Zellen stellen nun die 1. Durchgang. </li> &lt;li&gt; Medium sollte alle zwei Tage gewechselt werden, bis die Zellen 70-80% konfluent. </li><li> Die HUVECs kann nun aus der Kulturflasche mit Trypsin / EDTA geerntet werden. Das Kulturmedium wird aus den Kulturkolben, gefolgt von einer PBS spülen, um restliches Eiweiß und Kalzium aus den Zellen zu entfernen abgesaugt. A 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zugegeben und innerhalb von 2-6 min Zellablösung sollte klar sein, wie durch Lichtmikroskopie untersucht. </li><li> Wenn 90% der Zellen werden von der Platte abgerundet, stoppen Sie die Trypsinierung durch Zugabe eines gleichen Volumens 2x Trypsin-Inhibitor. Um die Ernte der Zellen zu erleichtern, fügen Sie eine weitere gleiche Menge an vollständige Wachstumsmedium. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Die abgelösten Zellen zentrifugiert bei 225 g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und dann Resuspendieren der Zellen in 2-3 ml Vollwachstumsmedium. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit mit einem Hämazytometer und Trypanblau. </li><li> Um th nutzenE geernteten Zellen für Studium, wieder Samen zusätzliche 75 cm 2-Kolben mit Zellen in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 und gehen Sie zu Schritt 2.2. Alternativ können die Zellen an diesem Punkt für zukünftige Studien eingefroren werden. Für Zellgefrier Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 225 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in FBS mit 10% DMSO bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. Die Zellsuspension wird dann nach dem Einfrieren der Zellen in einem Zellgefrierbehälter zu Kryoröhrchen überführt und bei -80 ° C gelagert. </li></ol> 2. HUVEC Layer-Vorbereitung <ol><li> Verwendung von gefrorenem 2. Passage HUVECs: Wiederbelebung und Kultur. Wenn Sie aktiv wachsenden Zellen, gehen Sie zu Schritt 2.2. <ol><li> Auftauen Kryoampulle enthält 2. Passage HUVECs aus Schritt 1.8 schnell in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen Zellen aus dem Kryoröhrchen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 10 ml Wachstums medium. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur und saugt den Überstand, um das restliche DMSO zu entfernen. </li><li> Zellpellet mit kompletter Wachstumsmedium und übertragen die Zellen in einer 75 cm 2-Kolben. Hinzufügen Wachstumsmedium auf ein Gesamtvolumen etwa 20-25 ml und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Optisch jeden Tag untersuchen die Zellkultur für Zusammenfluss mit Medienwechsel alle zwei Tage. Gewöhnlich versandfertig in 2-4 Tagen werden die Zellen 80-90% Konfluenz zu welcher Zeit sie bereit für den Einsatz in der Strömungskammer Assay zu erreichen. </li><li> Um die Kulturschale, die in der Flusskammer verwendet werden vorzubereiten (siehe Abschnitt 5), 1 ml von 10 ug / ml Fibronektin und 0,05% (w / v) Gelatine zu einer 35-mm-Gewebekulturschale und Pipette mehrmals, um sicher, dass die gesamte Plattenoberfläche beschichtet. Entfernen der übermäßigen Fibronektin und Gelatinelösung und der Luft trocknen die Platte mindestens 30 Minuten, um die Proteinmatrixbildung zu optimieren. Die fibronectin und Gelatine-Lösung kann bis zu 10x wiederverwendet werden. </li><li> Ernte der HUVEC-Zellen aus Schritt 2.2 unter Verwendung von Trypsin-EDTA wie in den Schritten 1.5-1.7 beschrieben. Seed 500.000 Zellen in jedes beschichtete Gewebekulturschale. 