Wir möchten die Grundzüge der Stem Cell Research Center FACS anerkennen und vor allem danke Jessica Scholes und Felicia Codrea für ihre Hilfe bei der Zellsortierung. Die Arbeit wurde durch CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Foundation ATS-06-065, Das Concern Foundation, The UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Lung Cancer SPORE, der University of California Cancer finanziert Forschung Coordinating Committee und das Gwynne Hazen Kirsche Memorial Laboratories (BG).

Outline of Steps Ein. Dissection der Luftröhre 2. Reinigung Luftröhre und Schneiden 3. Enzymverdau und Verarbeitung zu Einzelzellsuspension 4. Färbung für FACS und Sortierung 5. Verarbeitung sortierten Zellen in vivo und in vitro-Modelle Ein. Dissektion der Trachea <ol><li> Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,1 cc von Pentobarbital mg/0.2. </li><li> Schneiden Sie die Bauchdecke, und bewegen Sie den Darm zur Seite, um die Bauchaorta aussetzen und dann sezieren. </li><li> Öffnen Sie die Brust durch einen Schnitt durch die Membran und vorderen Brustwand auf beiden Seiten, um das Herz und die Lunge aussetzen. Weiter Zerschneiden in den Hals Entfernen der Fett-und Speicheldrüsen, die Luftröhre aussetzen. </li><li> Entfernen Sie den Thymus und schneiden die Lunge aus seinen Verbindungen unten und hinten. Separaß die Trachea vom Oesophagus eine Zange durch Einfügen zwischen ihnen dann schneiden die Luftröhre an seinem oberen zumeist oberhalb seiner Verbindung mit dem Kehlkopf. Dann halten die Luftröhre mit einer Pinzette und sezieren von ihrer Befestigung und weiter unten, um ihn mit dem Herz und der Lunge en-Block zu entfernen. Schneiden Sie das Herz und die Lunge in der Nähe des Nabels, die meisten der rechten und linken Hauptbronchus gehören. </li><li> Zeigen die Luftröhre in einer kleinen Petrischale mit Auffangmediums auf Eis. </li></ol> 2. Reinigung Luftröhre und Cutting It <ol><li> Unter dem Binokular, benutze sehr feinen Spitze Zange (Nr. 5) und Vannas Tübingen Schere (FST 15003-08 finescience.com), um die Luftröhre von allen anderen Geweben an ihn zu reinigen. Dazu gehören: Lymphknoten, Recurrens, Fett, Schilddrüse und restlichen Lungengefäße. Der obere Teil der Luftröhre bedarf besonderer Aufmerksamkeit, um die großen Kehlkopfknorpel ohne den größten Haufen SMG entfernenDas ist zwischen dem Ringknorpel und der ersten trachealen knorpeligen Ring (C1) 4 eingereicht. </li><li> Schneiden die Trachea in den oberen Teil und dem unteren Teil zwischen C4 und C5 und dann aufgeschnitten beide Teile durch das Lumen der Luftröhre. </li></ol> 3. Enzym Verdauung und Verarbeitung in Single Cell Suspension (SCS) <ol><li> Inkubieren der untere Teil der Luftröhre in 1 ml 16 U Dispase in ein Eppendorf-Röhrchen bei Raumtemperatur (RT) für 30 min, wie zuvor 5 beschrieben. Dann fügen Sie 0,5 mg / ml DNase I in DMEM für weitere 20 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die verdaut Luftröhre in die frische Auffangmediums in einer sterilen Petrischale und isolieren das Oberflächenepithel unter dem Binokular. Mit einer Pipette das Medium, welches das Epithel abgezogen, um eine 50 ml konischen Röhrchen übertragen. </li><li> Spin down das abisolierte Epithel bei 1.000 xg bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und 0,1% Trypsin / EDTA und Inkubation unter Schütteln the Rohr in einer 37 ° C Schüttelinkubator (200 UpM) für 30 min. Nach der Inkubation mit einem 1.000 ul Spitze, und Abpipettieren aufzubrechen Klumpen und bilden eine einzige Zellsuspension. </li><li> Den oberen Luftröhre in einer konischen Röhrchen mit 1 ml 0,15% Pronase. Dann bei 4 ° C für 4 Stunden inkubiert. </li><li> Vorsichtig das Röhrchen vortexen und dann die Luftröhre in frischen Auffangmediums und bestätigen unter dem Binokular, dass es vollständige Ablösung der Oberfläche Epithel (SE). </li><li> Mince die Luftröhre mit einer feinen Schere zu öffnen, die SMG Fächer und dann inkubieren für eine weitere Stunde in Pronase bei RT mit langsamen Schütteln. </li><li> Spin-Down der Luftröhrengewebe, entfernen Sie die Pronase, mit 0,1% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter Schütteln wie oben. </li><li> Passage die verdauten Zellen, Klumpen und alle verbleibenden Stücke von Drüsen durch 20G, 23G und 26G Nadeln mit einer 10 ml Spritze. Wiederholen Sie die Passage mehrmals mit jeder Nadel Größe vorRücktritt. Jetzt sollten die meisten Zellen in einem SCS sein. </li><li> Filtern Sie die Suspension durch eine 40 uM Sieb waschen dann das Sieb und Spin-Down der Zellen. Dann rekonstituieren die Zellen in einem geeigneten Volumen des Mediums, zu zählen und die Zellen gehen sofort in FACS Färben und Sortieren. Lassen Zellen in 4 ° C oder auf Eis für mehrere Stunden, da wir fanden, dass dies die Lebensfähigkeit beeinträchtigt und eine erhebliche Verringerung der bildenden Kugel Effizienz. </li></ol> 4. Färbung für FACS und Sortierung <ol><li> Nehmen Sie genügend Zellen für die Herstellung der ungefärbten und Single