Die Autoren danken Qiuli Wang, Sprachlernzentrum, Colby College, für die technische Unterstützung bei der Videoverarbeitung und Eric Thomas, Abteilung Musik, Colby College, für die Bereitstellung der Hintergrundmusik. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources, INBRE (P20RR016463-12), dem Nationalen Institut für General Medical Sciences (P20 GM103423-12) unterstützt, Nationals Institutes of Health und Wissenschaft Abteilung Grant, Colby College (STA). JL und LWM wurden durch Zuschüsse von Sommer Scholar Fund, Colby College unterstützt.

1. Drosophila Startle-induzierte Locomotion Assay <ol><li> Die medikamentöse Behandlung <ol><li> Sedieren, um die gewünschte Anzahl immobilisieren (etwa 8-12) von 1-3 Tage alten männlichen Fliegen mit CO 2 und transportieren sie zu Fläschchen, die die Drogen ergänzt Essen. Hinweis: Eine weitere Betäubung zB Ether oder Eis verwendet, um Fliegen zu sedieren, um das Zählen und die Handhabung zu ermöglichen. </li><li> Lassen Sie Fliegen von Sedierung für 20 Minuten (oder bis zur Genesung) mit dem Fläschchen in eine horizontale Position zu erholen (um Fliegen verhindern, dass sich auf die Lebensmittel Stück) und legen Sie dann die Durchstechflasche aufrecht in einem 12 Stunden Dunkelheit, 12 Stunden Licht Brutschrank bei 25 ° C für den Rest des Experiments. </li></ol></li><li> Versuchsaufbau <ol><li> Teilen Sie diese Doppel Fläschchen Setup in drei gleiche Abschnitte von 6,33 cm durch Markierung Kreise um die Fläschchen mit einem Permanent-Marker. </li><li> Nach 3 Tagen Arzneimittelexposition, fliegt Übertragung ohne Betäubung in den Boden Fläschchen und schnell platzieren Sie die Top-Fläschchenüber der Öffnung. Kleben Sie die zwei Fläschchen zusammen mit durchsichtigem Klebeband. </li><li> Ermöglichen Fliegen an die neue Umgebung für 15 Minuten akklimatisieren. </li><li> Ort Fläschchen auf einem weißen Hintergrund und eine Digitalkamera in einem angemessenen Abstand von der Doppel Fläschchen Gerät mit einem Timer in Ansicht festgelegt. Stellen Sie sicher, die gesamte Vorrichtung in einem Bilderrahmen zu sehen ist und dass alle Fliegen sind im Fokus. Um konsistente Rahmen zwischen Studien zu erhalten, markieren Sie die Position der Kamera und Fläschchen. </li></ol></li><li> Mobilität Assay <ol><li> Sichtbar den Versuchsnummer, medikamentöse Behandlung und Timer in der Kamera-Ansicht. </li><li> Fest tippen Sie auf den Doppel Fläschchen Gerät gegen die Arbeitsplatte 3 mal und sicherzustellen, dass alle Fliegen fallen auf den Boden des Gefäßes. Gleichzeitig die Stoppuhr starten. </li><li> Alle 5 Sekunden für 1 min, ein Bild von dem Gerät. Hinweis: Alternativ könnte ein Video aufgenommen werden und blieb in angemessenen Abständen für Messungen. </li><li> Fliegen ermöglichen, für 1 min erholen ungestört. </li><li&gt; Wiederholen Sie 2 weitere Male mit 1 min Erholungszeit zwischen jedem Versuch. Hinweis: Jedes Gerät sollte 5 min zu ergreifen, um die Datenerfassung zu vervollständigen. Pflegen Sie ähnliche Kraft der Erschließung zwischen Studien. Mehrere (mindestens 3) Vorrichtung leicht gleichzeitig behandelt werden. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Überprüfen Sie Bilder und notieren Sie die Anzahl der Fliegen in jedem Abschnitt über die Zeit. Der prozentuale Anteil von Fliegen in jedem Abschnitt über die Zeit. Hinweise: Wiederholen Sie diese ganze Prozedur mit den gleichen Fliegen mit 2 oder 3 Mal Sehenswürdigkeiten, zum Beispiel, Tag 3, 5 und 7. Wenn zu viele Fliegen sterben während des Experiments ist es möglich, Scale-up der ursprünglichen Versuchsnummer zu kompensieren für die Sterblichkeit. Verwenden Sie geeignete statistische Analysen, um die Daten zu vergleichen. </li></ol></li></ol> 2. Drosophila spontane Locomotion Assay <ol><li> Nahrungszubereitung <ol><li> Rekonstituieren 3 g Instant Drosophila-Medium mit 15 ml entionisiertem Wasser und der gewünschten Rotenon(Oder ein anderes Medikament von Interesse) Dosierung. </li><li> Sobald die Nahrung Mischung fest geworden (ca. 5 min), sorgfältig zu laden das Essen auf etwa 1 cm hoch in Herstellers transparente Rohre (5 mm x 65 mm). Füge das Medikament infundiert Nahrung auf die Rohre durch die Rohre genau platzieren vertikal in der Lebensmittel-und verdrehen, bis sie mit dem Nahrungsmittel im Inneren des Rohres entfernt werden. Hinweis: Es ist hilfreich, einen Finger auf die Öffnung des Rohres Ort, um ein Vakuum zu erzeugen. Lebensmittel sollten keine Luftblasen enthalten oder eine unebene Oberfläche, wie die Fliegen können stecken bleiben. </li></ol></li><li> Versuchsaufbau <ol><li> Eine Plastikkappe an dem Ende des Rohres am nächsten zu der Nahrung. Schieben Sie die Kunststoffkappe auf dem Rohr so ​​wenig wie möglich, da es eine Luftblase in der Ampulle zu erstellen, wenn geschoben, um mit Nachdruck. </li><li> Sedate 1 Tag-alten männlichen fliegt mit CO 2 und sorgfältig legen 1 Männchen fliegen in jedes Rohr mit einem Pinsel. Wiederholen, je nach Anzahl der gewünschten Prüfungen. </li><li> Stecken Sie denEnde des Rohres am weitesten von der Nahrung mit einem kleinen Wattebausch, die Hand vom größeren Speicher aufgerollt werden kann, haben Watte. </li><li> Ermöglichen Linie mit den Rohren in einer horizontalen Position für 15 Minuten zu erholen und zu gewährleisten, dass alle Fliegen lebendig und aktiv sind. Setzen Sie die Rohre in DAM und stellen Sie sicher, dass alle Rohre sind in der gleichen Position relativ zu Damm. Anmerkung: Es ist möglich, sie mit dem Bereich der Überwachung in der Mitte der Ampulle zu platzieren, oder um alle Röhrchen zur Seite zu schieben, so dass das Ende des Rohrs überwacht wird. Hinweis: Siehe Diskussion für Variationen dieser Methode. </li></ol></li><li> Data Collection <ol><li> Legen Sie das DAM in einem 12 Stunden Dunkelheit, 12 Stunden Licht Inkubator auf 25 ° C eingestellt. Schließen Sie das DAM an die Datensammelsystem. Öffnen Sie die DAM-Software und unter Einstellungen wählen bin Länge bis 10 min. Starten Sie die Datenerfassung und damit das Programm, um Daten für 7 Tage zu sammeln. Hinweis: Bin Länge kann bei Bedarf angepasst werden. </li><li> Datenanalyse Hinweis: Prozessdie Daten, die Zählimpulse pro min als Maß für die langfristige spontane Lokomotion zu erhalten. <ol><li> Öffnen DAM Datei-Scan-Programm und Zugang Überwachungsdaten, indem Sie wählen Eingangsdaten. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Bereich und wählen Sie Monitor bin Länge bis 10-Minuten-Intervallen. </li><li> In Ausgabedateityp wählen Sie Kanal-Dateien. Lassen Sie alle anderen Optionen als Standard. </li><li> Klicken Sie auf Scan-Daten und speichern Sie in einem bestimmten Ordner. </li><li> Import von Daten in einem zirkadianen Datenanalyse-Software, um Zählungen pro min erhalten. Hinweis: Für die Datenanalyse-Software Clocklab wird häufig verwendet. Andere Optionen sind ebenfalls erhältlich. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie beschreiben wir zwei Verfahren zur Messung sowohl langfristige Fortbewegung spontane und kurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung in einer Rotenon-induzierten Drosophila Modell der Parkinson-Krankheit. Man kann auch diese Bewegungs Merkmale entfernt, um andere pharmakologische Wirkstoffe bekannt, die Parkinson-Krankheit zB Typ, Paraquat 14, genetischen Modellen der Parkinson-Krankheit beispielsweise alpha-Synuclein-Mutanten 15 und andere Flugmodelle von Erkrankungen Fortbewegung ausgesetzt zu messen. Bei beiden Methoden können alternative Methoden und Modifikationen in Betracht gezogen werden. Fliegen können mit Eis, das Einschränkungen der CO 2 Betäubung zum Beispiel Verzögerung bei der Datenerhebung zu lindern könnten CO 2-Effekt nachlassen zu lassen betäubt werden. In der Schreck-induzierten Bewegungstest, da Fliegen zeigen zirkadiane Variation der Mobilität, ist es wichtig, Daten zur gleichen Zeit die sammelnTag zwischen den Experimenten. Es ist auch wichtig, um Fliegen in die Testvorrichtung ohne Betäubung einführen. Im Gegensatz zu den meisten Schreckreaktion Bewegungs Assays, die eine Momentaufnahme des Durch einen Schwellenwert in einer vorbestimmten Zeitdauer 10,11,15,16 verlassen unserem Ansatz ähnlich schnelle iterative negativen geotaxis (Ring) 17,18 Assay überwacht die Bewegung in aufeinander mehrere Instanzen über einen Zeitraum. Dieser Ansatz der kontinuierlichen Überwachung der Verteilung von Fliegen in verschiedenen Zonen können subtile Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu lösen. Darüber hinaus kann unser Ansatz der Berechnung des Prozentsatzes von Fliegen in mehreren Zonen der Arena zu minimieren, den Beitrag der Ausreißer in den Daten. Wir haben auch beschlossen, systematisch zu welchem ​​Zeitpunkt, um Daten zu ergreifen, um den Behandlungsgruppen zu vergleichen. Nach der Einnahme von Daten alle 5 Sekunden für 1 min, aufgetragen wir die Daten und festgestellt, dass die bemerkenswertesten Unterschiede zwischen den Behandlungen konnte be bei 30 sec gesehen. Nach diesem Zeitpunkt sind die Fliegen zum Rotenon ausgesetzt Lage, für ihre Bewegungsfehler zu kompensieren. Deshalb empfehlen wir die Nutzer, den Zeitpunkt der Datenerfassung zu optimieren, um die Unterschiede zwischen ihrer Kontrolle und Experimentierkästen am besten lösen. Dieser Ansatz hat auch den Vorteil, die Bestimmung der relativen Bewegungsmangel zwischen pharmakologische Wirkstoffe und / oder genetische Modelle. Zum Beispiel kann eine toxische Chemikalie als Rotenon wichtigsten Unterschiede früher als 30 sec Zeitpunkt zu zeigen. Für die langfristige spontane Lokomotion Assay, da entfernt werden anästhesiert, um sie in die Rohre einzuführen, werden keine Daten aus der ersten 24-48 h betrachten, um die Anästhesie zu tragen Start und Akklimatisierung von Fliegen in den Monitorröhren ermöglichen. Eine weitere Überlegung für diesen Test ist die relative Position des Rohrs und der Bewegungssensor in DAM, die wir denken die spontanen Bewegungsdaten auswirken. Wir stellten den Röhrchen, die Fliegen in den Monitorso daß der Sensor aus der Lebensmittel-und nicht der Überwachung der ein Drittel Spannweite des Rohres am weitesten in der Mitte der Röhre wird normalerweise in traditionellen Verwendung von DAM in zirkadianen Studien durchgeführt. Dies erlaubte uns, die Fähigkeit der Fliegen zumindest zwei Drittel der Länge der Röhre durchqueren zu untersuchen und zu konsistenter Daten. Es ist wahrscheinlich, dass die Aktivität zählt in Rotenon-Fliegen gefüttert durch Bewegung platzt und / oder Zucken Phänotyp beeinflusst werden. Andere mögliche Störfaktoren für die Aktivitätszählungen könnte ein Geschmacks-und / oder Geruchsaversion / Anziehung zu Rotenon und anderen Chemikalien von Interesse für den Nutzer sein. Daher zusätzliche Video Tracking 17,19 können eingesetzt werden, um die DAM Daten für eine gründliche Analyse der Fortbewegung Phänotyp zu ergänzen. In einem Szenario, in dem Versuchsfliegen ähnliche Aktivitätszählungen im Vergleich zu Kontrollfliegen, ist es möglich, dass sie in dem zirkadianen Verteilung der Bewegung, da f abweichenLügen sind aktiver um Licht an / aus und aus / ein Übergang in einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden. Daher wäre es hilfreich, die Zählimpulse pro min zu mehreren Zeitpunkten und Behälterlängen in einem Zeitraum von 24 Stunden, um die genaue Verteilung der Fortbewegung zu bestimmen. Abschließend wird dieser Test aufgrund seiner Fähigkeit, Bewegungseigenschaften nicht zu Bewegungen in Reaktion darauf beschränkt zu erschrecken beurteilen, neue Einblicke in Bewegungsfehlern und Charakterisierung von Lösungsstrategien.