2 ml Wachstumsmedium in jeder Schale und bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Lassen Zellen zu wachsen, um, wie in Schritt 2.2 Konfluenz. Zellen sollten visuell täglich mit Mediumwechsel alle zwei Tage überprüft werden. Vor der Flusskammer-Assay, Prime die HUVEC mit 20 ng / ml TNF-α Menschen für 4-6 Stunden zu regulieren und stimulieren Adhäsionsmolekülexpression. </li></ol> 3. Gereinigtes Ligand Coating <ol><li> Zeichnen Sie einen Kreis von 0,5 cm Durchmesser mit einem Marker oder Stift in der Mitte einer 35-mm-Gewebekulturschale. </li><li> Platte 20 ul von 20 ug / ml Protein A in der markierten Fläche. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Protein zu verbreiten, eine Lösung für den gesamten Bereich innerhalb des Kreisdurchmesser 0,5 cm zu bedecken. Es ist wichtig, nicht berühren oder zerkratzen die Oberfläche der dish. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mit 1 ml PBS (pH 8,0) waschen die Protein-A-beschichteten Platte 3x. </li><li> Platte 50 ul 1% BSA in dem markierten Bereich zu blockieren unspezifische Bindung auf der Platte. Inkubation für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Mit 1 ml PBS, wie in Schritt 3.3 wasche die Platte 3x blockiert. </li><li> Bereiten Sie die Fc-Rezeptor-Liganden Haftung chimären Proteins Lösungen für die Beschichtung. In diesem Experiment wurde eine Chimäre ICAM-1/Fc Lösung bei 25 &amp;mgr; g / ml und eine P-Selectin/Fc Chimäre bei 0,5 ug / ml in PBS (pH 8,0) wurde verwendet. </li><li> Bestreichen Sie die markierte Fläche mit 50 ul Substrat. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. Die Schale sollte innerhalb von zwei Tagen verwendet werden, und der beschichtete Bereich sollte nicht austrocknen. In PBS, wenn notwendig, die 50 ul Lösung auf der Platte zu halten. </li></ol> 4. Neutrophilen-Separation (alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt) <ol><li> Nach Einholung der Einwilligung, sammeln Teilnehmer Blut durch Aderlass in einn Antikoagulans Blutröhrchen oder Vacutainer (EDTA oder Heparin). Nach der Blutentnahme, verdünnen das Blut 1:1 mit PBS vor der Trennung. </li><li> Bereiten Sie eine Zwei-Schicht Ficoll zur Trennung von PBMC und Neutrophilen in 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Zuerst 15 ml Ficoll schwer (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,118 bis 1,120), und dann sorgfältig Schicht 10 ml Ficoll leuchten (siehe Liste der Materialien, ρ = 1,077 bis 1,080) auf der Oberseite der schweren Ficoll. Es sollte eine scharfe Grenze zwischen dem Licht und Schwer Ficoll Ficoll Schichten sein. Anschließend vorsichtig Schicht 25 ml der verdünnten Blutprobe auf der Oberseite der Licht Ficoll, ohne die Ficoll-Schicht zu stören. </li><li> Das Röhrchen bei 250 × g für 30 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Der Zentrifugenrotorbremse sollte ausgeschaltet sein, diese Spins um mögliche Störung der Zelltrennung während der Rotorverzögerung am Ende der Zentrifugation zu minimieren. Nach der Zentrifugation werden die folgenden Schichten (von oben nach unten) vorhanden sind: die oberste Schicht ist die Plasma foldurch die PBMC-Schicht auf der Licht Ficoll-Schicht heiraten, ist die Neutrophilen-Schicht mit wenigen roten Blutkörperchen (RBC) zwischen den leichten und schweren Ficoll gefolgt von der schweren Ficoll-Schicht und Erythrozyten am Boden der Röhre. </li><li> Ernte und übertragen die Neutrophilen-Schicht in ein neues 50 ml-Röhrchen mit einem Transfer-Pipette PBS auf ein Endvolumen von 50 ml und zentrifugiert bei 225 g für 10 min bei Raumtemperatur. <ol><li> Nach der Zentrifugation, kann es immer noch mit den Erythrozyten Neutrophilen gemischt sein. Saugen Sie den Überstand bis zur 10 ml-Marke. Resuspendieren des Neutrophilen-RBC Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre (oder einer kurzen niedriger Geschwindigkeit Vortex) und dann wieder waschen mit 50 ml PBS. </li></ol></li><li> Nach dem zweiten Waschen, saugen Sie den Überstand. Um die kontaminierenden Erythrozyten zu entfernen, Resuspendieren der pelletierten Zellen in der Rest PBS durch Bewegung (oder kurz Vortex), 25 ml H 2 O und sanft Wirbel für 10 Sekunden, um die RBC lysieren. <ol><li> 25 ml 1,8% NaCl und sofort mischendurch Zentrifugation bei 225 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die verunreinigenden RBC sollte nun lysiert, wobei ein weißer neutrophilen Zellpellet werden. </li></ol></li><li> Mit PBS Waschen Sie die neutrophilen Zellpellet. </li><li> Resuspendieren der isolierten Neutrophilen in RPMI-Medium mit 10% FBS und bestimmen die Zellkonzentration unter dem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer. </li><li> Stellen Sie die Zelldichte zu 500.000 Zellen / ml mit RPMI-10% FBS-Medium. </li></ol> 5. Flusskammer Adhesion Assay <ol><li> Montieren Sie die Flusskammer. Legen Sie die 35 mm-Schale, die die konfluente HUVECs oder gereinigtes Haftung Rezeptor-Liganden auf dem Mikroskoptisch. Schließen Sie das Parallelplattenlaufkammer mit Spritzenpumpe, Vakuumsystem und lassen Sie eine Zeile offen für die Neutrophilen-Eingang. Legen Sie die Flusskammer auf der Platte und befestigen Sie die Flusskammer Anordnung 13. (Siehe Fig. 1) </li><li> Starten Sie das Video-Aufnahme-Programm auf dem Computer verbunden to das Mikroskop. Stellen Sie das Feld und Fokus des Mikroskops, bis eine klare Feld mit ausgewachsenen HUVEC Zellen oder einem Feld innerhalb der Ligand Beschichtungsbereich sichtbar ist. </li><li> Mit der Spritzenpumpe, spülen Sie die Flusskammer mit RPMI Medium. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Kammer oder der Neutrophilen-Eingabezeile. </li><li> Wenn gewünscht, können die Neutrophilen mit niedriger Dosis (10 -8 M) für 10 min fMLP grundiert werden. Dies wird für eine Anpassung der basalen Ebene der Aktivierung von Neutrophilen zwischen 14 verschiedenen Spendern zu ermöglichen. </li><li> Verwenden der Spritzenpumpe, die Neutrophilen in die Strömungskammer in definierten Geschwindigkeiten zu injizieren (eine Geschwindigkeit von 350 &amp;mgr; l / min, was einer Scherspannung von 1,5 dyn / cm 2 entspricht in dieser Studie). Nehmen Sie das Video. Da die Adhäsion von Neutrophilen kann schnell erfolgen, ist ein Video mit einer Länge von 4-5 min in der Regel ausreichend, um die Haftung Ereignissen zur Analyse quantifizieren. </li><li> Eine anhaftende Zelle als eine Zelle, die weniger als ein Zelldurchmesser bewegt definiertinnerhalb von 5 Sekunden auf der HUVEC oder Liganden-beschichteten Oberfläche 15,16. Zählen Sie die Anzahl der adhärenten Zellen in das Feld in der aufgezeichneten Videos mit dieser Regel vor. Durch die Aufnahme von Videos mit ähnlicher Länge der verschiedenen Geber Neutrophilen, kann man die adhärenten Zellen / min berechnen, um die Hafteigenschaften zwischen verschiedenen Spendern zu vergleichen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll führt die Trennung und Isolierung von minimal-aktivierten Neutrophilen für die sorgfältige Quantifizierung der neutrophilen Haftung unter schiere Stressbedingungen. Neutrophilen-Adhäsion ist ein kritischer Prozess bei der Entzündung. Da genetische Varianten in mehrere Moleküle in diesem Verfahren nachgewiesen wurden, zur Entwicklung von Autoimmunerkrankungen 1,2 prädisponieren, wird ein Assay-System in der Lage, quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen feste Haftung erforderlich. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methode ermöglicht die sorgfältige und quantitative Bestimmung der feste Klebepotenzial von Neutrophilen in einer kontrollierten Umgebung unter in vitro lauter Stress. Dieses Verfahren ermöglicht somit die direkte Vergleich von quantitativen neutrophile Adhäsion zwischen genotypisierten Individuen, die Bedeutung der genetischen Variation in Adhäsionsmoleküle 14 zu bestimmen. Mehrere Schritte in diesem Verfahren verdienen sich sorgfältig überlegen, achieve hoch quantitative und reproduzierbare Ergebnisse. In HUVEC Herstellung ist es entscheidend, zu 100% Zellen Konfluenz vor der Verwendung in der Durchflusskammer zu erreichen. Für die Verwendung mit gereinigtem Liganden beschichteten Oberflächen sollte die Substratbeschichtungsbereich nie austrocknen zu vermeiden Denaturieren des Liganden gestattet. Darüber hinaus ist die Herstellung von Human-Neutrophilen entscheidend für den Erfolg des Experiments. Zentrale Themen bei der Isolierung von Neutrophilen Blut umfassen sanft Handhabung durch Minimierung von Verwirbelung, um die Aktivierung zu vermeiden, halten die Zellen bei Raumtemperatur (dh das Blut nicht auf Eis und Zentrifugationsschritte gespeichert sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann) und der Vollendung der Isolation und das Experiment in kürzester Zeit möglich. Es gibt noch weitere Methoden, die Isolierung von Neutrophilen auch genutzt werden, um Zellen für diese Tests 17,18 vorzubereiten. Aus praktischer Sicht, Haft Tests unter Verwendung von frisch isolierten menschlichen Neutrophilen<html> sollte innerhalb von 3-6 Stunden nach der Aderlass Teilnehmer initiiert werden. Wie Neutrophile sind extrem empfindlich auf Handhabung, könnte längere Zeiten zwischen der Blutentnahme und Nutzungsuntersuchungsergebnisse beeinflussen. Sorgfältige Bestimmung der neutrophilen Zellkonzentration vor der Durchflusskammer Assay ist auch notwendig, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Während der Strömungskammer Assay ist es wichtig, die Videoaufzeichnung sorgfältig zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Strömungsgeschwindigkeit ist konstant und es gibt keine Turbulenz in der gesamten Länge des Experiments. Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit oder das Vorhandensein von Turbulenz würde erfordern, dass der Versuch wiederholt werden. Nach dem Experiment ist es auch wichtig, um die verbleibenden Neutrophilen mikroskopisch beurteilt, um sicherzustellen, dass die Neutrophilen keiner Verklumpung. Verklumpung an diesem Punkt würde bedeuten, dass die Neutrophilen haben sich aktiviert, die Neutrophilen-Dichte während des Experiments deutlich verändern könnten. Inhalt &quot;&gt; Die Flusskammer sorgt für eine nahezu homogene Scherspannung in der Kammer (τ = 6Qμ / (wh 2), wobei Q = Durchfluss, μ = dynamische Viskosität, und w = Breite des Flusskammer, h = Höhe der Flusskammer 15). In unseren Untersuchungen verwendeten wir eine Fließrate von 350 ml / min für die Adhäsion von Neutrophilen, was eine Scherbeanspruchung von 1,5 dyn / cm 2 erzeugt (w = 0,25 cm, h = 0,01 in., die Viskosität von Wasser bei 37 ° C (0.007 Poise) als eine Annäherung der Viskosität des RPMI Medien). Für eine bestimmte Strömungskammer, kann man die Strömungsgeschwindigkeit zu ändern, um verschiedene Ebenen der Scherspannung zu erzielen, um verschiedene physiologische Bedingungen imitieren. Typische physiologischen Scherspannungs in der menschlichen Blutgefäße im Bereich zwischen 0,5 bis 5,0 dyn / cm 13,16. Schubspannung in anderen Blutgefäßen und andere Tiere sind in Tabelle 1 113,16,19 20 aufgeführt. Während unsere