Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung von organgechipten mikrofluidischen Geräten zur Rekapitulation der Funktionalität auf Organebene in vitro zu beschreiben. Dieses Protokoll beschreibt eine Möglichkeit, Organ-Chip-Geräte herzustellen, die die Funktion auf Organebene in vitro rekapitulieren. Die Func, die Geräte, wie diese, werden tatsächlich mit 3D-gedruckten Formen aus einem weichen Siliziumgummi hergestellt.
Dieser Gummi ermöglicht es uns, diese Geräte tatsächlich mit mechanischen Hinweisen zu durchdringen, die es uns ermöglichen, das Gewebe so zu dehnen, wie man es in eine Lunge oder einen Darm hineinbekommen würde. Wir fügen auch Überfluss hinzu, die den Blutfluss und den Fluss anderer Körperflüssigkeiten innerhalb von Organsystemen imitiert. Zusammengenommen ermöglichen uns diese Geräte, die komplexe Physiologie, die in vivo geschieht, tatsächlich nachzubilden und zu verstehen.
Aber tun Sie dies in vitro. Im Wesentlichen experimentieren wir also mit Menschen, aber nicht mit Menschen. Und so ist es ein sehr effektiver Weg, um die Kluft zwischen Tierstudien zu überbrücken, die immer in der präklinischen Entwicklung von Therapeutika durchgeführt werden, und dann vor Studien am Menschen, die klinische Studien genannt werden, wo es ein viel größeres Risiko für den Menschen, für die menschliche Sicherheit gibt.
Und so helfen diese Geräte, die Kluft zu überbrücken und ermöglichen es uns tatsächlich, neue Therapeutika zu entwickeln und die grundlegende Biologie zu verstehen, die tatsächlich in komplexen Systemen wie dem Menschen geschieht. Top-Channel-Vorbereitung. Wischen Sie die glänzende Seite jedes Polyurethanstücks mit Ethanol und Reinraumtüchern ab.
Legen Sie glänzende Seite des Polyurethans über die offene Seite der Form an Ort und Stelle Form. Legen Sie die Form und Polyurethan-Baugruppen in die Vorrichtung, strukturierte Seite gegen das Ende der Vorrichtung. Fahren Sie damit fort, bis alle Formen in der Vorrichtung platziert wurden.
Ziehen Sie die Vorrichtung fest, indem Sie ihren Griff mit einem Schraubenschlüssel drehen, bis der Jig-Abstand 25 Millimeter breit ist. Machen Sie ein Boot aus Aluminiumfolie um die Form an Ort und Stelle Jig. Gießen Sie PDMS in den Brunnen jeder Form, bis sie voll ist.
Sobald die gesamte Vorrichtung gefüllt ist, legen Sie das Jig in den Vakuum-Austrocknungsor. Nach einer Stunde aus dem Trockenmittel entfernen. Und legen Sie in 60 Grad Centigrade Ofen für mindestens vier Stunden.
Zerlegen Sie die Vorrichtung mit einem Schraubenschlüssel. Entfernen Sie die Polyurethan-Streifen aus jeder Form. Und entsorgen.
Sorgfältig entnichtbarpdpdteile PDMS-Teile von ihren Formen und legen sie seitlich nach oben. Richten Sie die Klinge des Fliesenschabers an der Endlasche Kerbe ein. Und schneiden Sie jedes Ende, um die oberen Komponenten zu cingulate.
Fertigteile in quadratischen Petrischalen lagern. Teile in Positivdruckschränken bei Raumtemperatur lagern. Bodenkanalvorbereitung.
Gießen Sie 10,5 Gramm PDMS in die Form. Die Luftpistole kann sehr sanft verwendet werden, um das PDMS über den Raum zu bewegen. Legen Sie Formen in Vakuum-Austrocknungsgerät.
Nach einer Stunde, bewegen Sie die Formen auf eine Ebene 60 Grad Centigrade Ofen. Legen Sie Schimmel auf den Tisch in einer laminaren Durchflusshaube. Lösen Sie das PDMS vom Rand der Form.