Fortbewegungsmangel sind ein Hauptsymptom der Parkinson-Krankheit und sind weitgehend durch Verschlechterung der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra 1 verursacht. Rotenon ist ein Insektizid, das Keton eingehend untersucht worden ist, um die Parkinson-motorische Defizite in Drosophila 2-6 modellieren. Rotenon verursacht oxidativen Schäden durch die Blockierung der oxidativen Phosphorylierung Weg, die letztlich zum Zelltod 7. Dopaminergen Neuronen sind anfälliger für Rotenon Toxizität, so dass die Auswirkungen der chemischen hauptsächlich Motors auf 2,7. Durch die Induktion Symptome des Morbus Parkinson in Fliegen, können wir besser verstehen, die Krankheit und ihre Symptome zu beheben 6,8-11. Drosophila bietet ein gutes Modell für die Untersuchung dieser Effekt, weil sie genetisch manipulierbaren, leicht zu pflegen sind, und haben einen schnellen Lebenszyklus. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Rotenon verursacht kurzfristige Schreck-induzierteFortbewegung Mängel in Drosophila -Wenn Fliegen werden auf Rotenon-Lebensmittel ergänzt gehalten, zeigen sie eine langsamere Reaktion nach negativen geotactic Schreck 2-6. Ihr Versagen, nach oben in einem Fläschchen Gerät so schnell wie Steuer Studien klettern ist bezeichnend für Schreck-induzierten Bewegungsfehler. Die Wirkung von Rotenon auf langfristige, ist spontane Bewegung nicht gut beschrieben. Drosophila Aktivitätsmonitore (Dämme) erfolgreich verwendet, um Bewegung in Drosophila zirkadianen Rhythmus zu überwachen studiert 12,13. Fliegen werden in Einzelrohre, die in das DAM geladen angeordnet. Diese Vorrichtung ist mit einem Infrarotsensor, der die Anzahl von Malen eine Fliege bricht den Infrarotstrahl zählt ausgestattet. Diese Zählwerte können als Maß für die ungestörte Fortbewegung und Aktivität 12,13 verwendet werden. Durch die Platzierung Fliegen in einer DAM, kann die Wirkung von Rotenon auf ihre langfristige Fortbewegung charakterisiert werden. Diese Studie beschreibt die Methoden zum MessenUre kurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung und langfristige spontane Fortbewegung, um die Auswirkungen von Rotenon vermittelten motorischen Defiziten besser zu verstehen. Charakterisierung von Bewegungsmangel imitiert Parkinson-Krankheit sind wichtig, weil sie es erlauben, die Untersuchung von anderen Verbindungen, die diese Bewegungsfehler der Rückwärtsgang kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="628">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Standard narrow vials</td>
			<td style="width:127px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">32-120</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Rotenone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8875</td>
			<td>Store in freezer, make fresh for each experiment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td>Solvent for rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Instant Drosophila medium</td>
			<td style="width:127px;">Carolina Biological&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Formula 4-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Drosophila activity monitor (DAM)</td>
			<td style="width:127px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">DAM2</td>
			<td>trikinetics.com</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DAM tubes</td>
			<td style="width:127px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">Tubes 5X65 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Recipe for Rotenone +food (125 mM dose)</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to characterize spontaneous and startle-induced locomotion in a rotenone-induced parkinson's disease model of drosophila

Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen führt das Zentralnervensystem, vor allem in der Substantia nigra. Die Krankheit verursacht motorischen Defiziten, die als Steifigkeit, Zittern und Demenz bei Menschen zu präsentieren. Rotenon ist ein Insektizid, das oxidative Schäden verursacht durch die Hemmung der Funktion der Elektronentransportkette in den Mitochondrien. Es wird auch zur Behandlung der Parkinson-Krankheit in Drosophila zu modellieren. Fliegen haben eine inhärente negativen geotactic Antwort, die sie nach oben zu klettern, auf Erschrecken zwingt. Es wurde festgestellt, dass Rotenon verursacht frühe Sterblichkeit und Mängel, die Fortbewegung der Fliegen Fähigkeit zu klettern, nachdem sie zuvor nach unten geklopft zu stören. Jedoch ist die Wirkung auf die spontane Bewegung Rotenon nicht gut dokumentiert. Diese Studie beschreibt zwei empfindliche, reproduzierbare und Hochdurchsatz-Assays Rotenon-induzierten Mängel kennzeichnenkurzfristige Schreck-induzierten Fortbewegung und langfristige spontane Fortbewegung in Drosophila. Diese Assays können leicht angepasst, um andere Drosophila Modelle von Bewegungsfehlern und Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln zu charakterisieren.

