The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. Isolierung von Xenopus Oozyten und Mikroinjektion von cRNA <ol><li> Erhalten Eizellen aus erwachsenen weiblichen Xenopus laevis. Betäuben Tiere in 0,2% MS222 und Eierstock-Resektion Lappen durch einen kleinen Bauchschnitt. </li><li> Isolieren Oozyten aus Eierstocklappen durch enzymatischen Verdau bei 19 ° C für 3-4 h bei 600-700 U / ml Collagenase Typ 2 aus Clostridium histolyticum in calciumfreiem OR2-Lösung (Rezeptur in Tabelle 1) gelöst. </li><li> Für die Auswahl, legen Sie die defollikuliert Eizellen in einer Petrischale unter einem binokularen Mikroskop in einem hohen Natrium-haltigen Lösung (ND96: Rezept in Tabelle 1). </li><li> Wählen Stadium V-VI Oozyten und legen Sie sie in einem anderen Petrischale mit einer Pasteur-Pipette. HINWEIS: Blunt Pasteur-Pipette durch Abflammen zu Eizelle Verletzungen zu vermeiden. </li><li> Inject Oozyten mit cRNA (zB 0,2 ng pro αβγENaC-Untereinheit). Lösen cRNAs in RNase-freiem Wasser. HINWEIS: GesamtVolumen in jede Eizelle injiziert wird, ist 46 nl. </li><li> Shop injizierten Oozyten bei 19 ° C in einem niedrigen Natrium-Lösung für Natrium Belastung der Eizellen zu verhindern (ND9: Rezept in Tabelle 1). Ergänzung der Lösung mit 100 U / ml Penicillin Natrium und 100 ug / ml Streptomycinsulfat, um Bakterienwachstum zu verhindern. Sorgfältig hand die Eizellen, die Menge der beschädigten Eizellen oder tot zu begrenzen und sie in einzelnen kleinen Gruppen in einer 12-Well-Platte Brunnen mit Bad-Lösung während der zwei Tage nach cRNA Injektion gefüllt. </li></ol> 2. Darstellende Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Experimente <ol><li> Messung der Oozyten zwei Tage nach der Injektion. </li><li> Füllen Sie eine Spritze eines Schwerkraft-Perfusions-System mit ND96-Lösung und einer weiteren Spritze mit ND96 Lösung Amilorid (2 uM) mit. Berg Spritzen 50 cm über der Eizelle Bad Kammer. HINWEIS: Die Konzentration des ENaC-Inhibitor Amilorid wurde gewählt, 20-mal höher als die IC 50 </sub&gt; (100 nM). </li><li> Schalten Sie eine 150 W Halogen-Kaltlichtquelle und stellen Sie es auf 10 cm über der Eizelle Bad Kammer, die eine gute Visualisierung mit dem binokularen Mikroskop. Dann auf Saug-und justieren das Saugrohr am Ende der Eizelle Bad Kammer. Suchen Saugrohr gegenüber Röhren Superfusion &quot;-Adapter in die Eizelle Badewanne. HINWEIS: Saugleistung muss ausreichen, um kontinuierlichen Fluss der Lösung Superfusion die Eizelle zu unterstützen. </li><li> Superfusion einzustellen Geschwindigkeit jeder Lösung auf 3-5 ml / min unter Verwendung der Schwerkraft iv Strömungssteuereinrichtung. Schließen Sie die Superfusion Rohre mit einem Adapter an der Eizelle Bad Kammer. </li><li> Ziehen Glaskapillaren mit einer Mikropipette Abzieher Spitzendurchmesser von &lt;1 um zu erhalten. Dann füllen Kapillaren ~ 1/4 mit 3 M KCl. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Teil des chlorierten Silberdraht des Elektrodenhalter in KCl-Lösung eingetaucht. Auf Luftblasen in der Spitze der Kapillare. Luftblasen beeinträchtigen die Messrement durch zunehmende Resistenz Streukapazität. </li><li> Legen Sie die Kapillaren in den Elektrodenhalter des Stroms und der Spannungselektrode und legen Sie sie in ND96 enthält Amilorid (2 uM)-Lösung unter Verwendung der Mikromanipulatoren. </li></ol> 3. Messung von Amilorid-sensitive Ganzzellströme <ol><li> Null das Elektrodenpotential der Spannungselektrode (V m) und die Stromelektrode (V e) durch Einstellen der V m und V e versetzt Tasten. HINWEIS: Der Widerstand sollte 1-2 M &amp;OHgr; für die Elektrode zu V m und 0,5 zu messen -1 MOhm für die aktuelle Injektionselektrode. </li><li> Zeigen die Eizelle in das Bad Kammer in der Nähe der Spannungserfassungselektrode. HINWEIS: Die Eizelle während einer dieser Übertragungsschritte nicht beschädigen. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die Eizelle zu übertragen. Um eine Beschädigung der Eizelle die Kanten der Pipette zu vermeiden, sollte durch brenn abgestumpft werden. </li><li> Impale oozyten vorsichtig mit beiden Mikroelektroden. </li><li> Stellen Sie die Haltepotential an den Verstärker bis -60 mV und schalten Sie den Schreiber. Schalten Sie den Amilorid (2 uM) haltigen Lösung. HINWEIS: Der Strom sollte etwa 0 ± 0,5 uA sein. Größere Leckströme zeigen eine undichte impalement. Daher sollten diese Oozyten zurückzuweisen. Außerdem sollten die in der Gegenwart von Amilorid (2 &amp;mgr; M) gemessenen Leckströme ähnlich αβγ-WT exprimierenden Oozyten denen in αβγ ENaC-Mutante exprimierenden Oozyten gemessen werden. Dies zeigt, dass die Mutationen nicht beeinträchtigen den Amilorid-Empfindlichkeit des Kanals. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Bei Bedarf stellen Sie die Verstärkung. </li><li> Nach der gemessene Strom ein stabiles Plateau erreicht, auf Amilorid-freie Lösung zu ändern. HINWEIS: Abwärts aktuellen Ablenkungen in der aktuellen Spuren entsprechen Einwärtsströme, dh Bewegung der positiven Ladung (Na +) aus der extrazellulären Seite in die Zelle. </li><li> After ein Strom Plateau erreicht ist (nach ~ 60 sec), schalten Sie die Superfusion zurück zum Amilorid haltigen Lösung. Nachdem der Strom der Eizelle die anfängliche Basisstrom erreicht, schalten Sie die Spannungsklemme und die Elektroden vorsichtig zurückziehen. </li><li> Zum Wiederverschließen der Plasmamembran an den Standorten der impalement ermöglichen, legen die Eizelle in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 100-150 ul Protease kostenlos ND96 Lösung. </li><li> Nach 5 min übertragen Eizelle einer Protease enthaltenden Lösung oder zu einer Kontrolllösung ohne Protease für 30 min Inkubationszeit. HINWEIS: Die Inkubationszeit ist abhängig von der Protease und der untersuchten Kanals. </li><li> Nach der Inkubation Schritt wiederholen Sie den Strommessung (siehe 3.2 und folgende). HINWEIS: Es ist möglich, nach Inkubation in Protease-Lösung messen&gt; 90% der Eizellen. </li></ol> 4. Biotinylierung Assay <ol><li> Wählen und entsorgen Sie defekte Eizellen unter dem Binokular. HINWEIS: Verwenden Sie spritzened Oozyten aus der gleichen Charge für die Strommessung und für die Biotinylierung Experimenten. </li><li> Halten Biotin bei RT für mindestens 20 Minuten vor dessen Verwendung in dem Experiment. </li><li> Bereiten Sie die Lösungen: ND96 und ND96, die die geeignete Protease. Bereiten Pasteur Pipetten durch Markierung und ihnen durch kurzes flamm ihre Tipps, um Verletzungen der Eizellen zu vermeiden. HINWEIS: Hier wird die Protease Chymotrypsin 2 ug / ml in ND96 verwendet. Gönnen Sie jede Gruppe mit einer Pipette, um Kreuzkontamination von Lösungen zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 2,5 ml ND96 oder ND96 Kontrolle, die eine Protease bei RT. Dann hinter 30 Eizellen pro Vertiefung und Inkubation für 30 min bei RT. HINWEIS: Für die anschließenden Verfahren ist es wichtig, Proben auf Eis halten zu allen Zeiten. Alle Zentrifugationsschritte werden bei bei 4 ° C durchgeführt wird </li><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte mit 2,5 ml ND96 (jede Gruppe braucht 3 Brunnen für den Waschschritten) und wiegen die Biotin. HINWEIS: 2,5 mg Biotin per gut (1 mg / ml) erforderlich ist. Löse das Biotin in der Biotinylierung Puffer (dh 25 mg Biotin (10 Gruppen) in 25 ml Biotinylierung Puffer (Rezept in Tabelle 1). </li><li> Übertragen Sie jede Gruppe von Eizellen zu einem gut mit 2,5 ml ND96 gefüllt. Über Oozyten nacheinander in zwei weitere Bohrlöcher mit ND96 zu waschen Sie die restlichen Protease. Die Eizellen Inkubation für 5 min in ND96. </li><li> Übertragen Sie die Oozyten in eine gut, die 2,5 ml Biotin-Lösung und Inkubation sie mit sanfter Bewegung (&quot;Shaker&quot;) für 15 min. HINWEIS: Minimieren Sie das übertragen