Dieses Protokoll beschreibt einen Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozess und einen mathematischen Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung des Übersprechens der fluoreszierenden Proteine und der relativen Emissions- und Detektionseffizienz der Fluorophore im mikroskopischen Aufbau. Crosstalk kann durch bildgebende Zellen beurteilt werden, die nur ein Fluorophor exprimieren.
Die Beurteilung der Detektionseffizienz eines Donor- oder Akzeptormoleküls erfordert die Kenntnis des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die das Messsignal erzeugen. Die Anzahl der Fluorophore, die in lebenden Zellen exprimiert werden, variiert von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Die bei dieser Methode verwendete Kalibriersonde, ein Eins-zu-Eins-Donor-Akzeptor-Fusionsprotein, ermöglicht es, die relative Detektionseffizienz von Donor- und Akzeptormolekülen zu bestimmen.
Verwenden Sie zunächst einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor mit mCherry 1 zur Erzeugung der EGFP mCherry 1-Fusionssonde. Entwerfen Sie Oligonukleotide zur Amplifikation von EGFP ohne Stoppcodon als Zelle eines BAM-h1-Fragments. Der Fünf-Aminosäure-Linker zwischen dem grün und rot fluoreszierenden Protein sollte einen mittleren FRET-Mangel für das GFP-Kirsch-Donor-Akzeptor-Paar von 0,25 bis 0,3 ergeben.
Verwenden Sie jede Zelllinie und jedes Medium ohne Phenolrot, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, trennen Sie sie mit einem Milliliter 0,05 % Trypsin EDTA und säen Sie etwa 10.000 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit acht Vertiefungen, indem Sie drei Tropfen aus einer Fünf-Milliliter-Zellsuspension hinzufügen. Transfizieren Sie die Zellen 24 Stunden nach der Beschichtung mit einem geeigneten Transfektionsmedium.
Inkubieren Sie die Zellen 20 Stunden lang, bevor Sie lebende Zellen bilden, um eine ordnungsgemäße Expression des fluoreszierenden Proteins, eine Faltung und Reifung zu ermöglichen. Stellen Sie die Zellen in einer befeuchteten und beheizten Klimakammer bei 37 Grad Celsius mit einem konfokalen Rastermikroskop dar. Um das Zellmedium bei physiologischem pH-Wert zu puffern, fügen Sie 20 millimolare HEPES hinzu, um das Zellmedium kohlendioxidunabhängig zu machen.
Montieren Sie dann den Objektträger auf dem Mikroskop. Verwenden Sie die 488-Nanometer-Linie des Argon-Ionenlasers, um das GFP anzuregen, und den 561-Nanometer-Diodenlaser, um Kirsche anzuregen. Richten Sie den 488-Nanometer-Laser für die Anregung in Kanal eins durch ein Emissionsband von 505 bis 530 Nanometern und in Kanal zwei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern ein.
Verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser zur Anregung in Kanal drei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern. Anregen Sie die beiden Laser nacheinander an und stellen Sie den Bildgebungsmodus so ein, dass nach jeder Zeile umgeschaltet wird, sodass sich die Anregung des 512 x 512 Pixel großen Bildes nach jeder Zeile abwechselt. Richten Sie eine Mini-Zeitreihe mit drei Bildern ein, um zu erkennen, ob ein signifikantes Photobleaching auftritt, und reduzieren Sie gegebenenfalls die Laserleistung.
Erstens, Bildzellen, die das GFP-Kirschfusionskonstrukt exprimieren. Legen Sie die Parameter fest, die die zeitintegrierte Laserintensität pro Pixel in einem konfokalen Bild definieren. Verwenden Sie ein 63-faches Ölobjektiv und einen auf 3-fach eingestellten Zoom, um eine Zelle in ihrer Gesamtheit mit ausreichender Vergrößerung und Auflösung abzubilden.
Streben Sie eine Pixelgröße von 70 bis 80 Nanometern an. Stellen Sie die Pixelverweilzeit auf zwei bis vier Mikrosekunden und die AOTF-Übertragung für den 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Laser ein, so dass die Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Bleichen und keine Pixel zeigen, die eine Sättigung der Fluoreszenzintensität anzeigen. Stellen Sie die Laserleistung von 488 und 561 so ein, dass die Signalpegel in Kanal eins und Kanal drei ähnlich sind.
Stellen Sie die Verstärkung des Fotomultiplikators auf 600 bis 800 ein. Abbildung 15 bis 20 Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, Zellen, die GFP, Kirsche, GFP und Kirsche exprimieren, und nicht durchtrennte Zellen. Dann bilden Sie Zellen ab, die die interessierenden Proteine koexprimieren, die an GFP bzw. Kirsche gekoppelt sind.
Um FRET zu berechnen, messen Sie das Donorsignal in Kanal eins, dem Donorkanal mit 488 Nanometern Anregung und einer Emissionsbande von 505 bis 530 Nanometern. Messen Sie dann das Akzeptorsignal in Kanal drei, dem Akzeptorkanal mit 561 Nanometer Anregung und Emission bei über 585 Nanometern. Messen Sie schließlich das FRET-Signal in Kanal zwei, dem Übertragungskanal mit 488 Nanometern Anregung und Emission bei über 585 Nanometern.
Das Signal in Kanal zwei ist eine Summe aus vier verschiedenen Komponenten: dem spektralen Spillover vom gelöschten Donorsignal in den über 585 Detektionskanal mit einem Übersprechfaktor S1, dem Akzeptorsignal aus direkter Anregung durch 488 Nanometerlicht mit einem Übersprechfaktor S2, der sensibilisierten Emission des Akzeptors durch FRET aus dem angeregten Donormolekül, und das Hintergrundsignal. Es wurden Bilder im Spenderkanal, im Transferkanal und im Akzeptorkanal erhalten, wobei Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche, GFP und Kirsche co-exprimieren, und das GFP-Kirschfusionsprotein gezeigt werden. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, und solche, die GFP-Kirschen co-exprimieren, werden im Vergleich zum Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, dem Intensitätsverhältnis oder dem molekularen Verhältnis in jeder Zelle aufgetragen.
Pixel-für-Pixel-FRET-Bilder von Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, GFP und Kirsche als Negativkontrolle co-exprimieren und Rezeptoruntereinheiten des Ashwell-Morell-Rezeptors exprimieren, sind hier zu sehen. RHL1 und 2 des Leberlektins der Ratte wurden mit GFP und Kirsche auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran markiert. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade von Zellen, die GFP RHL1 und Cherry RHL2 exprimieren, und GFP RHL1 Delta Stock und Cherry RHL2 werden im Vergleich zum Molekülverhältnis von Akzeptor zu Spender aufgetragen.
Der vorgestellte quantitative FRET-Ansatz ermöglicht Folgendes. Nachweis von Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle. Veränderungen der Proteininteraktionen im Laufe der Zeit.
Unterschiede in den Wechselwirkungen in subzellulären Kompartimenten bis hinunter zur Pixel-für-Pixel-Ebene eines konfokalen Bildes. Und die Abhängigkeit des detektierten FRET-Signals vom molekularen Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, das in einer lebenden Zelle exprimiert wird.