gebeizt Entschädigung Rohre werden dann färben den Rest der Zellen mit primären Antikörper, Ziege TROP2 und Ratte ITGA6, für 15 min bei RT. Dann mit PBS waschen oder Auffangmediums, Remover den Überstand sehr vorsichtig und brechen das Zellpellet. </li><li> Stain mit dem entsprechenden sekundären Antikörper, im Dunkeln bei RT inkubieren 10 min, waschen und Überstand und dann brechen die Pellets. </li><li> Auf den FACSARIA, bereinigt Ihre Spannung und Ausgleich, Tor aus den Trümmern, sehr kleine Zellen, Dubletten und tote Zellen. Dann sollten die meisten Zellen aus der SE sein TROP2 positiv, während 20-50% der SMG Zellen TROP2 + 6 sein wird. </li><li> Ihre eingestellt Sortier-Gatter zum TROP2 + +-Zellen aus ITGA6 SE (Basalzellen) und für TROP2 +-Zellen (+ /-ITGA6 positive Zellen) aus SMG (Kanal-Zellen). </li></ol> 5. Verarbeitung sortierten Zellen für: In-vitro-Kultur und in vivo Modell 5.1 In vitro bildenden Kugel 5-9 Kultur <ol><li> Mix 100 ul von &quot;Growth Factor reduziert Matrigel&quot; mit 100 ul Vollmedium 10,11 (siehe Tabelle 1), die bis zu 50.000 sortierten Zellen dann setzen Sie diese Mischung in der oberen Kammer eines 24-Loch-trans-well. Dann legen Sie 400 ul Vollmedium in der unteren Kammer und bei 37 ° C inkubieren Ändern Medium in der unteren Kammer jeden zweiten Tag und zusätzliche 100 ul Matrigeljede Woche oder früher, wenn es dünn wird. </li></ol> 5.2 In-vivo-Modell <ol><li> Rekonstituieren der sortierte Zellpellet in Vollmedium gemischt 1:1 mit Matrigel in einer Konzentration von 5.000-10.000 Zellen pro 50 pl. </li><li> Anesthetize die Empfänger C57/BL6-Mäusen. Verabreichen Carprofen (5 mg / kg) subcutaenously als Analgetikum. Sterilisieren und rasieren ihre Rücken dann eine zentrale Längsachse Hautschnitt in den oberen Rücken. Der Schnitt sollte groß genug sein, um den Fettkörper Injektionsstelle sowie der Bläschenzubereitung, das nach der Injektion bildet identifizieren. Verwenden der stumpfen Seite der Schere um Taschen zwischen der Haut und der Rückseite des Brustwand beidseitig um Zugang zu maximieren und Visualisierung verbreitern. </li><li> Identifizieren Sie die medialen Rand des Schulterblattes, indem Sie die Maus Vorderbein und nach hinten, um das Schulterblatt bewegenden sehen. Nehmen Sie 50 ul der Zellsuspension in einem 300 ul BD Insulin Spritze aufgezogen und in der Fettpolster unmittelbar medial des Schulterblattes und lateraldie Wirbel. Sie sollten in der Lage sein, um eine Blase sonst sind Sie zu tief zu sehen. Wiederholen Sie das gleiche auf der anderen Seite dann Clip oder Stich in die Haut Einschnitt. Prüfen Mäusen und geben Carprofen (5 mg / kg, sc) einmal täglich während 48 Stunden. </li><li> Nach 3 Wochen einschläfern Mäuse mit pentobarbatol (0,1 mg/0.2 cc, IP), öffnen Sie die Haut wie oben und sezieren die ganze Fettpolster von beiden Seiten mit einer Sicherheitsmarge zu vermeiden, fehlt jegliches Gewebe-Struktur, die gebildet und hätte verlängert sich um. Fix in PFA und einbetten in Paraffin 12. Extreme Vorsicht ist beim Trimmen und Schneiden der Block nicht zu umgehen oder zu übersehen, eine Struktur eingesetzt werden. Die beste Vorgehensweise ist bis 40 um trimmen einmal, dann schneiden Sie ein 4 um Scheibe, legen Sie sie auf einen Objektträger aus Glas und untersuchen sie unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, ob es irgendwelche &quot;epithelialen Strukturen&quot; in diesem Teil des Blocks sind oder nicht. Wenn es nichts zu sehen, dann noch einmal trimmen und wiederholen Sie diesen Schritt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Stripping der Maus Luftröhren wird in einem denudierten Luftröhre, die durch Lichtmikroskopie sichtbar ist, wie in 1A gezeigt, führen. 1B zeigt die Ansicht einer Hellfeld Luftröhre nach epithelialen Strippen mit submucosalen Drüsen wobei aus den Geweben und ähnelt Weintrauben freigegeben. Pronase entfernt das ITGA6 Epitop und deshalb die TROP2 Gangzellen nicht in ITGA6 + und abgetrennt werden - Populationen. Jedoch verdaut Dispase, welche die ITGA6 Epitop bewahrt, alle Oberflächenepithel und die Gangzellen auch bei sehr kurzen Inkubationszeiten, und kann daher nicht verwendet werden, um Kanal von Basalzellen 3 trennen. Durchflusszytometrie der einzelnen Zellsuspensionen sollte zeigen Vorwärtsstreuung und seitlichen Streudiagramme, die in 2A dargestellt werden. Gute Trennung des Kanals Zellen aus dem Rest, wenn die trachealen Zellen mit dem TROP2 Antikörper sollte in der Durchflusszytometrie werden für Leuchtstofflampen activated cell sorti gesehenng (FACS), wie in 2B zu sehen. Kügelchen sollten in der Matrigel nach ca. 1 Woche in Kultur sichtbar und sind im Aussehen dicht wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Effizienz dieses Prozesses ist die Größenordnung von 1-2% und Einzelzellen wird immer noch in der Matrigel Gegenwart und wahrscheinlich stellen Zellen aus den submukösen Drüsenkanäle, die nicht über die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Injektion von Stammzellen