ND96 mit der Pipette, um eine Verdünnung des Biotin-Lösung zu vermeiden. </li><li> Übertragen Sie jede Gruppe von Eizellen in einen Brunnen, der 2,5 ml Quench-Puffer (Rezept in Tabelle 1), um die Biotinylierungsreaktion stoppen. Dann übertragen Sie jede Gruppe von Eizellen in eine zweite und auch die 2,5 ml stillen Puffer und Inkubation für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Beschädigte oder tot Eizellen. Hinweis:Wählen Sie die gleiche Anzahl von Oozyten pro Gruppe für die folgenden Verfahren. </li><li> Übertragen Sie jede Gruppe von Oozyten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff. HINWEIS: Minimieren Sie die Anzahl der Quench-Puffer, der übertragen wird. </li><li> Anschließend lysieren die Oozyten, indem sie durch eine 27 G-Nadel in 1 ml Lyse-Puffer (Rezept siehe Tabelle 1) mit Proteaseinhibitoren ergänzt. </li><li> Zentrifugieren der Lysate 10 min bei 1.500 x g. </li><li> Überstand wird abgesaugt und übertragen sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 0,5% Triton-X-100 und 0,5% NP40. Entsorgen Sie die verbleibende Pellet. HINWEIS: Der Überstand enthält biotinylierten Plasmamembranproteinen und nicht-biotinylierte intrazellulären Proteinen. </li><li> Die Reaktionsgefäße für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Immer wieder Wirbel die Rohre in diesem Zeitraum vollständig die Proteine ​​in NP40 und Triton-X-100 zu lösen. </li><li> Zentrifuge 100 ul Agarose-Perlen pro Eizelle Gruppe für 3 min bei 1.500 x g. Nachdem derZentrifugation entfernen Stand aus der Perlen-Lösung und dreimal mit Lysepuffer, um die Perlen mit Puffer ins Gleichgewicht. </li><li> Je 100 ul der gewaschenen Kügelchen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, das die Protein-Detergens-Lösung in 4,13 hergestellt Bindung der biotinylierten Proteine ​​an die Kügelchen zu ermöglichen. </li><li> Mikrozentrifugenröhrchen mit Overhead-Dreh O / N bei 4 ° C inkubieren </li><li> Zentrifugieren Sie die Reaktionsgefäße für 3 min bei 1.500 x g. Dann den Überstand in ein neues Röhrchen. HINWEIS: Intrazelluläre Proteine ​​nicht mit Biotin markiert. Überstand bei -20 ° C gelagert werden Saugen Sie nicht die Perlen. </li></ol> 5. Nachweis von ENaC Spaltfragmente an der Zelloberfläche durch Western-Blot-Analyse <ol><li> Drei Mal Waschen der Kügelchen mit Lyse-Puffer und 100 ul 2x SDS-PAGE-Probenpuffer. HINWEIS: Die Proben können bei -20 ° C gelagert oder sofort für die Western-Blot-Analyse vorbereitet werden. </li><li> Boil sBeispiele für 5 min bei 95 ° C und dann Platz Röhrchen auf Eis. </li><li> Zentrifuge Proben für 3 min bei 20000 xg und Pipetten den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Dieser Überstand enthält die biotinylierten Plasmamembran-Proteine ​​von der Zelloberfläche der Eizelle. </li><li> Analysiert 30 &amp;mgr; l dieses Überstands durch Western-Blot auf Spaltungsfragmente an der Zelloberfläche zu untersuchen. </li><li> Trenne die biotinylierten Proteine ​​durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese) mit einem geeigneten Gel (8%, 10%, 12%, je nach Molekulargewicht der Spaltfragmente untersucht). </li><li> Transfer der Proteine ​​auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen mittels semi-dry Blotting. </li><li> Sonde der Membran mit einem spezifischen Antikörper gegen menschliches γENaC gegen ein Epitop in der C-Terminus gerichtet (siehe Fig. 3 und 13). </li><li> Verwenden Meerrettichperoxidase-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper als SekundärantiKörper. </li><li> Erkennen Chemilumineszenzsignale. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In diesem Manuskript ein methodischer Ansatz, der erfolgreich angewendet wurde, um die Mechanismen, durch Proteasen zugrunde liegenden die Aktivierung von ENaC studieren beschrieben 8,13. Die bewährte Xenopus laevis Oozyten-Expressionssystem wurde verwendet, um funktionell exprimieren ENaC. ENaC-Funktion wurde mit der konventionellen Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik beurteilt. Ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um funktionell relevante Protease-Spaltungsstellen zu identifizieren. Biotinylierung Experimente parallel zu den elektrophysiologischen Messungen durchgeführt wurde es möglich, das Auftreten korreliert ENaC Spaltprodukte an der Zelloberfläche proteolytisch Stromaktivierung. Ein Zusammenhang zwischen dem zeitlichen Verlauf der Stromaktivierung und dem Auftreten von proteolytischen Spaltungsfragmente an der Zelloberfläche unterstützt das Konzept der proteolytischen Kanalaktivierung. Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen erfordern die Pfählung eines oocyte mit zwei Mikroelektroden. Dieses Verfahren wird in der Regel nur einmal in einer einzelnen Eizelle durchgeführt. Jedoch war es möglich, die Mikroelektroden zu entfernen, nachdem eine anfängliche Ganzzellstrom Aufzeichnungs ohne offensichtliche Beschädigung der Eizelle. Tatsächlich scheint die Plasmamembran an den Stellen der Pfählungen innerhalb weniger Minuten wieder zu verschließen. Somit wird nach Abschluss einer ersten Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Messung ist es möglich, die Eizelle aus dem experimentellen Strömungskammer des Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Setup, um ein Mikrozentrifugenröhrchen oder ein Well einer 96-Well-Platte gefüllt übertragen ein kleines Volumen der Test-oder Kontrolllösung. Anschließend kann die gleiche Eizelle zurück zu der Strömungskammer überführt werden und kann wieder bohrt, um eine zweite Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Messung durchzuführen. Bemerkenswerterweise hat ENaC-vermittelten Ströme nicht sehr zwischen der ersten und der zweiten Messung, wenn die Oocyte wurde in Kontrolllösung gehalten variieren. Im Gegensatz dazu Inkubation der Eizelle in einer Protease enthält Solution nach der ersten Messung zu erhöhten ENaC-vermittelten Stroms in der zweiten Messung (Fig. 2). Diese Feststellung zeigt proteolytischen Kanalaktivierung. Durchführung von zwei separaten Strommessungen in einer einzigen Eizelle bietet den Vorteil, dass die Eizelle kann Proteasen oder anderen pharmakologischen Mitteln zwischen den zwei Messungen für eine variable Zeitdauer in einer kleinen Menge Testlösung ausgesetzt werden. Dies ist wichtig bei der Verwendung von Mitteln, die teuer und / oder in großen Mengen verfügbar sind, z. B. gereinigte Protease-Zubereitungen. Die begrenzte Verfügbarkeit von Mitteln kann es unmöglich machen (oder unbezahlbar), um sie im Dauer Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, da der große Mengen von für die kontinuierliche Superfusion der Oozyten mit Durchflussraten von mehreren Millilitern pro Minute erforderlich Testlösung. Außerdem werden kontinuierlich zwei Elektrodenspannungs-Clamp-Messungen von dem bekannten Phänomen begrenztnomen der spontanen Kanal heruntergekommenen auch für ENaC 15 beschrieben. Im Gegensatz dazu Belichten Oozyten Lösungen zwischen zwei separaten Messungen für bis zu einer Stunde oder mehr Test nicht allgemein ein Problem darstellen (siehe Fig. 4A). Schließlich zwei aufeinanderfolgenden Messungen in der gleichen Eizelle durchgeführt, damit gepaart Beobachtungen der Arzneimittelwirkungen. Dies hat einen Vorteil gegenüber ungepaarten Messungen von zwei verschiedenen Gruppen von Oocyten (Protease-behandelten und Vehikel-behandelten), da es das Problem der hohen Variabilität zwischen den Oozyten, in der Regel in der Ionenkanalexpression beobachtet reduziert. Gepaart mit Beobachtungen und der Möglichkeit, die Daten in der ersten Messung zu normalisieren, werden weniger Oozyten pro Versuchsgruppe benötigt, um eine signifikante Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs zeigen. Die Normalisierung der Daten macht es auch einfach, Daten