Greifen Sie eine Ecke und schälen Sie das PDMS vorsichtig von der Oberfläche der Form zurück. Wenn sie vollständig entfernt sind, invertieren und legen Sie sie auf der Arbeitsfläche, sodass Kanal-Features aufgedeckt werden. Schneiden Sie entlang der Außenkanten mit Fliesenschneider.
Mit flachen Paddelzangen, Legen Teile verfügen seitlich auf Band, um Schmutz zu entfernen. Entfernen Sie das Teil vom Verpackungsband. Ziehen Sie das lose Ende des Teils über die Folie.
Das lose Ende laminiert mit dem Glas. Cover-Features mit Scotch Tape. Teile in Positivdruckschränken bei Raumtemperatur lagern.
PDMS-Membranvorbereitung. Überprüfen Sie, ob die Wafer auf der Rückseite frei von PDMS sind. Legen Sie jeden Membranwafer in die dafür vorgesehenen Schlitze.
Verwenden Sie die eine ml Spritze, um 09 ml PDMS in die Mitte jedes Membranwafer-Post-Arrays zu platzieren. Lassen Sie das PDMS mindestens fünf Minuten sitzen. Lassen Sie PDMS über den Pfosten des Membranwafers ausbreiten.
Fahren Sie erst mit dem nächsten Schritt fort, wenn mindestens 75 % des Post-Arrays in PDMS abgedeckt sind. Plasma behandelt den Polycarbonatstreifen unter Verwendung der im Protokoll beschriebenen Bedingungen. Entfernen Sie Polycarbonatbleche aus der Plasmamaschine und schneiden Sie die Polycarbonatplatten mit einer Schere in 45 mal 45 Millimeter Quadrate.
Legen Sie die plasmabehandelte Seite der Polycarbonatquadrate auf das PDMS, zentriert auf den Membranwafer. Platzieren Sie PDMS-Abstandser in der Mitte des Polycarbonatquadrats. Legen Sie dann vorgeschnittenes strukturiertes Polycarbonat ein.
Legen Sie Schalen ein, so dass sich Fach drei im hinteren, das Fach zwei in der Mitte und das Fach eins in der Vorderseite befindet. Fach eins hat eine Kerbe für die Ausrichtung. Öffnen Sie das Ausgangsdruckventil und öffnen Sie sehr langsam das Eingangsdruckventil.
Dies ist so, dass die vier Kilogramm Kraft nach und nach auf jeden Membranwafer aufgetragen werden, im Gegensatz zu sofort, die die Wafer brechen kann. Drehen Sie den AMF-Schalter auf, um den Aushärtungszyklus zu beginnen. Schließen Sie dann das Eingangsdruckventil und öffnen Sie die Ausgangsdruckventile, um den Druck aus den Luftzylindern zu lösen.
Entfernen Sie die Schalen und bringen Sie sie auf die laminare Durchflusshaube. Das strukturierte Polycarbonat vorsichtig abziehen. Entfernen Sie vorsichtig den PDMS-Abstandsabstand.
Prüfen Sie die PDMS-Membran auf Bereiche mit Durchgangslöchern. Verwenden Sie einen Marker, um die Umrisse des Durchgangslochbereichs nachzuverfolgen. Markieren Sie auch löcher oder defekte Anmembranen.
Dies ist ein Beispiel für eine nicht markierte und markierte Membran. Mit Wafer Handling Pinzette, lösen Wafer aus dem Tablett. Entfernen Sie jede Membran aus dem Wafer und legen Sie sie auf petrischale.
Die PDMS-Membran wird aus dem Wafer abgedagelten und mit dem Polycarbonat-Träger verbunden werden. Teile in Positivdruckschränken bei Raumtemperatur lagern. Top Montage und Vorbereitung.
Reinigen Sie mit matt veredeltem Scotch Tape die PDMS-Membranen sowie die Innenseite der Petrischale, um Schmutz zu entfernen. Verkleben Sie gründlich die Funktionsseite jedes hohen Kanaloberteils, um Schmutz zu entfernen. Legen Sie Die Oberteile in Petrischale mit PDMS-Membran.
Beachten Sie, dass einige Membranen ein oder zwei obere Teile nehmen können. Die Hauptkanäle jedes Oberteils sollten in den markierten Bereich innerhalb der Membran passen. Die Petrischalen ins Plasma laden.