Kanals in die Maus Fettpolster führt zur Bildung von submukosalem Drüse-ähnliche Strukturen, Abbildung 4 dargestellt sind. Diese werden in den Blöcken auch ohne H &amp; E-Färbung gesehen. Dies sind kugelförmig und besitzen eine mittlere Lumen. Viele Querschnitte müssen durch die Fettpolster werden, um nicht diese epithelialen Strukturen verpassen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" /> Abbildung 1. Enzymatische Verdauung von Trachealepithels. Entfernung von Oberflächen-Epithelzellen mit blac angezeigtk Pfeile, die Entfernung von Zellen in den submucosalen Drüsenkanäle ist mit grünem Pfeile dargestellt. Denudierten Luftröhren, die durch Lichtmikroskopie sichtbar sind, werden nach 30 min Dispase Verdauung und nach 4 h Pronase Verdauung gezeigt. <img alt="2A" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" /> 2A. I. Durchflusszytometrie der einzelnen Zellsuspensionen zeigt repräsentative Vorwärtsstreuung und seitlichen Streudiagramme von Maus Luftröhre nach Oberflächenepithelzellen Strippen. ii. Vertreter FACS Plots für TROP2 Ausdruck im Kanal Zellen aus Maus Luftröhre. <img alt="2B" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" /> 2B. I. Durchflusszytometrie der einzelnen Zellsuspensionen aus abgestreift Oberflächenepithel der unteren zwei Drittel der Maus Trachea zeigt repräsentative Vorwärtsstreuung und seitlichen Streudiagramme. ii. Typische FACS Grundstück ITGA6 Ausdruck in surface Epithel. iii. Ein anderer Vertreter FACS Grundstück von vorn und zur Seite Streuung von Oberflächenepithel zeigt wieder Gating der basalen Zell-Population in grün. iv. Typische ITGA6 und TROP2 Ausdruck Zellpopulation in grün. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitlicher Verlauf der Entwicklung der Sphären. A. Duct Sphären. Spheres sichtbar sein soll in der Matrigel nach ca. 1 Woche in Kultur und fast alle sind im Aussehen dichter. Einzelne Zellen, die nicht zu Kugeln sind ebenfalls zu sehen. (Maßstab = 50 um). B. Basal Kugeln sind größer und luminalen in Erscheinung. Einzelne Zellen, die nicht zu Kugeln sind ebenfalls zu sehen. (Maßstab = 50 um). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" /> Abbildung 4. Injektion von Stammzellen Kanals in die Maus Fettpolster führt zur Bildung von submukosalem Drüse Strukturen. Vertretungsstrukturenwerden in der Fettpolster gezeigt und einige gezeigt Herstellung Mucin (hellblau) mit dem Alcianblau Periodic Acid Schiff Fleck.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Technik zum Kanal und basalen Zellen aus den Atemwegen zu isolieren, ist für ein besseres Verständnis der Atemwege Reparatur und Regeneration und Atemwegserkrankungen wichtig. Die hier beschriebenen Techniken sind ein paar wichtige Schritte. Die erste ist die optimierte enzymatische Verdauung Zeitraum. Die zweite ist die Schaffung eines einheitlichen Zellsuspension durch serielle Passage mit progressiv höhere Gage Nadeln Zelle Scherung zu verhindern, sondern brechen Zellklumpen. Die dritte ist die FACS-Analyse,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Vollmedium 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td></tr><tr><td> Hepes (15 mM) </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat (3,6 mm oder 0,03%) </td><td> Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-Glutamin (4 mM) </td><td> Mediatech </td><td> 25-005-Cl </td></tr><tr><td> Penicillin (100 E / ml) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Streptomycin (100 ug / m) </td><td> Mediatech </td><td> 30-001-CI </td></tr><tr><td> Amphotericin B (0,25 g / ml) </td><td> Lonza </td><td> 17-836R </td></tr><tr><td> InSulin (10 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Transferrin (5 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> T1147 </td></tr><tr><td> Cholera-Toxin (0,1 ug / ml) </td><td> Sigma </td><td> C8052 </td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (25 ng / ml) </td><td> BD </td><td> 354001 </td></tr><tr><td> Rinderhypophysenextrakt (30 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 13028-014 </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum (5%) </td><td> Fischer </td><td> SH3008803HI </td></tr><tr><td> Retinsäure (0,05 pM) </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> Growth Factor Reduced Matrigel </td><td> BD </td><td> 354230 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Füllen Media-Komponenten. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td&gt; <td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 10165921001 </td><td> Gebrauchte bei 0,15%: -O / n bei 4 ° C Verdauung insgesamt trachealen Zellen (ALI Kultur) zu isolieren -4 Hr Verdauung 4 ° C bis zu isolieren SMG </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Gebrauchte bei 16 Einheiten: 30 min bei RT </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> Verwendet bei 0,5 mg / ml: 20-30 min bei RT </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Enzyme für die enzymatische Verdauung der Luftröhre eingesetzt.

