Finanzierung: US Army Medical Research &amp; Materiel Command (USAMRMC) und von der Telemedizin &amp; Advanced Technology Research Center verwaltet. Shunxi Ji trug die Änderung der Spritzen, wie hier beschrieben.

1. System Set-up Das System besteht aus einer Halte-und Konzentrationstank (HCT) mit einem Einzelstufen-Mischer, einem In-line-Homogenisator mit hoher Scherkraft, einer Walzenpumpe, um Fluid zwischen der HCT und dem Homogenisator zu bewegen, und einen Wärmetauscher (1) angebracht ist. <ol><li> Legen Sie ein sterilisiert, Weithals 4 l Glassammlung mit 2 Basisanschlüsse und 3 Seitenöffnungen unterhalb der einstufigen Mischgefäß montiert. Senken Sie den Mischkopf bis zur Mündung des Schiffes und sorgen für eine gasdichte Montage mit Gummidichtungen oder Band (um Umgebungsluft verunreinigen den Kopfraum zu verhindern). </li><li> Setzen Sie einen der Basisanschlüsse (Abbildung 1, Port 1) der HCT mit steriler 3/8 &quot;(ID) klare Schlauch, ca. 10&quot; lang, mit einem 3-Wege-Hahn an der Spitze für die Sammlung der konzentrierten Emulsion versehen . </li><li> Setzen Sie den zweiten Basishafen (Abbildung 1, Port # 2) mit steriler 3/8 &quot;(ID) Schläuche, approximately 36 &quot;in der Länge. Ziehen Sie diese Schläuche durch eine Rollenpumpe. Setzen Sie den Eingang der Hochscher Homogenisator mit einem T-Stück mit zwei Ports und wie folgt anschließen: Verbinden Schlauch von Port # 2, durch die Rollenpumpe und eine Verbindung zu der Seite Port der T-Stück. Befestigen Sie den anderen Anschluss an ein Sauerstofftank mit einem Low-Flow-Sauerstoff-Gasdurchflussmesser. </li><li> Verbinden der Auslassöffnung des Homogenisators mit hoher Scherkraft mit der Einlassöffnung einer in-line-Wärmetauscher bei 4 ° C gehalten, Verbinden den Auslaß des Wärmetauschers zu dem Rücklaufanschluß des HCT (Fig. 1, Port Nr. 3), wodurch ein geschlossenes Schleifensystem. </li><li> Befestigen eines Sauerstofftank (über einen Durchflussmesser) an den HCT (Fig. 1, Port # 4). Bringen Sie einen Monitor, der Gaszusammensetzung der Atmosphäre offen in die obere Öffnung des HCT (Abbildung 1, Port # 5) ist. </li><li> Wenn Sterilität gewünscht wird, sterilisieren die Glas-und Metallkomponenten vor jeder Verwendung von Autoklaven. Sterilisieren Sie die Rohrkomponenten und Kunststoff Connectors von Ethylenoxid vor jeder Verwendung. Dies ist besonders wichtig, wenn das Produkt in vivo getestet werden. </li></ol> 2. LOM Herstellung <ol><li> Platzieren von 20 g GMP 1,2-Distearyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 10 g Cholesterin in der Basis des HCT. 1 l Plasma-Lyte A zu der HCT und Hand Rühren für 1 min, zu integrieren, so viel wie möglich in die Lipid wässrigen Phase. </li><li> Senken Sie den einstufigen Mischer in die wässrige Phase, so dass die gesamte Mischkopf wird von der wässrigen Phase bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des HCT ist gasdicht (siehe Schritt 1.1) und dass es keine offenen Seite Ports. Schalten Sie die Gasquelle an Port # 4 befestigt und warten, bis der Sauerstoffanteil der HCT Headspace erreicht&gt; 95%. Bei 10 L / min (LPM), sollte diese nehmen ~ 10 min. </li><li> Mit dem einstufigen Mixer, mischen Sie die Ausgangsemulsion für 5 min bei 5.000 Umdrehungen pro Minute. Die resultierende Mischung sollte blass weiß erscheinen und enthalten keine sichtbaren lipid Klumpen. Einmal gemischt, kann ungenutzt Lipid-Wasser-Mischung bei 4 º C für bis zu 30 Tage vor einmaligen Gebrauch gespeichert werden. </li><li> Prime das gesamte System mit geschlossener Schleife mit der Vorstufen-Emulsion, indem der Rollenpumpe bei 1,3 LPM. Sobald das System grundiert, halten Sie die Pumpe auf 1,3 LPM. </li><li> Zur Herstellung der LOMs beginnen, schalten Sie die In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu 7.500 Umdrehungen pro Minute. Unmittelbar danach schalten Sauerstofffluss zu dem Einlassabschnitt der Homogenisator bei 0,5 LPM. Halten Sie die stufigen Mixer-Single (in der HCT) auf 3.500 Umdrehungen pro Minute. LOMs sind an der Schnittstelle der Rotorschaufeln und den Emulsor Abschirmung innerhalb des in-line-Homogenisator (Fig. 2) ausgebildet. Innerhalb weniger Minuten sollte Flüssigkeit sichtbar mehr viskos werden. Ein strengerer Ansatz ist, um die Viskosität als Funktion der Zeit, die durch Entfernen von Aliquoten aus Port 1 während der Herstellung und Analyse mit einem Viskosimeter durchgeführt werden können, zu bestimmen. Hinweis: Bei sichtbaren Luftblasen im Schlauch Verlassen des Mischers, Sauerstoff vorhanden sindfließen, um die in-line-Homogenisator ist zu hoch. Titriert Gasstrom nach unten, bis die Flüssigkeit ist undurchsichtig und enthält keine sichtbaren Gasblasen. </li><li> Führen Sie das