aus verschiedenen Chargen von Oozyten mit unterschiedlichen Ionenkanal-Expressionsniveaus und damit unterschiedliche Ausgangsströme (2D zusammenfassen). Offensichtlich sind Kontrollversuche notwendig, dieses Konzept zu demonstrieren, dass der Ionenkanal-Aktivität von Interesse bleibt in Vehikel-behandelten Kontroll Oozyten stabil von der ersten zur zweiten Messung (siehe 2). Um zu zeigen, daß proteolytische Stromaktivierung korreliert mit dem Auftreten von ENaC Spaltprodukte an der Zelloberfläche, eine Biotinylierung Ansatz ursprünglich von Harris et al. 9 verwendet werden kann. Dieses Verfahren (wie im Protokoll Abschnitt beschrieben und in Fig. 4 gezeigt) wurde angepaßt, daß die Belastung der Kanäle, Proteasen und nachfolgende Aktivierung ENaC-vermittelten Ströme wird durch die zeitabhängige Auftreten von Spaltfragmente parallel zu demonstrieren. Die Biotinylierung Verfahren erlaubt auch die Analyse von einer allgemeinen Zunahme oder Abnahme der Membranproteine ​​auf der Zelloberfläche. Somit ist dieses Verfahren geeignet, die Wirkung von Proteasen und anderen phar untersuchenmacological Agenten auf Kanal Einsetzen in die Plasmamembran oder beim Kanal Abruf. Außerdem Western-Blot-Analyse der biotinylierten Plasmamembranproteinen erlaubt die Detektion von Protein-Fragmenten (z. B. proteolytische Fragmente ENaC) oder Änderungen im Glykosylierungsmuster, die funktionell relevant sein können. Im Ergebnis ist die Kombination der Verfahren verwendet werden, um die stimulierende Wirkung von Proteasen auf ENaC-vermittelten Ganzzellströme zu untersuchen und zeigen eine Korrelation mit dem Auftreten des ENaC Spaltprodukte an der Zelloberfläche kann für einen breiten Bereich von Anwendungen. Insbesondere kann diese Methoden geeignet zu ähnlichen Fragen hinsichtlich der Regulierung der andere Ionenkanäle, Transporter oder Transmembran-Rezeptoren (zB Protease-aktivierten Rezeptoren PAR) zu adressieren.

Proteasen sind Enzyme, die in verschiedenen physiologischen Reaktionen, die von dem bekannten proteolytischen Abbau von Proteinen beteiligt sind, im Zusammenhang mit der Verdauung, um hoch entwickelte Protease-Kaskaden in komplexen regulatorischen Signalwege. Proteasen werden in sieben Gruppen entsprechend ihrer katalytischen aktiven Stelle klassifiziert: Aspartat, Asparagin, Cystein, Glutaminsäure, Metallo-, Serin-und Threonin-Proteasen. Verschiedene Proteasen gezielt verschiedene Schnittstellen, die nicht einfach von der Primärstruktur eines Proteins vorherzusagen sind immer. Die MEROPS Datenbank ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) liefert detaillierte Informationen über eine Vielzahl von Proteasen und ihrer bevorzugten Schnittstellen. Funktionell relevante Spaltstellen können durch ortsgerichtete Mutagenese identifiziert werden. Es ist gut bekannt, daß die proteolytische Prozessierung des ENaC ist ein wichtiger Mechanismus der Aktivierung von thist insbesondere Ionenkanal 1,2. Interessanterweise gibt es Hinweise, dass die Funktion der zugehörigen säureempfindlichen Ionenkanal 1a (ASIC1a) können auch durch Proteasen 3-5 geändert werden. Derzeit bleibt es eine offene Frage, ob proteolytischen Spaltung Kanal spielt eine relevante physiologische Rolle bei der Regulierung der Aktivität anderer Ionenkanäle oder Transporter. 6. Es ist jedoch auch festgestellt, dass die proteolytische Spaltung aktiviert eine Gruppe von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs). Mehrere Serinproteasen (zB Kanal-aktivierenden Proteasen (CAP1-3), Chymotrypsin, Trypsin, Furin, Plasmin, neutrophile Elastase und Kallikrein) haben gezeigt, dass proteolytisch aktivieren ENaC 2. Zusätzlich zu Serinproteasen, können andere Gruppen von Proteasen proteolytische ENaC Aktivierung beteiligt sein. In der Tat, die jüngsten Daten zeigen, dass die Metalloproteinase Meprin-β 7 und die Cystein-Protease Cathepsin-S 8 können auch