Drosophila Startle-induzierte Locomotion Assay Wildtyp-, Kantons-S, zeigte Fliegen eine robuste negativen geotactic Reaktion mit nur etwa 88% und 5% der Fliegen in den oberen und unteren Abschnitten jeweils der Doppel Fläschchen Gerät nach 30 sec (Abbildung 1). Fliegen bis 125 um und 250 um Rotenon für 3 Tage ausgesetzt waren, zeigten einen leichten Rückgang in der Anzahl der Fliegen im oberen Bereich und eine leichte Erhöhung der Anzahl der Fliegen im unteren Bereich. Fliegen bis 500 um Rotenon ausgesetzt waren, zeigten signifikante Fehler in der negativen Antwort geotactic (p &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich), wie durch weniger Fliegen im oberen Abschnitt und mehr Fliegen in Bodensektion belegt im Vergleich zu Fliegen (Abbildung 1) zu steuern. Dieser Defekt in negativer geotactic Reaktion aufgrund der Unfähigkeit, schnell in der Vorrichtung zu klettern ist ein Hinweis auf einen Defekt in Schreck-inreduziert Fortbewegung. Drosophila spontane Locomotion Assay Wildtyp-, Kantons-S, zeigte Fliegen 0,57 Impulse pro Minute als Maß für spontane Mobilität am vierten Tag in der DAM (Abbildung 2). Fliegen bis 125 um Rotenon ausgesetzt waren, zeigten ein ähnliches Niveau der spontanen Fortbewegung. Im Gegensatz dazu fliegt zu 250 uM ausgesetzt und 500 uM Rotenon zeigte, dass etwa 50% niedriger Maßnahmen (p &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich) der spontanen Fortbewegung (Abbildung 2). Diese Fliegen bewegt bei etwa 0,20 Zählungen pro Minute, was auf eine Rotenon-induzierten Defekts in spontane Lokomotion ist. Um für die erste Diskrepanzen (falls vorhanden) in der Fortbewegung nicht durch Rotenon Exposition verursacht ausmachen, abgezogen wir Fortbewegungsdaten zwischen Tag 4 und Tag 3. Kontrolllinie zeigten einen Anstieg von etwa 0,1 Impulse pro Minute in spontaneoFortbewegung zwischen uns Tage, während Fliegen bis 125 um Rotenon ausgesetzt zeigte einen leichten Rückgang von etwa 0,15 Impulse pro Minute (Abbildung 3). Fliegen auf 250 um und 500 um Rotenon ausgesetzt angezeigt mehr schwerwiegende Abnahme der Fortbewegung zwischen den Tagen, mit Unterschieden ungefähr 0,3 und 0,5 (p &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich) zählt pro Minute. Diese Daten legen nahe, einen Mangel in der spontanen Fortbewegung im Laufe der Zeit mit der Exposition gegen Rotenon und bestätigt einzigen Tag Analyse oben erwähnt - Fliegen zu höheren Dosierungen von Rotenon ausgesetzt waren, zeigten eine Abnahme der spontanen Fortbewegung. Zusammengenommen sind diese Methoden zuverlässig Rotenon-induzierten Mängel messen spontan und erschrecken-induzierten Fortbewegung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Startle-induzierte Lokomotion Grundstück vonFliegen steigenden Dosen von Rotenon ausgesetzt. Wildtyp-, Kantons-S, wurden männlichen Fliegen auf verschiedene Dosierungen von Rotenon für 3 Tage und überlebenden Fliegen (8-12) ausgesetzt wurden dann in den Boden der Fläschchen Doppelgerät abgegriffen. Fliegen bis 500 um Rotenon ausgesetzt zeigen eine signifikante Abnahme der Prozent von Fliegen in der oberen (A) und Erhöhung der Prozent der Fliegen im unteren Bereich (B) des Gerätes nach 30 sek. Dies ist bezeichnend für einen Mangel an Schreckreaktion bei Fliegen zu Rotenon ausgesetzt. Die Säulen stellen den durchschnittlichen Prozentsatz von 6 unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Spontane Fortbewegung Grundstück von Fliegen zu steigender Dosis ausgesetzts von Rotenon. Wildtyp-, Kantons-S, wurden männlichen Fliegen auf verschiedene Dosierungen von Rotenon und zählt pro min am vierten Tag nach der Exposition ausgesetzt wurden aufgetragen. Zählungen wurden in einem DAM gemessen. Fliegen auf 250 um und 500 um Rotenon ausgesetzt zeigen eine Reduktion in Zählungen pro min. Dies weist auf einen Mangel an spontane Lokomotion Fliegen Rotenon ausgesetzt. Spalten die durchschnittliche Zählungen pro min auf den vierten Tag der 5 unabhängige Studien. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51625/51625fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Veränderung der spontanen Bewegungs Grundstück von Fliegen zu steigenden Dosierungen von Rotenon ausgesetzt. Wildtyp-, Kantons-S, wurden männlichen Fliegen auf verschiedene Dosierungen von Rotenon und die Differenz in Zählungen pro min o ausgesetztn der dritten und vierten Tag nach der Exposition wurden aufgetragen. Zählungen wurden in einem DAM gemessen. Es ist eine dosisabhängige Trend für Rückgang der spontanen Fortbewegung mit Fliegen zu höheren Dosen, die eine weitere negative Veränderung der Fortbewegung ausgesetzt. Dies weist auf eine Abnahme der Bewegung. Spalten repräsentieren die durchschnittliche Veränderung der Fortbewegung pro Minute aus 5 unabhängigen Studien. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert; * P &lt;0,05 ANOVA, Bonferroni paarweisen Vergleich.