isolation of basal cells and submucosal gland duct cells from mouse trachea

Die große Atemwege sind in direktem Kontakt mit der Umwelt und daher anfälliger für Verletzungen von Toxinen und Krankheitserregern, dass wir den Atem in 1. Die großen Atemwege erfordern daher eine effiziente Reparatur-Mechanismus, um unseren Körper zu schützen. Diese Reparatur-Prozess tritt aus Stammzellen in den Atemwegen und Isolierung dieser Stammzellen aus den Atemwegen ist wichtig für das Verständnis der Mechanismen der Reparatur und Regeneration. Es ist auch für das Verständnis abnorme Reparatur, die Atemwegserkrankungen 2 führen kann wichtig. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein neues Stammzellpopulation von den Maus trachealen submucosalem Drüsenkanäle isolieren und diese Zellen in vitro und in vivo Modellsystem zu platzieren, um die Mechanismen der Reparatur und Regeneration der submucosalen Drüsen 3 zu identifizieren. Diese Produktion zeigt Methoden, die zur Isolierung und Test der Kanal-und basalen Stammzellen aus dem großen Atemwege 3 werden kann. Dies wird uns erlaubenzu Erkrankungen der Atemwege, wie zystischer Fibrose, Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung studieren. Derzeit gibt es keine Verfahren zur Isolierung von submucosalem Drüse Gangzellen und keine in vivo-Modellen, um die Regeneration des submucosalen Drüsen studieren.

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Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Hier zeigen wir unser Protokoll zur Isolierung von basalen und submuköse Drüsen Gangzellen von Maus Luftröhre. Darüber hinaus zeigt das Verfahren zum Einspritzen von Stammzellen in die dorsale Maus Fettkörper ein erstellen<em&gt; In vivo</em&gt; Modell der submukösen Drüsen Regeneration.

Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Aufrufe.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Hier zeigen wir unser Protokoll zur Isolierung von basalen und submuköse Drüsen Gangzellen von Maus Luftröhre. Darüber hinaus zeigt das Verfahren zum Einspritzen von Stammzellen in die dorsale Maus Fettkörper ein erstellen In vivo Modell der submukösen Drüsen Regeneration.

Serie: Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Forschung

Biologie

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...