Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung: <ul><li> Bereiten Sie sterile Sezieren Lösung (DS). </li><li> Bereiten NBM/B27 (Neurobasal Mediom mit B27-Ergänzungsmittel). </li><li> Autoclave ddH 2 O und sterilisieren Glas coversilps, wenn nötig. </li><li> Coat Gewebekulturschalen oder Deckgläser mit Poly-D-Lysin. </li></ul> Poly-D-Lysin-Beschichtung: Bereiten Sie den Tag vor Kultivierung unter sterilen Bedingungen. <ul><li> Thaw Aliquot 10X PDL und auf Eis stellen. </li><li> Add 9 ml sterile ultra-gefiltertes Wasser zu 1 ml PDL und gut mischen (1X). </li><li> Coat Oberflächen mit 1X PDL über Nacht bei Raumtemperatur wie folgt: <ul><li> Deckgläser (Bellco Glass, Inc. Cat # 1943-00012.): 75 ul / Deckglas OR </li><li> 24 well Zellkulturplatten: 300 ul / well OR </li><li> 35mm Kulturschale: 1ml/dish </li></ul></li><li> Spülen 5X mit sterilem Wasser (benutzen sterile Pasteur Pipetten auf Flüssigkeitsaufnahme). </li><li> Entfernen Sie das Wasser bis die Oberfläche vollständig trocken ist. </li></ul> Die Kultivierung Verfahren (done in Laminarströmungshaube unter sterilen Bedingungen) <ol><li> Cut out-Block-Agar und klebe sie auf die Unterstützung Block des Mikrotoms Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) mit Sekundenkleber. </li><li> Bei der Verwendung von späten Embryonalstadium (E17-18) Mäusefeten, einschläfern Damm, zu entfernen Gebärmutter und freie Individuum Föten aus embryonalen Sack. Legen Sie Föten in sterile Petrischale und dann weiter wie unten beschrieben. </li><li> Enthaupten Maus Fötus oder Welpe (folgen Richtlinien von Ihrem Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt). </li><li> Entfernen Sie Haut und Schädel und Gehirn statt auf Whatman Filterpapier Festplatte in einer 60mm-Petrischale mit kaltem DS gefüllt. </li><li> Schneiden Sie das Kleinhirn mit einer sterilen Rasierklinge. </li><li> Pick up Gehirn mit einem Spatel und Drain überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier, dann Transfer Gehirn Vibraslicer Stützblock und Leim Gehirn statt (kaudalen Seite nach oben und ventralen zugewandte Teil Agar). </li><li> Kammer füllen mit kaltem DS. Set-Gang-Wahlschalter auf 8-9. </li><li> Cut 200-400 um Abschnitte, beginnend ab Riechkolben. Sobald die Klinge des Vibraslicer in die Hirnrinde, beginnen Schneiden 600μm koronalen Abschnitte. Ein E17-18 Maushirn typischerweise Erträge 3-4 brauchbare Scheiben, während ein P0 Maushirn Erträge 4-5 brauchbare Scheiben schneiden. </li><li> Transfer Hirnschnitten bis 35 mm Petrischale beschriftet DS 2 mit umgekehrter Ende un-plugged 10 ml Glas Pasteur-Pipette. </li><li> Dissect aus Rinde und entfernen Meningen mit Glas Nadeln von Kapillaren gezogen. </li><li> Cut kortikalen Rinde in kleine Stücke, 0,5-1 mm in der Länge. </li><li> Filter ES durch 0,2 um-Filter an einer 5-ml-Spritze in eine 35 mm Petrischale. </li><li> Übertragen Sie die kortikale Gewebestücke zu Petrischale mit gefilterten ES. </li><li> Bei 37 ° C für 30 min. </li></ol> In der Zwischenzeit: <ol><li> Clean up Kapuze, Vibraslicer und seziert Werkzeuge. </li><li> 5 ml warmem NBM/B27 in eine 60 mm Petrischale. </li></ol> Nach 30 min. Inkubationszeit: <ol><li> Transfer-Gewebe auf 10 ml DS. Lassen Sie regeln für 1 min. </li><li> Transfer-Gewebe zum ersten Hallo Röhre wirbelt und lassen niederlassen für 2-3 min. </li><li> Übertragen auf den zweiten Hallo. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Transfer zum ersten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Übertragen auf den zweiten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Weitergabe an Dritte Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Transfer-Gewebe, die 60 mm Schale mit Medien. </li></ol> Unter dem Dissektionsmikroskop: <ol><li> Reinigen Sie Schmutz von Gewebe und verreiben jedes Stück durch leichtes Passieren einer gezogenen Glaspipette (Verwendung abnehmende Bohrungen) zur Auflockerung des Gewebes. </li><li> Transfer-Zellsuspension zu 15 ml konische Röhrchen mit dem Rest der NBM + B27 (Einen insgesamt 13 ml für eine 24-Well-Platte oder 11 ml für 5 -. 