Methode auf die Untersuchung der Adhäsion von menschlichen neutrophi fokussiertls, diese Methode ist nicht auf Neutrophilen beschränkt und kann leicht an Haftung oder Roll Studien anderer Zelltypen mit einfachen Modifikationen angewendet werden. Außerdem können die Substrate in diesem Verfahren für verschiedene Zwecke verändert werden. Obwohl dieses Protokoll leicht an verschiedene Studien gibt es einige Einschränkungen. Das Protokoll wie hier implementiert erfordert große Anzahl von primären Zellen für die Analyse. Dies kann die Analyse von Primärzellen von Kleintieren nicht aus. Darüber hinaus kann die Notwendigkeit, gereinigtes Adhäsionsliganden in einer Aktiv / verfügbar Konformation immobilisieren den Bereich der Liganden zu begrenzen. Die Verwendung von Fc-Fusionsproteine ​​stark erhöht die Chancen, eine angemessene Konformation des Liganden auf der Plattenoberfläche. Dennoch hat unsere Methode erhebliche Flexibilität bei der quantitativen Analyse von Haft Ereignisse ermöglichen. Diese Studien werden unser Verständnis der Adhäsion Rezeptor-Ligand-Paare, und die Potentialfunktion Bedeutung der genetischen Varianten erheblich verbessernin diesen Proteinen in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen.

Genetische Varianten, sowohl β 2-Integrine und ICAM-Liganden sind nun erkannt, mit der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen 1,2 zugeordnet werden. Die Bestimmung der funktionellen Konsequenzen dieser Varianten in Zellen von Individuen mit diesen Varianten abgeleitet ist, für das Verständnis, wie diese Varianten tragen zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen erforderlich. Solche funktionellen Untersuchungen ermöglichen die Bestimmung der Mechanismen, durch die natürlich vorkommende genetische Varianten Form die Immunantwort sowohl in Gesundheit und Krankheit. Im konkreten Beispiel von SLE, wir wissen jetzt, dass Varianten in ITGAM (CD11b) und sein Ligand, ICAM-1, stark mit der Entwicklung der Krankheit 1,2 verknüpfen. Da Neutrophile sind entscheidend für Entzündungsreaktionen kann die quantitative Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen liefern mechanistische Einblicke in die genetischen Varianten in ITGAM / ICAM ändern Entzündung. NeutropHIL feste Adhäsion von Zellen (EG) Endothelzellen ist ein hoch regulierter Prozess und spielt eine wesentliche Rolle bei Entzündungsreaktionen 3,4. Die feste Adhäsion von neutrophilen folgt Anfangs Neutrophilen-Roll-und Capture auf die EG und schließlich in Trans in vivo führen. Diese Verfahren umfassen viele verschiedene Arten von Adhäsionsmolekülen, wie ICAM-1, ICAM-2, P-Selectin, E-Selectin in den Endothelzellen und β 2-Integrine auf der Neutrophilen 5-9. Somit wird eine sorgfältige Quantifizierung der Adhäsion von Neutrophilen von Spendern mit verschiedenen Allelvarianten von Adhäsionsmolekülen wichtig sein, um die funktionalen und pathologischen Folgen dieser genetischen Varianten zu verstehen. Erprobung eines Strömungskammer kann eine in vitro-Umgebung mit Schubspannung ähnlich der in dem Blutgefäß in vivo Umgebung 10-12 beobachtet erstellen. In der Tat, eine Flusskammer-Assay mit menschlichen Nabel gekoppeltcal Venenendothelzellen (HUVEC), die in vivo Umgebung eines Blutgefßes zu simulieren. Mit dieser Methode kann man die Gesamtzellhafteigenschaften gegenüber Endothelzellen zu untersuchen. Zusätzlich ermöglicht auch die sehr kontrollierter Umgebung der Strömungskammer Beurteilung der Zellbindung an gereinigtes Haftliganden, wie ICAM-1, um die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen erleichtern. Wir stellen hier ein Verfahren, das eine Strömungskammer Haftung Assaysystem, um die Klebeeigenschaften des menschlichen peripheren Neutrophilen zu HUVEC und gereinigten Liganden Substraten zu untersuchen. Mit dieser Methode mit Zellen von Spendern, die verschiedene Adhäsionsmolekül Allel-Varianten können wir beurteilen, wie diese genetischen Varianten humanen neutrophilen feste Haftung verändern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Neutrophilen feste Haftung an Endothelzellen spielt eine kritische Rolle bei der Entzündung in Gesundheit und Krankheit. Der Prozess der neutrophilen feste Haftung sind viele verschiedene Adhäsionsmoleküle einschließlich der Mitglieder der β 2-Integrin-Familie und ihre Gegenrezeptoren der ICAM-Familie. Kürzlich, natürlich vorkommende genetische Varianten in beiden β 2-Integrine und ICAMs wird berichtet, dass mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht werden. Daher ist die quantitative Haftvermögen der Neutrophilen von Individuen mit unterschiedlichen allelen Formen dieser Adhäsionsmoleküle wichtig in Bezug auf die Mechanismen der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen zugrunde liegenden studieren. Haftungsuntersuchungen in Strömungskammer-Systeme können eine Umgebung mit Schubspannung ähnlich der in dem Blutgefäß in vivo-Umgebung beobachtet erstellen. Hier mit einer Durchflusskammer-Assay-System, um die quantitative Hafteigenschaften der menschlichen peripheren Blut Neutrophilen studieren präsentieren wir eine Methodes für die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC) und gereinigten Liganden Substraten. Mit diesem Verfahren können die Neutrophilen Klebe Kapazitäten von Spendern mit verschiedenen Allelvarianten in Adhäsionsrezeptoren bewertet und verglichen werden. Dieses Verfahren kann auch modifiziert werden, um die Haftung der anderen Primärzelltypen oder Zelllinien zu beurteilen.

Beispiele von Neutrophilen-Bindung an gereinigte Ligand (ICAM-1/P-Selectin) beschichteten Strömungskammer (2) oder die Bindung an einen Neutrophilen-HUVEC beschichtet Strömungskammer Assay (Fig. 3) gezeigt. Wie in den Figuren gezeigt, Neutrophilen weiterhin zu akkumulieren / haften an der beschichteten Oberfläche oder HUVEC unter Bedingungen der kontinuierlichen Fluss. Unter unseren typischen Versuchsbedingungen, können wir 50-70 menschlichen Neutrophilen während eines Vier-Minuten Aufzeichnungsdauer fest an der beschichteten Oberfläche haften oder HUVEC beobachten. Jedoch Allelvarianten Neutrophilen Adhäsionsmoleküle oder Allelvarianten in dem Substrat (gereinigt Ligand oder HUVEC), konnte im Wesentlichen quantitative neutrophile Adhäsion 14 verändern. Ferner beurteilten wir die Zeitabhängigkeit der in unseren Studien beobachtet Adhäsion von Neutrophilen Ereignisse. Während wir eine konstante Strömungsverhältnisse ist es möglich, dass die Hafteigenschaften der Zellen über die Zeit ändern. However, über die relativ kurze Zeit Kurse in unseren Studien haben wir keine konsistenten Unterschiede in der Rate der Haftung über die Zeit einhalten. Zum Beispiel die Beurteilung Haftung an den 1-2 Minuten-Zeitpunkten verglichen, um die Haftung zwischen den 3-4 min Zeitpunkten beobachtet wurden, sind nicht konsequent anders. Natürlich, wenn Zellen, die während des Experiments Adhäsion stimuliert, wechselt dann in Hafteigenschaften über die Zeit zu erwarten. In unseren Studien zur Isolierung induzierte Aktivierung von Neutrophilen gesteuert wir durch absichtlich Grundierung der Zellen mit niedriger Dosis fMLP (10 -8 M) für 10 min vor der Studie. Endothelzellen (HUVEC in unseren Studien) bedarf einer vorherigen Aktivierung Adhäsionsmolekülexpression für optimale Leukozyten feste Haftung hochregulieren. In Abwesenheit von Vorbehandlung, wird Endothelzellen (HUVECs) sehr wenig Neutrophilen-Adhäsion zu unterstützen. In unseren Untersuchungen haben wir 10 ng / ml TNF-Behandlung für 4-6 Stunden vor der Verwendung. IL-1β (10 ng / ml) und<html> LPS (0,5-1 ug / ml) können auch verwendet werden, um vor Aktivierung der Endothelzellen werden. Wichtiger ist, kann unbehandelt HUVEC als Negativkontrolle verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Zelladhäsion wird durch spezifische (Rezeptor-vermittelte) Neutrophilen-Endothel-Zell-Wechselwirkungen verursacht werden. Alternativ können Anti-Rezeptor-Antikörper verwendet, um spezifische Rezeptoren zu blockieren, um die Spezifität der Haftung zu beurteilen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flusskammer-Konfiguration auf dem Mikroskoptisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; . Abbildung 2 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A ICAM-1/P-Selectin: 0 Zeitpunkt, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 Minuten Zeitpunkt). Die Konzentration von ICAM-1 ist 25 ug / ml und P-Selectin ist 0,5 ug / ml. Neutrophilen-Strömungsgeschwindigkeit von 350 ul / min mit Neutrophilen Dichte auf 500.000 Zellen / ml. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . Abbildung 3 Screenshots von einem Beispielvideo von Neutrophilen Einhaltung HUVEC beschichteten Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten (A: Zeitpunkt 0, B: 1 min Zeitpunkt, C: 2 min Zeitpunkt und D: 4 min Zeitpunkt).Neutrophile Strömungsgeschwindigkeit beträgt 350 ul / mit neutrophilen Dichte bei 500.000 Zellen / ml ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Spezies </td><td > Lage </td><td > Scherbeanspruchung (dyn / cm 2) </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 11,6 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Kiemenarterie </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> A. femoralis communis </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Nebenniere Aorta </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Supraceliac Aorta </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Oberflächliche fermoral Arterie </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Venolen </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut ersten Arteriolen </td><td> 40,2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut zweiten Arteriolen </td><td> 0,001 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut ersten Venolen </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Mensch </td><td> Netzhaut zweiten Venolen </td><td> 0,43 </td></tr><tr ><td> Hund </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 15,8 </td></tr><tr ><td> Kaninchen </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 23,3 </td></tr><tr ><td> Ratte </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 46,6 </td></tr><tr ><td> Maus </td><td> Gemeinsame caroid Arterie </td><td> 64,8 </td></tr><tr ><td> Hund </td><td> A. femoralis communis </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Kaninchen </td><td> A. femoralis communis </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Ratte </td><td> A. femoralis communis </td><td> 65,9 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispielscherspannung in verschiedenen Organen und verschiedenen Arten. * Von Artikeln 13, 16, 19 und 20 zusammengefaßt.

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Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung. 

Serie: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...