Plasma behandeln Membran und Top nach dem schriftlichen Protokoll. Sobald der Klebezyklus abgeschlossen ist, entfernen Sie die Schalen und legen Sie die aktivierten Oberteile auf die Membran. In 60 Grad Centigrade Ofen für mindestens zwei Stunden.
Mit einem Skalpell, verfolgen Sie um den Umfang der gebundenen Spitze, um es von der Polycarbonat-Träger zu trennen. Sobald das Teil zurückverfolgt ist, schälen Sie die Oberseite aus dem Polycarbonat. Die PDMS-Membran, die sich an der Oberseite verklebt hat, sollte ebenfalls vom Träger abziehen.
Mit einer Pinzette wird die Membran von den Anschlüssen entfernt, die auf den unteren Kanal zugreifen. Lassen Sie keine Teile der Membran, die den Zugangsanschluss abdecken. Entfernen Sie zusätzlich Schmutz oder Staub mit einer Pinzette.
Chip-Montage. Feature-Seite nach oben, Plasma behandeln obere Baugruppen mit Böden. Richten Sie unter einem invertierten Mikroskop die obere Baugruppe mit der unteren Hälfte aus.
In 60 Grad Centigrade Ofen für mindestens zwei Stunden. Ergebnisse. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die skalierbare Herstellung von PDMS-Organchips. Diese Geräte ermöglichen die Kultur zweier unterschiedlicher Gewebetypen auf einer elastischen porösen Membran.
Die PDMS-Kanäle werden mit 3D-gedruckten Formen gegossen, was das Prototyping neuer Designs beschleunigt. Top-Kanäle werden in Formen unter Kompression gegen eine konforme Polyurethandichtung gegossen, um Komponenten mit geformten Anschlüssen herzustellen. Während die unteren Kanalkomponenten in Schalen gegossen und auf Mikroskop-Dia-Unterlage behandelt werden.
Dieser Fertigungsansatz kombiniert die Multi-Scale-Musterung der Teile in einem einzigen Schritt, was Zeit spart, die Reproduzierbarkeit und Rückverfolgbarkeit verbessert und den durch Portstanzen und mehrere Schneideschritten entstehenden Schmutz reduziert. Die porösen Membranen sind entscheidend für die Funktion des Organchips, und der Herstellungsansatz, der auf dem Gießen gegen gemusterte Siliziumwafer basiert, führt zu Membranen mit gleichbleibender Dicke und Oberflächengüte. Die Handhabung über Polycarbonat-Träger ermöglicht eine größere Chargenproduktion und -lagerung.
Der montierte Orgelchip besteht aus zwei Füllekanälen in einer optisch transparenten Verpackung. Im überlappenden Bereich ermöglicht eine poröse PDMS-Membran die Gewebe-Gewebe-Interaktion von Metaboliten, Proteinen, Therapeutika, Krankheitserregern und Zellen, um die Organchip-Funktion zu rekapitulieren, während zwei parallele Kanäle auf beiden Seiten verwendet werden, um mechanische Dehnung enzuerregen, wobei zyklische Vakuumbetätigung verwendet wird. Die Porosität der PDMS-Membran biomedizinisch unterstützt den Fluss von Metaboliten, Wachstumsfaktoren und sogar Zellen zwischen der Vaskulatur und organparenchym.
Die scheinbare Durchlässigkeit der Membran wurde anhand der Di-Konzentration in den Auslasskanälen mit und ohne Caco-2-Darmzellen bestimmt. Die Darmchip-Zellschichten bieten eine deutlich erhöhte Barriere für Durchlässigkeit. Der Organchip kann über die parallelen Vakuumkanäle betätigt werden, um die zyklische Dehnungsbelastung auf die Membran und damit auf das kultivierte Gewebe quantitativ und reproduzierbar anzuwenden.
Diese zyklische Sorte in Kombination mit Medienfülle unterstützt die zelluläre Differenzierung, um die in vivo Organphysiologie besser zu imitieren, wie z. B. die Bildung von Zotten im Darmchip. Mit dem hier beschriebenen Protokoll sollten Sie nun in der Lage sein, einen dehnbaren PDMS-Organchip herzustellen.