35 mm Schalen vorsichtig mischen und warten große Gewebestücke zu begleichen). </li><li> Transfer-Zell-Suspension (0,5 ml / well einer 24-Well-Platte oder 2 ml / 35 mm Kulturschale). </li><li> Bei der Verwendung von Deckgläsern, fügen Sie 80 ul Zellsuspension pro Deckglas und erlauben für 1 Stunde in Gewebekultur-Inkubator für die Zellen vor dem Hochwasser der Kammer mit mehr NBM/B27 Medien einhalten. </li><li> Behalten Kulturen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Next Day 24 well Platte: Feed jedes Well mit 0,5 ml nicht-neuronalen Zellen konditioniert NBM/B27 Medium (cNBM/B27; Protokoll für die Vorbereitung der cNBM/B27 Medium erscheint unten) 35mm Speisen: Ersetzen Sie 0,5 ml mit cNBM/B27 Medium. Behalten Kultur durch den Austausch mit 0,5 ml Medium mit frischem cNBM/B27 alle 2-3 Tage. Obwohl die Kulturmedien nicht fördert Glia Zellproliferation, können Kulturen mit 5 &amp;mgr; M FDU (5-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin, Sigma F0503) an Tag 3-5 in Kultur behandelt werden zur weiteren Reduzierung der Anzahl von Gliazellen, wenn nötig. SET<html> -UP für Dissection und Kultur Sterilisieren Sezieren Tools in 70% EtOH oder Autoklaven ihnen: <ul><li> Scissors (med. und klein) Spatel (med. und klein) </li><li> Pinzette (med. und klein) Razor Blade </li><li> Blade für vibraslicer Buffer Bad </li><li> Kleiner Metall-Keil für Blade-Unterstützung für Gehirn </li></ul> Andere Materialien: <ul><li> Petrischalen (60 mm) </li><li> Petrischalen (35 mm) </li><li> Filterpapier </li><li> Glaspipette 10 ml </li><li> Sterile Einweg-Pipetten, 5,10 und 25 ml </li><li> Syringe Filter, 0,2 &amp;mgr; </li><li> Spritze 5 ml </li><li> Zentrifugenröhrchen, 15 ml </li><li> Sterile Pasteur Glaspipetten </li><li> PDL beschichteten Kulturschalen oder Deckgläser </li></ul> Label sechs 15 ml-Zentrifugenröhrchen und folgen Sie der Zubereitung: Tube # 1: Enzymlösung: Add 50 U Papain (Worthington LS 03126) bis 5 ml DS enthält: <ul><li> 100 &amp;mgr; l von L-Cystein (0,8 mg) </li><li> 7 ul 0,1 N NaOH </li><li> 50 pl APV (5mm) </li></ul> Leave-Lösung bei Raumtemperatur zu löschen. Beachten Sie, dass Enzymlösung erscheint &quot;bewölkt&quot; auf den ersten und muss vor dem Gebrauch zu löschen. Tube # 2 &amp; # 3: Hallo Enzyme Inhibitor: 3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mm). Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, dann in zwei 1,5 ml Aliquots aufzuteilen. Tube # 4 - # 6: Low Enzyme Inhibitor: 8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mm). Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, in drei 2,6 ml Aliquots aufzuteilen. Die Röhrchen durchnummeriert # 2 bis # 6 auf dem Eis. Lassen Röhre # 1 (Enzymlösung) bei Raumtemperatur. SOLUTIONS und Aliquots <ul><li> Lösung A (Kochsalzlösung) Sigma Formel wt 500 ml [conc.] </li><li> Natriumchlorid NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Kaliumchlorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mm </li><li> Natriumdihydrogenphosphat wasserfreies Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0.24g 0,17 </li><li> Kaliumphosphat Einbasisches wasserfrei KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,3 g 0,22 mm </li></ul> Wiegen Sie alle Zutaten und mischen, bis auflösen mit 400 ml ultra-gefiltertes Wasser. Bringen Endvolumen von 500 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label &quot;DS-Lösung A&quot;. <ul><li> Lösung B (Hepes) Sigma Formel wt 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9.9mm </li></ul> Fügen Sie ultra-gefiltertes Wasser bis zu 200 ml. Mix bis zur Lösung und bringen Endvolumen von 250 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label &quot;DS-Lösung B&quot;. <ul><li> Working-Lösung 500 ml [conc.] </li><li> Ultra-gefiltertes Wasser 400 ml </li><li> Stammlösung A 25 ml </li><li> Stammlösung B 14 ml </li><li> D (+)-Glucose Sigma G-8270 3.0 g 33.3mm </li><li> Sucrose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mm </li></ul> Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. Bringen Endvolumen von 500 ml mit ultra gefiltertes Wasser. Dekantieren in eine saubere Glasflasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C. Label &quot;Dissecting Solution&quot;. Poly-D-Lysin Zubereitung: <ol><li> Bereiten 10x Stammlösung von Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P-7280) in sterilem H 2 O bei 1mg/ml. </li><li> Machen Sie 1,0 ml Aliquots. Diese Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden bis zu 3 Monaten. </li></ol> MEDIA <ol><li> Fügen Sie 10ml der B-27 Supplement (Gibco 17504-044) auf 500 ml NBM Flasche (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049). </li><li> Machen Sie 40 ml aliquotiert und bei 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> 10 ml sterilem H 2 O zu Durchstechflasche mit 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic acid, Sigma A-5282) und gründlich mischen. </li><li> Bereiten Sie 180 ul Aliquots und bei -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> 1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) und 1 g Trypsin Inhibitor (Sigma T-9253) in 10 ml DS. </li><li> Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. </li><li> Sterilisieren durch Filtration über 0,2 &amp;mgr; Spritzenfilter. </li><li> Teilen Sie sich in 400 ul Aliquots und bei -20 ° C. </li></ol> L-Cystein In einem Eppendorf-Röhrchen lösen 0,6 mg L-Cystein (Sigma C-7755) in 200 ul DS. AGAR (4%) <ol><li> 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) in 100 ml sterilem Wasser. Halten Sie bei 4 ° C bis zur Kultur benötigt. </li><li> Mikrowelle Agar zu schmelzen und füllen eine 35 mm Petrischale. Lassen Sie sitzen, um abzukühlen und zu polymerisieren. </li></ol> Papain (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; nicht-neuronalen KULTUREN IN NUNC Kulturflaschen COATING Kulturflasche (4 Nunc Flaschen) <ol><li> Add 9 ml sterilem Wasser zu jedem der 3 Röhrchen 10X PDL auf 1X PDL machen. </li><li> Transfer 30 ml 1X PDL in der ersten Flasche. </li><li> Bewegen Sie etwas, bis alle das Wachstum Flächen abgedeckt werden. Lassen Sie sitzen für 1 min. </li><li> Transfer 1x PDL auf den zweiten Flasche. Lassen Sie sitzen für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie mit dem dritten und vierten Flaschen. </li><li> Spülen Sie alle vier Flaschen 2X mit 150 ml sterilem H 2 O. </li></ol> PREPARE Enzymlösung (ES): <ol><li> In einem 0,6 ml Zentrifugenröhrchen Gewicht aus 0,8 mg L-Cystein (Sigma C7755), add 150ml DS und vortexen, bis Kristalle gelöst sind. </li><li> Jeweils 5 ml DS zu einem 15 ml konischen Rohr, dann fügen Sie 150ml L-Cystein. </li><li> Fügen Sie 50 Einheiten Papain. (Worthington LS 03126) </li><li> Add 7ml 0,1 N NaOH. </li></ol> PREPARE MEM (GIBCO # 11090-081) <ol><li> Nehmen Sie 65 ml aus der 500 ml Flasche MEM. Sparen Sie 10 ml auf Glucose vorzubereiten. </li><li> 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> 50 ml Fetal Bovine Serum (Gibco # 16140-071) oder bovinem Kälberserum (Omega BC-04). </li><li> Gut mischen, Aliquot und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Neurobasalmedium MEDIUM/B-27 Supplement (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049); B-27 (50x), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Fügen Sie den gesamten Inhalt des B-27 Fläschchen der NBM Flasche und mischen. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. </li></ol> DISSECTION des Hirngewebes <ol><li> Dry Sezieren Tools von 70% EtOH vor ihrer Zerlegung. </li><li> Transfer 10 ml DS in jedem von 3-15 ml Tube. </li><li> Wählen Sie mit der Maus Welpen (P0 - P3), werden Sie drei Gehirne für 4 Flaschen müssen. </li><li> Add kalten DS bis 35 mm Petrischale. </li><li> Enthaupten Maus pup und sezieren aus Gehirnen. </li><li> Legen Gehirn in der Petrischale mit kaltem DS. </li><li> Hacken Gewebe in Stücke klein genug, um durch eine Glaspipette passieren. </li></ol> ENZYME Dissoziation <ol><li> Entfernen Sie so viel DS wie möglich aus der Schale mit einer Pasteurpipette. </li><li> Filter ES durch einen 0,2 um Filter und 5cc Spritze. </li><li> Legen Sie ES in die Schale mit Gewebe. </li><li> Inkubieren Gewebe bei 37 ° C Inkubator (CO 2-frei) für 30 min. </li></ol> WASCHEN TISSUE <ol><li> Transfer-Gewebes mit Glaspipette zum ersten DS Rohr, was Sie so wenig ES wie möglich zu erhalten. </li><li> Zentrifuge für 30 sec bei 1500 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Transfer-Gewebe und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male. </li></ol> Verreibung <ol><li> Platz 38 ml MEM / FBS in ein 50ml-Zentrifugenröhrchen </li><li> 3 ml MEM / FBS auf eine 35 mm-Schale und Transfer Gewebe dieser Petrischale. </li><li> Distanzieren das Gewebe durch leichtes Verreiben es durch eine 1000μl eppendorf Pipettenspitze. </li><li> Transfer-Zell-Suspension auf die Tube mit 38ml der MEM / FBS und gut mischen. </li></ol> PLATING <ol><li> Stand der Kultur-Flaschen aufrecht zu gleichen Mengen der Zellsuspension und Medien in jede Flasche zu bekommen. </li><li> Setzen Sie 90 ml MEM / FBS in jeder Kultur Flasche. </li><li> 10 ml Zellsuspension in jede Flasche. </li><li> Label: Non-Neuronal, Initialen und das Datum. Bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> FÜTTERUNG <ol><li> Am Tag 3 oder 4, Futtermittel-Zellen mit warmem MEM / FBS (dekantieren alle Medien und ersetzen Sie es mit 100 ml MEM / FBS). Kulturen können 7-10 Tage, um sich konfluent. </li><li> Am Tag 7-10 Veränderung der Medien für NBM/B27. </li><li> Am nächsten Tag sammeln die Medien. Filter mit 0,22 &amp;mgr; m </li><li> Machen Aliquots von 40 ml und Futtermitteln Kultur mit MEM / FBS. </li><li> Next 2 oder 3 Tage, ändern Medien für NBM/B27 </li><li> Am nächsten Tag, zu sammeln und den Vorgang wiederholen. </li><li> Halten Sie sammeln Medien für ca.. 2 Wochen. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

Dieses Video wird Sie durch den Prozess zur Erzeugung von kortikalen neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Gehirn der Maus. Diese Kulturen können für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Imaging-, Protein-und / oder RNA-Isolierung verwendet werden. Diese Kulturen auch eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein Ende der embryonalen oder postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren. Das Verfahren ist relativ einfach, erfordert eine gewisse Erfahrung in der Gewebekultur Technik und sollten nicht länger als zwei Minuten vor drei Stunden, wenn Sie richtig vorbereitet sind. Eine sorgfältige Trennung der kortikalen Rinde von den thalamo-kortikalen Fasern Trakt verringert sich die Anzahl der unerwünschten nicht-neuronalen Zellen. Zur Erhöhung der Erträge von neuronalen Zellen verreiben die Stücke des kortikalen Gewebes sanft nach der Enzyminkubation Schritt. Dies ist zwingend notwendig, da es unnötige Verletzungen verhindert, Zellen und vorzeitigem Zelltod. Da diese Kulturen in der Abwesenheit von Gliazellen Feeder-Zellen gehalten werden, sie bieten auch einen zusätzlichen Vorteil der wachsenden Kulturen in Neuronen angereichert.

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Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

43.3K Aufrufe.  University of California, Irvine (UCI). Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Serie: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Erstellung und Pflege von Spinalganglien Neuronen in Compartmented Kulturen

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Herstellung von Ratten-Gehirn-Aggregate Kulturen für Neuron und Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Methods Article

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen