Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey Farrell, James Gagnon, und Jennifer Bergmann für Kommentare zum Manuskript danken. KWR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship-Programm bei der Entwicklung des FDAP Test unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, um AFS und durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy Noether-Programm), das Max-Planck-Gesellschaft und des Human Frontier Science Program (Career Development Award) an PM unterstützt.

1. Erstellen eines Photokonvertierbare Fusionskonstrukt und Spritzen dechorionated Zebrafischembryonen <ol><li> Erzeugen Sie eine funktionale Konstruktion des Proteins von Interesse zu einer grünen-to-rot Photokonvertierbare Protein (siehe Diskussion) fusioniert enthält, dann verwenden Sie in vitro-Transkription zur mRNA mit Cap erzeugen das Fusionsprotein kodiert, wie in Müller et al., 2012 19. </li><li> Verwenden Pronase die Chorion von etwa 30 Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium zu entfernen. Alternativ manuell dechorionate Embryonen mit einer Pinzette 28. Hinweis: Die Embryonen für spätere Bild dechorionated werden. Falls gewünscht, kann Embryos durch das Chorion später injiziert werden und dechorionated, nur vor der Bilderzeugung. <ol><li> Machen Sie eine 5 mg / ml Stammlösung von Pronase aus Streptomyces griseus in Standard Zebrafischembryo Medium 19. Rock the Lösung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 Minuten, damit der Protease, sich aufzulösen. Aliquot 2 ml in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -20 ° C. </li><li> Transfer eines Zellstadium Embryonen zu einem Durchmesser von 5 cm Glas oder Agarose-beschichteten Kunststoffpetrischale mit ~ 8 ml Embryo Medium. 2 ml aufgetaute Pronase Stammlösung in die Schale und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 bis 10 min. </li><li> Vermeiden Sie es, Embryonen, um Luft oder Kunststoff, wie Kontakt mit entweder verursacht dechorionated Embryonen zu Bruch. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit Embryo Medium. Transfer der Embryonen in den Becher durch Kippen der Petrischale beim Eintauchen in das Medium. </li><li> Nachdem die Embryonen mit dem Boden des Becherglases angesiedelt, gießen Sie die meisten der Embryo Medium, dann gießen Sie frisch Embryo Medium in das Becherglas. Das milde Verwirbelung des Mediums Gießen in das Becherglas verursacht Embryonen, ihre geschwächten Chorion zu verlieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.4. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die dechorionated Embryonen auf einem Agarose-beschichtetes Spritzgussschale 29 mit einer Glaspasteurpipette mit einer Riegelspitze. Lodernddie Pipettenspitze verhindert gezackten Kanten von Embryonen zu verletzen. </li><li> Co-Injektion der mRNA und eine 3 kDa Alexa488-Dextran-Konjugat 29,30 (1B; siehe Diskussion für vorgeschlagen mRNA und Alexa488-Dextran Mengen). Injizieren direkt in der Mitte der Zelle (nicht das Eigelb) eine gleichmäßige Verteilung von mRNA und Fluoreszenzfarbstoff zu gewährleisten, wenn die Spaltung beginnt. Anmerkung: Die Alexa488 Signal während der Datenanalyse verwendet werden, um Masken Kompartment um zwischen der intrazellulären und extrazellulären Fluoreszenz unterscheiden erzeugen. </li><li> Übertragungs injizierten Embryonen auf ein 1-2% Agarose-beschichtete Vertiefung einer Sechs-Well-Kunststoffschale mit Embryomedium gefüllt. Inkubation im Dunkeln bei 28 ° C bis Embryonen späten Sphäre Stufe 31 (ca. 5 Stunden nach der Befruchtung) erreicht. Überprüfen Embryonen jeglicher in 2 Stunden unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie jeglichen Schmutz von Embryonen, die gestorben sind, erzeugt. </li></ol> 2. Montage Zebrafischembryonen für Photoconversion und Imaging auf einem Inverted Konfokalmikroskop <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um 04.59 gesunde Embryonen zu identifizieren und mit einem Glas Pasteurpipette mit einer Riegelspitze, um sie aus der Schale zu entfernen. </li><li> Vorsichtig die Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 1 ml geschmolzen 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x Danieau der Embryo Medium auswerfen (siehe Materialliste) (Abbildung 2A). Anmerkung: Agarose sollte eine Temperatur zwischen 40 und 42 ° C haben; höheren Temperaturen könnte die Embryonen schädigen. </li><li> Zeichnen Sie die Embryonen wieder in die Pipette zusammen mit einigen Agarose. Vorsichtig werfen Sie die Agarose und Embryonen auf dem Deckglas eines Glasbodenschale (2B). Sicherzustellen, dass die Dicke des Deckglases mit dem Ziel auf dem Konfokalmikroskop kompatibel ist. <ol><li> Wiederverwenden Glaspipette, falls gewünscht. Um aus der Pipette reinigen Sie die restliche Agarose und Verstopfung, schnell Pipette Embryo Medium nach oben und unten zu verhindern.An der 15-ml-Röhrchen mit ~ 5 ml Embryomedium gefüllt neben dem Stereomikroskop für diesen Zweck. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Metallsonde, um die Embryonen zu positionieren, so dass das Tier Pol (Blastoderm) dem Deckglas. Arbeiten Sie schnell, da die Agarose wird in 20-30 sec verfestigt. Verwenden Sie das Stereomikroskop der Embryonen Positionen überwachen und anpassen, bis das Agarose erhärtet. </li><li> Die Schritte 2,1-2,4 bis die gewünschte Anzahl von Embryonen montiert wurde. Hinweis: In einem typischen Experiment werden vier Tropfen Agarose mit je vier oder fünf Embryonen einfach auf dem Deckglas passen. Über 16 Embryonen während eines einzigen ideale Experiment (Abbildung 2C) abgebildet werden. </li><li> Beim Erstarren der Agarose, füllen die Glasbodenschale mit 1x Danieau der Embryo Medium. </li></ol> 3. Photoconverting und Messung der Abnahme des photokonvertiertem Signal A 25X oder 40X Wasser Ziel is für die Größe und Brechungsindex von Zebrafischembryonen geeignet. Es ist am besten, um Immersionsöl mit dem gleichen Brechungsindex wie Wasser statt tatsächliche Wasser verwenden, da Wasser wird im Laufe der fünfstündigen Experiments verdampfen. Sicherzustellen, dass das Immersionsöl ist zur Verwendung mit einem Wasser (kein Öl) Ziel verwendet werden. <ol><li> Platzieren Sie einen großen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, sicherzustellen, dass der Ölfilm zwischen Objektiv und Deckglas wird nicht wie die Bühne bewegt, um verschiedene Positionen Embryo während der Bildgebung zu brechen. Sicher stellen Sie den Glasbodenschale auf die Bühne, so dass das Gericht nicht zu verschieben, wenn die Bühne bewegt. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen beheizten Phase bei 28 ° C, die optimale Temperatur für die Zebrafisch-Entwicklung. </li><li> Definieren Sie die Position jedes Embryo im Software-Paket des konfokalen Mikroskops. Stellen Sie die Z-Tiefe für jeden Embryo und versuchen, etwa in jedem Embryo Ziel in der gleichen Ebene. Hinweis: Über 30 &amp; mgr; m aus dem Tier Pol ist ein good Tiefe da in dieser Tiefe die Hüllschicht des Embryos vermieden wird Bildgebungsbereich maximiert wird, und die Lichtstreuung ist minimal. Eine einzelne optische Scheibe mit einer Dicke von ~ 3,3 um ausreichend Daten; es gibt keine Notwendigkeit, eine Z-Stapel (siehe Abschnitt 5) zu erwerben. </li><li> Sammeln Sie zwei Signale während des Experiments: die &quot;grüne&quot; Signal von der Alexa488-Dextran-Konjugat-die während der Datenanalyse verwendet werden, um extra- und intrazellulären Fluoreszenz-und die &quot;rote&quot; -Signal aus dem Fusionsprotein zu isolieren, nachdem es photokonvertiertem wird wird. <ol><li> Excite Alexa488 mit einem 488 nm Laser, und sammeln emittierte Fluoreszenz zwischen ca. 500 und 540 nm. Anmerkung: Nach Photo viele grün nach rot Photokonvertierbare Proteine ​​(zB Dendra2) angeregt mit einem 543 nm Laser und Fluoreszenz emittieren zwischen ~ 550 und 650 nm. Passen Sie bei Bedarf auf der Grundlage der Photokonvertierbare Protein verwendet. </li></ol></li><li> Erwerben &quot;pre-Photo&quot;Bilder, und konfigurieren Sie die Software der konfokalen Mikroskop zur Bild jedem der zuvor festgelegten Positionen (aus Schritt 3.2) mit den entsprechenden Abbildungsbedingungen alle 10 oder 20 Minuten für ein Fünf-Stunden-Zeitverlauf (siehe Abschnitt 5 und Diskussion). </li><li> Um das Fusionsprotein photoconvert zu einem 10X-Objektiv ein- und ausgesetzt werden Gruppen von Embryonen mit UV-Licht aus einer Quecksilberbogenlampe mit einer ~ 300-400 nm Anregungsfilter mit 100% Leistung für 2 min. Den Schwerpunkt entlang der z-Achse, um eine einheitliche Photo (siehe Abschnitt 5) zu fördern. Stellen Sie sicher, dass das Immersionsöl nicht auf die 10-fach Objektiv während der Photo tropfen. Anmerkung: Die Verschiebung des Fokus während Photo könnte, um die Variabilität unter den Experimentatoren zu vermeiden automatisierbar. </li><li> Wechseln Sie wieder zu der 25X oder 40X-Objektiv sofort nach Photokonversion. Stellen Sie sicher, dass die zuvor definierten Positionen aus Schritt 3.2 sind noch genau. Wenn das Gericht während photoconv verschobenersion, re-definieren die Positionen der Embryonen. <ol><li> Start des Programms in Schritt 3.4 angelegt und ermöglichen Abbildungs ​​für 5 h fortgesetzt. Die verstrichene Zeit zwischen den Photo und dem Beginn der Bildgebung für jeden Embryo verstrichen. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie gelegentlich auf das Experiment. Überwachung des Umfangs Danieau-Medium und fügen Sie mehr, wenn nötig. Starten Sie die Software, wenn sie ins Stocken geraten ist. </li><li> Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Werte, die während der Datenanalyse verwendet, um die Asymptote der exponentiell abnehm Modells schätzen wird bestimmen, umfassen einige Embryonen, die mit Alexa488-Dextran nicht jedoch mRNA in dem Experiment injiziert wurden. Zur Ermittlung der Geräterauschen, das auch während der anschließenden Datenanalyse verwendet werden, erfassen eines Bildes in der Abwesenheit einer Probe. </li></ol> 4. Die Analyse der Daten mit Hilfe von PyFDAP <ol><li> Sichtprüfung der zeitliche Verlauf Datensätze von jedem Embryo. Entsorgen Sie Datensätze aus Embryonen, die bei imag gestorbention, die wesentlich verschoben, die sehr geringe Mengen an photokonvertiertem Signals haben, oder dass die Regionen von Zellen, die ungewöhnlich aussehen und stillstehen und Division (typisch verletzter oder kranker Embryonen) enthalten. Hinweis: Gelegentlich, Blasen in der Immersionsöl oder andere Artefakte in ein oder zwei Bilder in einem ansonsten verwendbaren Datensatzes angezeigt. Beachten Sie alle Bilder, die Artefakte enthalten; sie werden später verworfen, und die verbleibenden Zeitpunkten von einer solchen Datensatzes immer noch untersucht werden. </li><li> Verwenden Sie den Python-basierte Softwarepaket PyFDAP die FDAP Daten analysieren. PyFDAP berechnet Halbwertszeit durch die Bestimmung der durchschnittlichen intrazellulären und extra rote Fluoreszenz-Intensität in jedem Bild und Anpassen der Daten mit einer exponentiell abnehmenden Funktion 56 (Abbildung 3). <ol><li> Laden Sie PyFDAP (siehe Materialliste). </li><li> Verwenden PyFDAP zu trennen intra- und extrazellulären photokonvertiertem Signal (3A, B). Unse die Alexa488-Signal, das strikt intrazellulär ist, um eine intrazelluläre Maske erstellen. Wenden Sie diese Maske auf das entsprechende Bild Rot-Kanal, um intrazelluläre Pixel aus, die bei der Berechnung der extrazellulären durchschnittliche Intensität zu verhindern. Um durchschnittliche intrazellulären Intensität zu messen, drehen Sie die Maske. </li><li> In PyFDAP, zeigen die maskierte Bilder in Schritt 4.2.2 erzeugt. Sichtprüfung der Bilder und entsorgen Datensätzen, in denen Masken nicht genau zu unterscheiden intrazellulären von extrazellulären Raum (dies sollte selten sein; beachten Sie, dass die Zellmembranen sind in Bilder, in dem extrazellulären Raum maskiert ist enthalten, aber sie konnten durch die Veränderung der Schwellen entfernt werden Algorithmus oder durch die Einführung einer Membranmaske (beispielsweise unter Verwendung von Membran-GFP)). Verwerfen auch alle Einzelbilder, die Artefakte (zB Blasen im Immersionsöl) in Schritt 4.1 identifiziert. </li><li> Verwenden PyFDAP durchschnittlichen extra- und intrazellulären Fluoreszenzintensitäten für eac berechnenh Bild. PyFDAP berechnet diese Mittelwerte durch Summieren der Intensitäten der Bildpunkte, die außerhalb der Maske und Teilungs fallen durch die Gesamtzahl von Pixeln summiert. </li><li> Montieren Sie die Fluoreszenzdaten (3C) mit folgender Exponentialfunktion: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> wobei t die Zeit nach dem Photo, c (t) die Intensität bei einem bestimmten Wert von t ist, c 0 die Intensität bei t = 0, k die Clearance-Rate konstant ist und y 0 die Asymptote, das die Funktion nähert als Fluoreszenz abnimmt (Figur 1D). y 0 ist, können basierend auf den Messungen in Schritt 3.8 19 eingeschränkt werden. </li><li> Verwenden PyFDAP die extra- und intrazellulären Proteinhalbwertszeiten (τ) von den Freiraum Geschwindigkeitskonstanten (k) unter Verwendung der folgenden Beziehung berechnet: <img fo:content-width = &quot;1in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Kontrolle Experimente zur Photobleaching, versehentliche Photokonversion, und Photo Uniformity Beurteilen <ol><li> Die Beurteilung Bleichen Hinweis: Das Photobleichen könnte artifactual Abnahme der Fluoreszenzintensität, die die Bleicheigenschaften des fluoreszierenden Proteins neben der Clearance des Proteins von Interesse reflektiert verursachen. <ol><li> Um mögliche Photobleaching zu bewerten, führen Sie eine Reihe von FDAP Experimente mit 10-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung und einen zweiten Satz mit 20-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung (Abbildung 4). Analysieren Sie die Daten aus beiden Versuchsreihen mit PyFDAP wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Längere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Versuche lassen eine erhebliche Bleichen. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Versuchen identisch sind, Photobleaching ist kein signifikantes Problem. </li><li> Alternativ zu bewerten Bleichen durch den Erwerb einer Reihe von ~ 30 Bilder sofort nach Photokonversion. Eine signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigt signifikante Photobleichen. </li><li> Wenn Ausbleichen erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere Laserleistung, Belichtungszeit zu verringern, oder verwenden Sie eine photo Photokonvertierbare Protein 32. </li></ol></li><li> Die Beurteilung unbeabsichtigte Photokonversion. Hinweis: Dendra2 kann mit 488 nm Beleuchtung 27 photokonvertiertem werden. Bei Anregung Alexa488 mit 488-nm-Laser, wie in Schritt 3.3.1 unbeabsichtigte Photo und damit einer artifactual Zunahme der scheinbaren Halbwertszeit des Proteins von Interesse beschrieben möglich. Allerdings haben wir und andere 33 festgestellt, dass 488 nm Beleuchtung ist eine ineffiziente Methode der Photokonversion in Zebrafischembryonen. <ol><li> Verwenden Sie die in Schritt 5.1.1 Kontrollexperiment, um eine versehentliche Photo erkennen. Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Kürzere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Experimente zeigen wesentliche unbeabsichtigte Photokonversion. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Experimenten identisch sind, ist eine versehentliche Photo relativ wirkungslos. </li><li> Falls versehentlichen Photo erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere 488 nm Laserleistung und kürzere Aufnahmezeiten zu vermeiden, versehentlich photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Die Beurteilung Photo Uniformität. Hinweis: Wenn Photo zu der animalen Pol des Embryos vorgespannt ist, wird die Abnahme der Fluoreszenz, die durch Proteindiffusion oder Zellbewegung in tiefere Ebenen (5A) beeinflusst werden. <ol><li> Um festzustellen, ob Photo gleichmäßig ist, drücken eine abgesondert Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit extrazellulären Fusionsproteine) oder eine cytoplasmatische Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit intrazellulären Fusionsproteine). Photoconvert wie üblich, tHenne erwerben ein Z-Stapel umfasst die meisten der Blastoderm alle 20 min für 80 min. </li><li> Wenn Photo zu der animalen Pol vorgespannt ist, wird die Fluoreszenzintensität in den tieferen Ebenen der Zeit aufgrund von Diffusion oder Bewegung der Zellen (5B) zu erhöhen. Wenn ungleichmäßige Photo erkannt wird, konzentrieren sich tiefer in die Embryonen während der Photokonversion. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.

Der Erfolg einer FDAP Experiments beruht auf der Erzeugung eines funktionellen Photokonvertierbare Fusionsprotein. Markierung eines Proteins kann seine biologische Aktivität und / oder biophysikalischen Eigenschaften, einschließlich der Lokalisierung, Löslichkeit und Stabilität 36-41 betreffen. Werden hergestellt, um die Aktivität von mehreren verschiedenen Fusionskonstrukte zu testen, um eine, die aktiv ist, zu finden. Wir haben festgestellt, dass eine Änderung der Position des Photokonvertierbare Prot...

Die Niveaus von Proteinen in Zellen und Organismen werden durch ihre Produktionsraten und Clearance bestimmt. Proteinhalbwertszeiten kann von Minuten bis Tagen 1-4 liegen. In vielen biologischen Systemen, die Stabilisierung oder Verrechnung von Schlüsselproteinen hat wichtige Auswirkungen auf die Zellaktivität. Modulation der intrazellulären Proteinstabilität ist für die Zellzyklusprogression 5,6, entwicklungsSignalisierungs 7-9, Apoptose 10, und die normale Funktion und Wartung der Neuronen 11,12 erforderlich. Extrazelluläre Proteinstabilität beeinflusst die Verteilung und Verfügbarkeit von sezernierten Proteinen, wie Morphogene 13,14, innerhalb eines Gewebes. Im Laufe der letzten Jahrzehnte, die Proteinstabilität wurde vor allem in der Zellkultur mit radioaktivem Pulsmarkierung oder Cycloheximid Chase-Experimente 15 bewertet. In solchen Pulse-Chase-Experimente werden die Zellen entweder transient zu einem &quot;Impuls&quot; von radioaktiven Aminosäure ausgesetztSäurevorläufer, die in den neu synthetisierten Proteine ​​eingebaut werden, oder sie können gegen Cycloheximid, das die Proteinsynthese hemmt, ausgesetzt sind. Die kultivierten Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und entweder Immunfällung, gefolgt von Autoradiographie (radioaktive Pulse-Chase-Experimente) oder Western Blot (in Cycloheximid Versuchen) wird verwendet, um die Clearance des Proteins über die Zeit quantifiziert. Herkömmliche Proteinstabilität Tests haben mehrere Nachteile. Zuerst Proteine ​​in diesen Assays werden häufig nicht in ihrer endogenen Umgebungen exprimiert, sondern in der Gewebekultur und manchmal in Zellen aus unterschiedlichen Spezies. Für Proteine, deren Stabilität ist kontextabhängig, ist dieser Ansatz problematisch. Zweitens ist es nicht möglich, Proteinclearance in einzelnen Zellen oder Organismen mit der Zeit zu folgen, und die Daten aus diesen Tests reflektiert ein Durchschnitt der verschiedenen Populationen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Da einzelne Zellen begonnen habenmit unterschiedlichen Mengen an Eiweiß, kann die radioaktive Markierung oder Cycloheximid zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen wurden, oder können unterschiedliche Clearance-Kinetik, wie aggregierte Daten irreführend sein können. Schließlich wird in dem Fall von Cycloheximid Chase-Experimente, Zugabe der Proteinsynthese-Inhibitor kann unbeabsichtigte physiologischen Wirkungen, die Proteinstabilität 16-18 künstlich verändern könnten. Diese Mängel können mit Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP), eine Technik, die Photokonvertierbare Proteine ​​zu Protein-Clearance dynamisch in lebenden Organismen 19-25 messen nutzt vermieden werden (siehe Diskussion für Beschränkungen des FDAP Technik). Photokonvertierbare Proteine ​​fluoreszierende Proteine, deren Anregungs- und Emissionseigenschaften zu ändern nach der Exposition auf bestimmte Wellenlängen des Lichts 26. Eine häufig verwendete Variante ist Dendra2, eine &quot;grüne-to-rot&quot; Photokonvertierbare Protein, das anfangs abZitat und Emissionseigenschaften ähnlich wie das grün fluoreszierende Proteine, aber nach der Einwirkung von UV-Licht- &quot;Photo&quot; -seine Anregungs- / Emissionseigenschaften werden ähnlich denen der rote fluoreszierende Proteine ​​23,27. Wichtig ist, dass neue Protein nach Photo erzeugt nicht denselben Anregungs- / Emissionseigenschaften wie die photokonvertiertem Proteins ermöglicht Entkoppelung der Produktion und Clearance auf Photo und Beobachtung von nur einem Pool von photokonvertiertem Protein. Kennzeichnen von interessierenden Proteine ​​mit Photokonvertierbare Proteine ​​stellt somit eine bequeme Möglichkeit, impuls Label Proteinen in intakten, optisch zugänglichen lebenden Organismen. In FDAP Assays (Abbildung 1A) ist ein Protein von Interesse mit einem Photokonvertierbare Protein markiert und ausgedrückt in einem lebenden Organismus (1B). Das Fusionsprotein wird durch Photo, und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit ist durch fluorescen wachtence-Mikroskopie (Abbildung 1C). Die Daten werden dann mit einem geeigneten Modell angebracht, um die Halbwertszeit des Fusionsproteins (1D) zu bestimmen. Die hier beschriebene FDAP Assay wurde entwickelt, um die extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen in Zebrafischembryos der frühen Embryogenese 19 bestimmen. Allerdings kann dieser Ansatz für jeden transparent Modellorganismus, die Live-Bildgebung toleriert, und könnte verwendet werden, um den Abstand von jedem taggable intrazelluläre oder extrazelluläre Protein zu überwachen angepasst werden. Variationen der hier beschriebenen Technik wurden in kultivierten Zellen 20,23 und Drosophila 22 und der Maus 21 Embryos durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Proteinstabilität beeinflusst viele Aspekte der Biologie und der Messung der Abstand Kinetik der Proteine ​​können wichtige Einblicke in biologische Systeme. In FDAP Experimenten kann die Clearance von Proteinen in lebenden Organismen zu messen. Ein Protein von Interesse wird mit einem Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein markiert ist, ausgedrückt in vivo und Photokonversion und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit überwacht wird. Die Daten werden dann mit einem geeigneten Spaltmodell, um die Proteinhalbwertszeit zu bestimmen, ausgestattet. Wichtig ist, dass die Clearance-Kinetik der Proteinpopulationen in verschiedenen Kompartimenten des Organismus getrennt durch Anlegen compartmental Masken untersucht werden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die intra- und extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen während Zebrabärblingentwicklung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für FDAP Experimente im Zebrafischembryonen. Es sollte möglich sein, FDAP verwenden, um den Abstand Kinetik bestimmenjede taggable Protein in jedem optisch zugänglich Organismus.

FDAP verwendet worden, um die Halbwertszeiten von extrazellulärer Signalproteine ​​in Zebrafischembryos 19 bestimmen. Eines dieser Proteine, Schielen, induziert die Expression von Genen während der Embryogenese mesendodermal 34. Schielen-Dendra2 aktiviert die Expression von Genen mesendodermal auf einem ähnlichen Niveau untagged Schielen, wie qRT-PCR und in situ-Hybridisierungsassays 19 demonstriert. Die Embryonen wurden mit Alexa488-Dextran und mRNA Schiel Dendra2 und au...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K Aufrufe.  Harvard University.  Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden. 

Serie: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...