activate ENaC. Die (patho-) physiologisch relevanten Proteasen für ENaC Aktivierung bleibt jedoch festgelegt werden und kann von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich. Proteasen sind dafür bekannt, bevorzugt an bestimmten Stellen in der Aminosäuresequenz spalten. So zeigt zum Beispiel die Serinprotease Chymotrypsin einer spezifischen Spaltungsmuster Spaltung nach der aromatischen Aminosäurereste Phenylalanin und Tyrosin. Im Gegensatz dazu ist die Serinprotease Trypsin spaltet bevorzugt nach der basischen Reste Lysin oder Arginin. Verwendung von mutierten menschlichen γENaC Konstrukte durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt, könnte funktionell relevante Spaltstellen in ENaC heterolog in der Eizelle Expressionssystem exprimiert 8-13 identifiziert werden. Durch Einspritzen von cRNA für die drei ENaC-Untereinheiten (αβγ) in Oozyten isoliert, kann ENaC funktionell in diesen Zellen exprimiert werden und die Aktivität der an der Plasmamembran vorhanden Kanäle gemessen werdenVerwendung der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik. Durch die Verwendung der Diuretikum Amilorid, eine spezifische ENaC-Inhibitor, den Amilorid-sensitiven ENaC-vermittelten Ganzzellstromkomponente (&amp;Dgr; I ami) von unspezifischen Leckströmen oder von Strömen von anderen Ionenkanälen geführt getrennt werden. Somit &amp;Dgr; I ami Werte beziehen Gesamt ENaC-Aktivität und durch Subtrahieren in Gegenwart von Amilorid von den in Abwesenheit von Amilorid aufgezeichnet entsprechenden Ganzzellströme gemessen Ganzzellströme bestimmt werden. Um zu testen, ob eine Protease hat eine stimulierende Wirkung auf ENaC &amp;Dgr; I ami zweimal in derselben Oocyte dh vor und nach der Inkubation der Eizelle in einer Protease enthaltenden Lösung gemessen. Ein Anstieg von &amp;Dgr; I ami von der ersten zur zweiten Messung eine proteolytische Aktivierung ENaC. Chymotrypsin oder Trypsin ist bekannt, maximal stimulieren ENaC in der Eizelle Expressionssystem 2,14 und kann verwendet werden, um Konfirm dass ENaC proteolytische Aktivierung in einer gegebenen Charge von Oozyten nachweisbar. Parallel Ganzzellstrommessungen wurde eine Biotinylierung Ansatz 9 verwendet, um zu untersuchen, ob die Zunahme &amp;Dgr; AMI detektiert bei der Belichtung von Oozyten Proteasen korreliert mit dem Aussehen des ENaC-Spaltungsfragmente an der Zelloberfläche. Proteine ​​auf der Zelloberfläche mit Biotin markiert sind und von intrazellulären Proteinen durch Bindung der biotinylierten Proteine ​​Neutravidin-Agarose-markierten Perlen abgetrennt werden. Die biotinylierten Proteinen durch Western-Blot analysiert werden. γENaC Spaltungsfragmente an der Zelloberfläche kann unter Verwendung eines spezifisch gegen ein Epitop in der C-Terminus des γENaC gerichteten Antikörper nachgewiesen werden. Funktionell relevant Spaltstelle (n) zu identifizieren, vorhergesagten Spaltstellen können durch ortsgerichtete Mutagenese mutiert werden. Wildtyp-und mutierten Kanäle in parallelen Experimenten unter Verwendung von Eizellen aus den s gegename Charge. Mit diesem methodischen Ansatz wurde es zum ersten Mal, dass die proteolytische Aktivierung von ENaC-vermittelten Ganzzellströme korreliert mit der zeitabhängigen Erscheinung ENaC-Spaltungsfragmente an der Zelloberfläche nachgewiesen. Diese Ergebnisse legen nahe, einen ursächlichen Zusammenhang zwischen Kanal Spaltung und Kanalaktivierung. Darüber hinaus unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese von mutmaßlichen Spaltungsstellen in Verbindung mit der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik, funktionell relevante Spaltstellen für Plasmin, Chymotrypsin und Cathepsin 13-S 8 identifiziert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Um zu untersuchen, ob die Serinprotease Plasmin ENaC-vermittelten Ströme aktiviert wurde &amp;Dgr; I ami einzelner ENaC-exprimierenden Oozyten