System für 15 Minuten, und schalten Sie dann den hohen Scher Homogenisator und der Sauerstoffeingang zu. Fahren Sie mit dem einstufigen Mischer in der HCT laufen, bis die Emulsion entfernt wird; Dies mildert Phasentrennung und hält das Produkt im HCT relativ einheitlich. Hinweis: Das Volumen des gasgefüllten Emulsion sollte ca. 2-3x in der Serienphase Konzentration zu erhöhen. Wenn es nicht, zu überprüfen, um sicherzustellen, daß Sauerstoff in den Homogenisator mit hoher Scher fließt und dass Lipid-Konzentrationen in der Ausgangsemulsion korrekt sind. Effizienz der Produktion nimmt mit Lipid-Konzentration abnimmt. </li></ol> 3. Sammlung, Konzentration, Bewertung, Lagerung von LOMs <ol><li> Bringen Sie eine sterile, modifizierte 140 ml Luer-Lock-Spritze, um den Hahn zu Basis-Port # 1 auf dem Sammelgefäß angebracht. Zeichnen bis 100 ml Flüssigkeit. Verschließe Spritze und Wiederholen, bis alle Flüssigkeit entfernt wurde. <ol><li> Ändern Spritzen durch Entnahme von 100 ml Luft in die Spritze und dann sägen Sie das überschüssige Kolben und Spritzenmaterial über der 140-ml-Marke. Füllen und leere Spritzen mit Zahnzangen für die Erstellung des Kolbens. Diese Modifikation ermöglicht eine einfachere Zentrifugieren. </li></ol></li><li> Centrifuge Spritzen mit der bedeckten Ende nach unten in einem gekühlten (4 º C) Becherzentrifuge bei 225 g für 10 min ausgerichtet. </li><li> Drei Schichten von Material nach dem Zentrifugieren erscheinen. Vertreibt die untere Schicht der Über bewölkt wässrige Phase und entsorgen. Die zweite Schicht ist hell weiß und enthält konzentrierte LOMs. Übertragen konzentrierter Schaum zu einer gasundurchlässigen Spritze mit einem Drei-Wege-Hahn auf Umgebungsgaskontamination zu vermeiden. Entsorgen Sie die letzte Schicht, die freie Sauerstoffgas aus geplatzten LOMs enthält. </li><li> Schaumqualität kann durch das Erreichen ≥ 90% Gas konzentrierter Schaum beurteilt werden. Calculaß Gaskonzentration, wie folgt: Volume% Gas = [(Foam Gewicht / Volumen-Schaum) - 1] x 100 <ol><li> Als zweite Qualitätskontrolle, der Größe von Mikrobläschen Lichttrübung festzustellen, ob Partikelgröße innerhalb des erwarteten Bereichs. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Änderung in der Zeit der Homogenisierung oder Formulierung kann die Blasengröße zu verändern. </li></ol></li><li> Verschließe das Glasspritze mit Luer-Lock-Montage. Konzentrierte LOMs mit Plasma-Lyte A zum Zeitpunkt der Verwendung verdünnt werden. Spritzen bei 22, 4 gespeichert werden, oder -20 º C; kälteren Temperaturen kann eine verbesserte Lagerstabilität 7. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaled-Up+Production+of+Monodisperse,+Dual+Layer+Microbubbles+Using+Multi-Array+Microfluidic+Module+for+Medical+Imaging+and+Drug+Delivery.">Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).</li><li>Szijjarto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Perfluorocarbon+Gases+on+the+Size+and+Stability+Characteristics+of+Phospholipid-Coated+Microbubbles:+Osmotic+Effect+versus+Interfacial+Film+Stabilization.">Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization.</a> Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).</li><li>Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid-Stabilized+Microbubble+Foam+for+Injectable+Oxygen+Delivery.">Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery.</a> Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).</li><li>Kv&#229;le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+fractionation+of+gas-filled+microspheres+by+flotation.">Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation.</a> Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).</li><li>Dressaire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfacial+polygonal+nanopatterning+of+stable+microbubbles.">Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles.</a> Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).</li><li>Kheir, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+Manufacture+of+Concentrated+Oxygen+Gas-Filled+Microparticles+for+Intravenous+Oxygen+Delivery.">Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. , (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die wichtigsten Schritte zur Schaffung konzentrierte, hoch sauerstoffhaltigen LOMs gehören: 1) sicherzustellen, dass der Kopfraum in der HCT bleibt voll mit Sauerstoff angereichert; 2) sicherstellen, dass die Reinheit der Lipidträger optimal ist (einschließlich Lagerbedingungen und Verwendung von GMP-Produkte); 3) die Gewährleistung, dass die pulverförmigen Lipiden mischen vollständig mit der wässrigen Phase vor, um die System Grundierung; und 4) aufmerksam auf die Erhöhung der Gasfraktion im HCT zu gewährleist...

Mikrobläschen von Protein-, Polymer-und Lipidschalen zusammengesetzt sind als Vektoren für die Arzneimittelabgabe, Gentherapie, und Ultraschall-Kontrastmitteln 1-5 entwickelt. Da diese therapeutische Anwendungen erfordern intravaskulären Mikroblasen-Persistenz, werden solche Mikroblasen häufig mit inerten, molekulare Gase hoch wie perfluorierte Kohlenwasserstoffe 6, die geringe Löslichkeit im Blut haben und Stabilisierung der Blase 3,4 gefüllt. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um therapeutische Dosen von Sauerstoff, der Endorgane Sauerstoffversorgung zu erhalten und hämodynamische Instabilität in Zeiten der Obstruktion der Atemwege oder Hypoxämie 7 verhindern können, zu liefern. Emulsionen zur intravenösen Gaszufuhr ausgelegt erfordern unterschiedliche Design-Merkmale als die für Ultraschallkontrastmittel oder gezielten Verabreichung von Medikamenten verwendet. Erstens, weil der Körper verbraucht große Mengen an Sauerstoffgas (~ 200 ml / min), ist LOMs erzeugt werden undim großen Maßstab injiziert. Dies erfordert, dass der Herstellungsprozess effizient. Zweitens sollte das Herstellungsverfahren mit geschlossener Schleife, um Stickstoffverunreinigung durch die Belichtung LOMs (die mit 100% Sauerstoff gefüllt werden soll) zu vermeiden, um die Umgebungsluft sein. Drittens, da der Zweck LOMs intravenös Gaszufuhr sollte der Gasanteil LOMs maximiert werden, wobei die Einschränkungen, die durch Emulsionsviskosität 7 auferlegt. Schließlich, wie bei jedem intravenös injizierbare ist eine genaue Kontrolle über die Partikelgrößenverteilung wesentlich zur Vermeidung mikrovaskuläre Obstruktion 8. Es gibt mehrere etablierte Methoden für die Herstellung von Mikrobläschen. Beschallung hoher Intensität verwendet, um die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche einer Emulsion, die ein Tensid, wie ein amphipathisches Phospholipid in Gegenwart eines Gasraum auf 7,9 Mikrobläschen erzeugen beinhaltet aufgebracht niederfrequenten Ultraschall. Dieses Verfahren ist durch Variieren UltraSchallfrequenz, Leistung und Impulsdauer, und die resultierende Größenverteilung hergestellt werden, um Mikrobläschen aus einem bestimmten Größenverteilung zu erzeugen, wenn der Beschallung nur selten bei der Herstellung von klinisch verwendeten Mikrobläschen verwendet werden. Verschmelzung ist die intensive mechanische Bewegung eines Tensids und Gas in einem geschlossenen System, das auch schwierig zu skalieren, um große Mengen 2 aufzunehmen. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik ermöglicht die präzise Steuerung der Mikroblasengrößenverteilung 10-13. Obwohl traditionell schwierig zu skalieren, Multi-Channel-, High-Speed-Mikrofluidik beschrieben worden, die Effizienz in der Produktion von Mikrobläschen 13 zu erhöhen. Mikrobläschen mit einer dieser Methoden hergestellt wurden, können nach der Herstellung Zerkleinerungsprozesse, wie Zentrifugalfraktionierung 14,15 und Mikroblasen-Flotation 16,17 erforderlich. Eine weitere etablierte Methode für die Herstellung von hochstabilen Mikrobläschen Scher homogenization 6, die in einem Stabilisierungs Phospholipid hexagonalen Muster auf der Mikroblasenoberfläche 18 führen kann. Aufbauend auf diesem Konzept beschreiben wir den Einbau eines In-Line-Homogenisator mit hoher Scher zu selbstorganisierenden LOMs 19 erstellen. In diesem Prozess nutzt der Homogenisator schnell rotierenden Klingen in unmittelbarer Nähe zu Dual feinmaschigen Emulsor Bildschirme, wodurch hohe mechanische und hydraulische Schere für die Schaffung von Mikrobläschen. Serien Konzentration der Lipidemulsion durch dieses System liefert eine zunehmend konzentrierte Gasfraktion, die noch weiter durch Zentrifugation konzentriert werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:405px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770365</td>
			<td>Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C75209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plasma-Lyte A</td>
			<td style="width:141px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">80089-818</td>
			<td>Alternatively can use NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Glass collection vessel</td>
			<td style="width:141px;">Specialty Glass, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gas composition (oxygen) monitor</td>
			<td style="width:141px;">Precision Medical</td>
			<td style="width:119px;">PM5900L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sarns 8000 roller pump</td>
			<td style="width:141px;">Calicut Medical</td>
			<td style="width:119px;">16407</td>
			<td>Part of a modular perfusion system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">BIOtherm Heat Exchanger</td>
			<td style="width:141px;">Medtronic</td>
			<td style="width:119px;">ECMOtherm-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Verso laboratory in-line mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">TH-IL-102-VERSO</td>
			<td>Use multistage workheads and front-end extension with T piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">T-piece for Silverson Verso inlet port</td>
			<td style="width:141px;">Process Innovations</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">L5M-A laboratory mixer</td>
			<td style="width:141px;">Silverson Machines, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NC0136483</td>
			<td>Use mesh emulsor screen (fine)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Rochester-Ochsner toothed forceps</td>
			<td style="width:141px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-812-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">140 mL syringe</td>
			<td style="width:141px;">Kendall Healthcare Monoject&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8881114030</td>
			<td>Ensure there is a luer lock.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IX71 Inverted light microscope</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Retiga-2000R microscope camera</td>
			<td style="width:141px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;">RET-2000R-F-M-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Accusizer 780A Autodilution</td>
			<td style="width:141px;">PSS-NICOMP Particle Sizing Systems</td>
			<td style="width:119px;">Out of production</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manufacture of concentrated, lipid-based oxygen microbubble emulsions by high shear homogenization and serial concentration