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Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen im Zentralnervensystem führt, wodurch Bewegungsfehler. Rotenon Modellen der Parkinson-Krankheit in Drosophila. In diesem Dokument werden zwei Tests, die sowohl spontan als auch erschrecken-induzierten Bewegungsmangel durch Rotenon verursacht charakterisieren.

Methoden zur Charakterisierung Spontan und Startle-induzierte Locomotion in einer Rotenon-induzierten Parkinson-Krankheit Modell der<em&gt; Drosophila</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

methods-to-characterize-spontaneous-startle-induced-locomotion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

10.0K Aufrufe.  Colby College.  Parkinson-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die aus der Degeneration der dopaminergen Neuronen im Zentralnervensystem führt, wodurch Bewegungsfehler. Rotenon Modellen der Parkinson-Krankheit in Drosophila. In diesem Dokument werden zwei Tests, die sowohl spontan als auch erschrecken-induzierten Bewegungsmangel durch Rotenon verursacht charakterisieren. 

Serie: Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model. While ICH
accounts for 10-15% of all strokes, there remains no specific
effective therapy. The autologous blood injection model in mice
involves the stereotaxic injection of arterial blood into the basal
ganglia mimicking a spontaneous hypertensive hemorrhage in man. The
response to hemorrhage can then be studied in vivo and the
neurobehavioral deficits quantified, allowing for description of the
ensuing pathology and the testing of potential therapeutic agents. The
procedure described in this protocol uses the double injection
technique to minimize risk of blood reflux up the needle track, no
anticoagulants in the pumping system, and eliminates all dead space
and expandable tubing in the system.

The autologous blood injection model of intracerebral hemorrhage in mice described in this protocol uses the double injection technique to minimize risk of blood reflux up the needle track, no anticoagulants in the pumping system, and eliminates all dead space and expandable tubing in the system.

Eigenblut Injection zu Spontane intrazerebrale Blutungen in Mäuse-Modell

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx due to the abnormal activation of glutamate receptors results in DA excitotoxicity and has been identified as an important mechanism for DA neuron loss. In this study, we isolate, dissociate, and culture midbrain neurons from the mouse ventral mesencephalon (VM) of ED14 mouse embryos. We then infect the long-term primary mouse midbrain cultures with an adeno-associated virus (AAV) expressing a genetically encoded calcium indicator, GCaMP6f under control of the human neuron-specific synapsin promoter, hSyn. Using live confocal imaging, we show that cultured mouse midbrain neurons display spontaneous Ca2+ fluxes detected by AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath application of glutamate to midbrain cultures causes abnormal elevations in intracellular Ca2+ within neurons and this is accompanied by caspase-3 activation in DA neurons, as demonstrated by immunostaining. The techniques to identify glutamate-mediated apoptosis in primary mouse DA neurons have important applications for the high content screening of drugs that preserve DA neuron health.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Here we present a protocol to measure in vitro Ca2+ fluxes in midbrain neurons and their downstream effects on caspase-3 using primary mouse midbrain cultures. This model can be employed to study pathophysiologic changes related to abnormal Ca2+ activity in midbrain neurons, and to screen novel therapeutics for anti-apoptotic properties.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta. Gait abnormalities, including decreased arm swing, slower walking speed, and shorter steps are common in PD patients and appear early in the course of disease. Thus, the quantification of motor patterns in animal models of PD will be important for phenotypic characterization during disease course and upon therapeutic treatment. Most cases of PD are idiopathic; however, the identification of hereditary forms of PD uncovered gene mutations and variants, such as loss-of-function mutations in Pink1 and Parkin, two proteins involved in mitochondrial quality control that could be harnessed to create animal models. While mice are resistant to neurodegeneration upon loss of Pink1 and Parkin (single and combined deletion), in rats, Pink1 but not Parkin deficiency leads to nigral DA neuron loss and motor impairment. Here, we report the utility of FTIR imaging to uncover gait changes in freely walking young (2 months of age) male rats with combined loss of Pink1 and Parkin prior to the development of gross visually apparent motor abnormality as these rats age (observed at 4-6 months), characterized by hindlimb dragging as previously reported in Pink1 knockout (KO) rats.

Here we describe the RatWalker system, built by redesigning the MouseWalker apparatus to accommodate for the increased size and weight of rats. This system uses frustrated total internal reflection (FTIR), high-speed video capture, and open-access analysis software to track and quantify gait parameters.

Anwendung des RatWalker-Systems zur Ganganalyse in einem genetischen Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) and dopaminergic striatal deficit. Animal models have been widely used to simulate human pathology in the laboratory. Rodents are the most used animal models for PD due to their ease of handling and maintenance. Moreover, the anatomy and molecular, cellular, and pharmacological mechanisms of PD are similar in rodents and humans. The infusion of the neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), into a medial forebrain bundle (MFB) of rats reproduces the severe destruction of dopaminergic neurons and simulates PD symptoms. This protocol demonstrates how to perform the unilateral microinjection of 6-OHDA in the MFB in a rat model of PD and shows the motor deficits induced by 6-OHDA and predicted dopaminergic lesions through the stepping test. The 6-OHDA causes significant impairment in the number of steps performed with the contralateral forelimb.

The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model has been used for decades to advance the understanding of Parkinson's Disease. In this protocol, we demonstrate how to perform unilateral nigrostriatal lesions in the rat by injecting 6-OHDA in the medial forebrain bundle, assess motor deficits, and predict lesions using the stepping test.

Das 6-Hydroxydopamin-Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...

Methoden zur Charakterisierung Spontan und Startle-induzierte Locomotion in einer Rotenon-induzierten Parkinson-Krankheit Modell der

Zusammenfassung

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Eigenblut Injection zu Spontane intrazerebrale Blutungen in Mäuse-Modell

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in

In Vivo Einzelmolekül-Tracking bei Drosophila präsynaptischen motorischen Nerv Terminal

Quantifizierung von Spontan-Ca^2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Anwendung des RatWalker-Systems zur Ganganalyse in einem genetischen Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Das 6-Hydroxydopamin-Rattenmodell der Parkinson-Krankheit