vor und nach 30 min Inkubation der Eizellen in proteasefreien (Kontrolle) (Fig. 2A) oder Plasmin enthaltende Lösung (Abbildung bestimmt 2B) unter Verwendung der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Technik (siehe Fig. 1). Die Exposition gegenüber Plasmin erhöht &amp;Dgr; ami in jeder Eizelle gemessen. Im Gegensatz dazu ist in Kontrollexperimenten, 30 min Inkubation von ENaC-exprimierenden Oozyten in Protease-freie Lösung hatte einen vernachlässigbaren Effekt (Abbildung 2 C, D). Somit ist es durch Verwendung dieses Verfahrens eine Stimulation des ENaC-vermittelten Strom durch Plasmin detektiert werden. Um die Auswirkungen der Mutation von mutmaßlichen Spaltungsstellen bei der Aktivierung von ENaC-vermittelten Ströme, sowie auf Kanal Spaltung zu studieren, wurde die Wirkung von Chymotrypsin auf WT-ENaC mit diesem Vergleich aufeine Mutante ENaC mit mutiertem Prostasin und Plasmin Spaltstellen (γ RKRK178AAAA; K189A). Der Zeitverlauf der Kanalaktivierung durch Chymotrypsin sowie das Auftreten von ENaC Spaltprodukte an der Zelloberfläche wurde unter Verwendung von verschiedenen Protease Inkubationszeiten (4A) untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Mutante Kanalverzögerungen und reduziert die Aktivierung des ENaC-vermittelten Stroms durch Chymotrypsin. Dies wird durch ein verzögertes Auftreten von niedrigerem Molekulargewicht γENaC Spaltfragment von 67 kDa entspricht, der vollständig gespaltene Untereinheit parallel geschaltet. Spaltfragmente wurden unter Verwendung eines γENaC Antikörper gegen ein Epitop in der C-Terminus (Fig. 3) gerichtet sind, detektiert. Dieses methodische Vorgehen zeigt, daß der zeitliche Verlauf der proteolytischen Aktivierung des ENaC-vermittelten Strömen korreliert mit dem Auftreten einer 67-kDa-Spaltprodukt γENaC an der Zelloberfläche (Fig. 4 B, C). Dies unterstützt das Konzept einerKausalzusammenhang zwischen proteolytischen Spaltung Kanal und Kanalaktivierung 13. Darüber hinaus kann durch die Kombination von Strommessungen und die Detektion γENaC Fragmente an der Zelloberfläche wurde gezeigt, dass die mutierten Spaltstellen sind für die proteolytische Kanalaktivierungs funktionell relevant. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Verfahren zur Bestimmung des Stimulationswirkung einer Protease auf ENaC heterolog in Xenopus laevis Oozyten. ENaC-Aktivität wird durch Messen der Amilorid-sensitiven Ganzzellstromkomponente &amp;Dgr; I ami geschätzt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Abbildung 2. Plasmin stimuliert ENaC-vermittelten Währungents in Oozyten, die ENaC. (AD) ENaC menschlichen Oozyten wurden für 30 min in Protease-freie Lösung (Kontrolle) oder in Lösung Plasmin (10 ug / ml) inkubiert. (-), Um &amp;Dgr; I ami vor bestimmen und nach (+) der Inkubation wurden die Oozyten bei einem Haltepotential von -60 mV geklemmt (A, B) vier repräsentativen Ganzzellstrom Spuren von einer Charge von Oozyten.. Amilorid (AMI) war in der Badlösung vorliegenden spezifisch hemmen ENaC durch schwarze Balken dargestellt. (C) Datenpunkte von einem einzelnen Oozyten erhalten werden, die durch eine Linie verbunden. (D) Zusammenfassung der ähnliche Experimente wie in Spalte C gezeigt, darstellen relativen stimulierende Wirkung auf &amp;Dgr; ami berechnet als das Verhältnis von &amp;Dgr; ami nach 30 min Inkubation (&amp;Dgr; I ami 30 min) auf die Anfangs &amp;Dgr; ami (&amp;Dgr; I ami initial), gemessen vor der Inkubation gemessen. Zahlen in den Spalten geben dieAnzahl von einzelnen Oozyten gemessen. N gibt die Anzahl der verschiedenen Chargen von Oocyten. (Diese Zahl hat sich aus geändert worden [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> 3. Modell der γENaC Einheit zeigt Spaltungsstellen für die proteolytische Aktivierung und der Bindungsstelle des Antikörpers verwendet. Proteolytische Spaltung durch das Golgi-assoziierten Konvertase Furin