Gasgefüllte Mikrobläschen haben als Ultraschallkontrast und Drug-Delivery-Agenten entwickelt. Mikrobläschen können durch Verarbeiten Tenside mit Beschallung, mechanischer Agitation, mikrofluidischen Vorrichtungen oder Homogenisierung hergestellt werden. Kürzlich, Lipid-basierten Sauerstoff-Mikrobläschen (LOMs) wurden entwickelt, um Sauerstoff während der medizinischen Notfällen intravenös zu liefern, Rückfahrlebensbedrohlichen Hypoxämie und verhindert spätere Organschäden, Herzstillstand und Tod. Wir stellen Methoden für die vergrösserte Produktion von stark mit Sauerstoff-Mikrobläschen mit einem Closed-Loop-High-Shear Homogenisator. Das Verfahren kann 2 l konzentrierter LOMs (90 Vol.%) in 90 min zu erzeugen. Resultierende Blasen einen durchschnittlichen Durchmesser von ~ 2 um, und eine rheologische Profil in Übereinstimmung mit der von Blut, wenn sie 60 Vol.% verdünnt. Diese Technik erzeugt LOMs in hoher Kapazität und hoher Sauerstoffreinheit, was darauf hindeutet, dass diese Technik kann für die translationale Forschungslabors sein.

Hohe Scher Homogenisierung ermöglicht die effiziente (dh innerhalb eines Nachmittags) die Produktion von ausreichend LOMs für eine Tierstudie und nicht technisches Know-how erfordern. Sobald beherrschen, bis 2 l konzentrierter LOMs in 90 min hergestellt werden. Mikroblasen-Größe und Morphologie wurde durch Lichtmikroskopie und durch Lichttrübung bewertet. Wenn ein 10 &amp;mgr; l-Probe von LOMs visualisiert wurde, wurden kugelförmige LOMs erwähnt, sowie eine relativ geringe Me...

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Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Wir beschreiben Methoden zur Herstellung großer Mengen von Lipid-basierten Sauerstoffmikrobläschen (LOMs) zur intravenösen Sauerstoffzufuhr ausgebildet mit hoher Scherung homogenisiert und serielle Konzentration.

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

manufacture-concentrated-lipid-based-oxygen-microbubble-emulsions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Aufrufe.  Harvard Medical School.  Wir beschreiben Methoden zur Herstellung großer Mengen von Lipid-basierten Sauerstoffmikrobläschen (LOMs) zur intravenösen Sauerstoffzufuhr ausgebildet mit hoher Scherung homogenisiert und serielle Konzentration. 

Serie: Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid microbubble contrast agents7-9. In mice these vector-carrying microbubbles can be administered intravenously or directly to the left ventricle of the heart. In larger animals they can also be infused through an intracoronary catheter. The subsequent delivery from the circulation to a target organ occurs by acoustic cavitation at a resonant frequency of the microbubbles. It seems likely that the mechanical energy generated by the microbubble destruction results in transient pore formation in or between the endothelial cells of the microvasculature of the targeted region10. As a result of this sonoporation effect, the transfection efficiency into and across the endothelial cells is enhanced, and transgene-encoding vectors are deposited into the surrounding tissue. Plasmid DNA remaining in the circulation is rapidly degraded by nucleases in the blood, which further reduces the likelihood of delivery to non-sonicated tissues and leads to highly specific target-organ transfection.

Ultrasound Targeted Microbubble Destruction (UTMD) can be used to direct site-specific delivery of bioactive molecules, including therapeutic genes, to target organs accessible to ultrasound, such as the heart and liver1-6.

Einführung in die Ultraschall-gezielte Mikroblasen Zerstörung Technik

In UTMD, bioactive molecules, such as negatively charged plasmid DNA vectors encoding a gene of interest, are added to the cationic shells of lipid ...

Forschung

Biotechnik

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

Merkmale der Niederschlag gebildet Polyethylene Glycol-Mikrogele durch Molekulargewicht der Reaktanden Controlled

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to nanomolar ranges, several orders of magnitude less than many physiological ligand concentrations. Optical nanostructures called zero mode waveguides (ZMWs), which are 100&#8722;200 nm in diameter apertures fabricated in a thin conducting metal such as aluminum or gold, allow imaging of individual molecules at micromolar concentrations of fluorophores by confining visible light excitation to zeptoliter effective volumes. However, the need for expensive and specialized nanofabrication equipment has precluded the widespread use of ZMWs. Typically, nanostructures such as ZMWs are obtained by direct writing using electron beam lithography, which is sequential and slow. Here, colloidal, or nanosphere, lithography is used as an alternative strategy to create nanometer-scale masks for waveguide fabrication. This report describes the approach in detail, with practical considerations for each phase. The method allows thousands of aluminum or gold ZMWs to be made in parallel, with final waveguide diameters and depths of 100&#8722;200 nm. Only common lab equipment and a thermal evaporator for metal deposition are required. By making ZMWs more accessible to the biochemical community, this method can facilitate the study of molecular processes at cellular concentrations and rates.

Described here is a nanosphere lithography method for parallel fabrication of zero mode waveguides, which are arrays of nanoapertures in a metal-clad glass microscopy coverslip for single molecule imaging at nano- to micromolar concentrations of fluorophores. The method takes advantage of colloidal crystal self-assembly to create a waveguide template.

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...