ist wichtig für ENaC Reifung im Biosyntheseweg, bevor der Kanal die Plasmamembran erreicht. Nach Spaltung durch Furin ein 76 kDa-Fragment an der Zelloberfläche unter Verwendung eines Ansatzes und Biotinylierung eines Antikörpers gegen ein Epitop in der C-Terminus der γ-Untereinheit nachgewiesen werden. Die Schwenk letzte Schritt in proteolytischen ENAC-Aktivierung an der Plasmamembran, wo γENaC wird durch extrazelluläre Proteasen (z. B. Plasmin oder Chymotrypsin) in einem Bereich distal des Furinstelle was zu einem 67 kDa-Spaltfragment gespalten erfolgt wahrscheinlich. (Diese Zahl hat sich aus geändert worden [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Fig. 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Fig. 4:. Mutierende sowohl die Plasmin (K189) und die Prostasin-Spaltstelle (RKRK178) verzögert die Aktivierung des ENaC-vermittelten Ströme und das Aussehen einer 67 kDa-Spaltprodukt von γ-Untereinheit des Kanals Oozyten, WT (offene Symbole) und γ RKRK178AAAA; K189A ENaC mutierten Kanal (geschlossene Symbole) wurden für 30 min in Protease-freie Lösung (Kontrolle) oder für 5, 3 inkubiert0 oder 60 Minuten in einem Chymotrypsin-Lösung (2 &amp;mgr; g / ml) enthält. (A) um &amp;Dgr; I ami vor und nach der Inkubation zu bestimmen, wurden Oozyten bei einem Haltepotential von -60 mV geklemmt. Kreise stellen das Verhältnis von &amp;Dgr; ami gemessen nach 5, 30 oder 60 min Inkubation (&amp;Dgr; I ami min) auf die Anfangs &amp;Dgr; ami (&amp;Dgr; I ami initial) vor der Inkubation gemessen. Jeder Datenpunkt repräsentiert den Mittelwert &amp;Dgr; I ami in 22-24 einzelnen Oozyten von vier verschiedenen Chargen gemessen. (BD) Parallel zur Detektion von AMI &amp;Dgr; I die Expression von biotinylierten γENaC an der Zelloberfläche wurde durch SDS-PAGE analysiert. γENaC wurde mit einem Antikörper gegen ein Epitop in der C-Terminus des humanen γENaC detektiert. Repräsentative Western Blots von einer Charge von Oozyten gezeigt werden. (CE) Densitometrische Analyse der Western-Blots drei ähnlich denen in B oder D gezeigt für jede Bahn, die signals in den Regionen von 76 kD (offene Säulen) und 67 kD (graue Säulen) nachgewiesen wurden bestimmt und normiert auf die Summe der festgestellten Gesamtsignal. N gibt die Anzahl der verschiedenen Chargen von Eizellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Proteolytische Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) heterolog in Xenopus laevis Oozyten kann durch Kombinieren Strommessungen mit einer Biotinylierung Ansatz, um das Aussehen von Ionenkanal-Spaltprodukte an der Zelloberfläche zu untersuchen nachgewiesen werden. Funktionell wichtigen Schnittstellen können durch ortsgerichtete Mutagenese identifiziert werden.

Demonstration der proteolytischen Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) durch Kombination von Strommessungen mit Nachweis der Spaltfragmente

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K Aufrufe.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  Proteolytische Aktivierung des epithelialen Natriumkanals (ENaC) heterolog in Xenopus laevis Oozyten kann durch Kombinieren Strommessungen mit einer Biotinylierung Ansatz, um das Aussehen von Ionenkanal-Spaltprodukte an der Zelloberfläche zu untersuchen nachgewiesen werden. Funktionell wichtigen Schnittstellen können durch ortsgerichtete Mutagenese identifiziert werden. 

Serie: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

Interview: Glycolipid Antigen-Präsentation durch CD1d und das therapeutische Potenzial von NKT Zellen-Aktivierung

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Forschung

Biologie

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Demonstration von Kutane Allodynie In Vereinigung mit chronischen Unterbauchschmerzen

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Detektion von Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...