Die Autoren bedanken sich bei Dr. Charles Luetje für die Bereitstellung des T-Labyrinth und das Verhalten Zimmer zu danken. Diese Arbeit wird von der American Heart Association (an YA), dem Nationalen Institut für neurologische Erkrankung und Schlaganfall Stipendium R01NS64269 (auf RGZ) und der Pew Charitable Trust (auf RGZ) unterstützt.

1. Einführung In diesem Video werden wir zeigen zwei Verhaltens-Assays mit Drosophila, um die Messung der Fortbewegung und Lernen und Gedächtnis-Funktionen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen gefährdet sind nachzuweisen. Zunächst werden wir zeigen, wie Bewegungsapparates Verhalten gemessen werden kann mit dem negativen Geotaxis Assay werden. Zweitens werden wir beurteilen, Lern-und Gedächtnisleistung mit positiv-phototaktischen Fliegen, die geschult, um Licht mit einem aversiven bitteren Geschmack assoziieren und dann 6 Stunden später, um Speicher-Funktionen beurteilen getestet. Schließlich diskutieren wir die Auswirkungen und Grenzen dieser Verhalten Assays. 2. Geräte und Reagenzien <ol><li> Fly Arbeit <ul><li> Stereo-umfang (Zeiss) </li><li> Kleine Pinsel zum Schieben Fliegen </li><li> Drosophila Kohlendioxid (CO 2) Narkosegerät (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Negative Geotaxis Assay <ul><li> 28,5 x 95 mm Polystyrol Vial (Capitol Vial, Inc.) </li><li> Mini-Alarm Timer / Stoppuhr (VWR International) </li><li> Sharpie Stifte </li><li> Klebeband </li></ul></li><li> Aversive Phototaxis Suppression Assay <ul><li> Chininhydrochlorid (Sigma Aldrich, CAS-Nummer: 6119-47-7) </li><li> Destilliertes Wasser </li><li> Digitale Mess-Skala für präzise Verdünnung Gew. </li><li> Quick Disconnect Stecker, High-Density Polyethylen (NALGENE VWR Katalog Nr. 62868-021) </li><li> 15 ml Zentrifugenröhrchen (VWR International), an der 2 mL-Marke aus geschlossenen Ende geschnitten, um mit der Quick Disconnect Stecker-Adapter für Lichtquelle fit </li><li> Single-Channel-200 ul Pipette auf Chinin-Lösung auf Filterpapier Auskleidung der Kammer Last </li><li> T-Maze (Simple Behavioral Systems; Abbildung 1) </li><li> Aluminiumfolie </li><li> Light Source (Zeiss) </li><li> Eine Lampe mit rotem Licht. </li><li> Filterpapier </li><li> Mini-Alarm Timer / Stoppuhr (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Vorbereitung der Fliegen <ul><li> Fliegen sind auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei 25 ° C auf einem 12 h Licht / Dunkel-Zyklus. </li><li> Virgin Fliegen sind unter Kohlendioxid Anästhesie am Tag der eclosion isoliert. Für Aging-Studien sind Fliegen in Gruppen von jeweils zwanzig pro Fläschchen gepflegt und in ein frisches Gefäß alle 3 Tage. Es ist wichtig, Geschwister fliegt aus der gleichen elterlichen Kreuz für ältere Studien zu verwenden, um Differenzen aus genetischen Hintergründen zu minimieren. </li><li> Für beide Assays sind Fliegen sexed und in Gruppen von zehn Fliegen pro Flasche gehalten. Der Unterschied zwischen den Geschlechtern auf das Verhalten ist bezeichnend und es ist ratsam, nicht zu männlichen und weiblichen Fliegen in einer Studie Mix Daten könnte schwierig sein, zu interpretieren und zu reproduzieren 6. </li><li> Für negative Geotaxis Assay, sind Fliegen in Gruppen von zehn pro Fläschchen sortiert und geprüft 1 Stunde nach der Narkose. Es ist wichtig für Fliegen vollständig zu erholen, um aus der Narkose, da dies einen Einfluss auf Bewegungsapparates Aktivitäten haben könnten. </li><li> Für APS-Assay werden fliegt jeder Gruppe in eine leere Flasche aus Polystyrol mit Wasser gelegt angefeuchtetem Filterpapier für 6 Stunden vor dem Test durchgeführt wird. Dies gewährleistet, dass die Fliegen vor dem Test sind verhungert und wird aufmerksamer auf aversive Geschmack. Kurz bevor der Test durchgeführt wird, wird jede Fliege aus einer Gruppe von zehn in eine leere 15ml-Zentrifugenröhrchen, die dann verschlossen wird locker, die Flucht zu verhindern platziert. </li></ul> 4. Negative Geotaxis Assay <ul><li> Geotaxis ist in der Regel für 10 bis 20 Gruppen von zehn Individuen der gleichen Genotyp oder Behandlung (100-200 fliegt insgesamt für jeden Genotyp / Behandlung) 7 gemessen. Sortieren Gruppen von zehn weiblichen oder männlichen Fliegen auf einen CO 2-Narkosegerät und Ort jeder Gruppe in einem separaten Gefäß. Warten Sie mindestens eine Stunde für die Fliegen aus der Narkose zu erholen. </li><li> Bereiten Sie das Klettern Gerät für jede Gruppe, so dass zwei leere Polystyrol Röhrchen vertikal durch Tonband nach miteinander verbunden. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Öffnungen der Gefäße sind perfekt aufeinander abgestimmt, um eine gleichmäßige Kletterfläche für das Fliegen bieten. </li><li> Für die untere Flasche, messen einem vertikalen Abstand von 8 cm über der Bodenoberfläche und markieren jedes Fläschchen durch Zeichnen eines Kreises um den gesamten Umfang des Fläschchens. </li><li> Übertragen einer Gruppe von zehn fliegt in die untere Flasche sorgfältig verhindert das Entweichen von jeder fliegen. Unmittelbar decken den unteren Fläschchen mit der Spitze Fläschchen und Band sicher in der Nähe der Kontaktaufnahme mit Öffnungen. Lassen Sie die Fliegen um die neue Einstellung für 1 Minute vor Durchführung des Tests zu akklimatisieren. </li><li> Klopfen Sie leicht die Fliegen auf den Boden des Fläschchens und messen Sie die Anzahl der Fliegen, die über den 8-cm-Marke um 10 Sekunden steigen, nachdem das Leitungswasser kann. </li><li> Wiederholen Sie diesen Test für die gleiche Gruppe zehnmal, so dass für 1 Minute Pause zwischen den einzelnen Studien. </li><li> Notieren Sie die Anzahl der Fliegen pro Gruppe, dass die 8-cm-Markierung als bestandenProzentsatz der gesamten Fliegen. </li></ul> 5. Aversive Phototaxis Suppression Assay (APS Assay) Ursprünglich aus Le Bourg und Buecher (2002) 4 angepasst, nutzt dieses Tests die positive phototaktischen Verhalten bei Fliegen zu schulen, um Licht mit aversive Reize (in diesem Fall, bitteren Geschmack von Chinin) zu verknüpfen. Nach einer Ausbildung / Klimaanlage Phase wird Wildtyp-Fliegen in der Lage sein den beleuchteten Bereich mit aversiven Geschmack assoziieren und vermeiden Sie es. Fliegen mit eingeschränkter Lernfähigkeit wird fehlschlagen, um diese Zuordnung zu machen. Darüber hinaus die APS-Test kann auch verwendet werden, um das Kurzzeitgedächtnis Funktion messen fliegt 5, indem bereits ausgebildete fliegt der gleiche Test 6 Stunden nach der Konditionierung auf ihre Fähigkeit, in Erinnerung an die Aufgabe gelernt zu testen. <ol><li> Vorbereiten des Chinin-Lösung <ul><li> Lösen Sie Chininhydrochlorid in destilliertem Wasser zu einer 0,1 M Stammlösung (1.98g in 50 mL destilliertem Wasser) zu machen. Die Stammlösung kann bei -20 ° C aufbewahrt werden bis zu einem Jahr in kleinen Portionen </li><li> Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von 1 uM durch Verdünnen der Stammlösung mit destilliertem Wasser. </li></ul></li><li> Vorbereiten des T-Maze <ul><li> T-Labyrinth besteht aus der mittleren Spalte mit der Falltür und zwei getrennten Kammern, eine &quot;dunkle&quot; Kammer und eine &quot;brennende&quot; Kammer (Abbildung 1). </li><li> Chamber Zubereitung: Nehmen Sie zwei 15ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen und schneiden bei 2 mL-Marke von unten geschlossenen Ende mit einer Handsäge. Setzen Sie den Stecker-Adapter an jedem Ende, und versiegeln Sie die Verbindung mit Parafilm. Der Adapter am Ende der Röhre dient als Eingang Slot für den Schwanenhals Lichtquelle. Verbinden Sie einen Schlauch mit der Lichtquelle und dieses Rohr wird das &quot;brennende&quot; Kammer werden. Wickeln Sie das andere Rohr mit Alu-Folie, die als &quot;dunkel&quot; Kammer dienen. </li><li> Add 180uL entweder destilliertes Wasser oder Chinin-Lösung, um Papier und in das Licht Kammerfilterpresse. </li><li> Montieren Sie die T-Labyrinth durch Aufschrauben der beleuchteten und dunklen Kammern auf jeder Seite der mittleren Spalte mit der Falltür in der Mitte geschlossen (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie die Lichtquelle in der beleuchteten Kammer. </li></ul></li><li> Ausbildung fliegt Phototaxis mit aversive Reize zu unterdrücken <ul><li> Lösen Sie die dunkle Kammer von der T-Labyrinth und übertragen eine einzige Fliege in diese Kammer und sofort Schraube der dunklen Röhre zurück, um das Labyrinth. </li><li> Schalten Sie das Licht in den Raum und schalten Sie die rote Lampe. </li><li> Lassen Sie die fliegen in die dunkle Kammer für 30 Sekunden zu gewöhnen und langsam auf die Lichtquelle beleuchtet die beleuchtete Kammer wenden. Langsam öffne die Falltür, dass die beiden Kammern trennt. </li><li> Wenn die Fliege geht zur beleuchteten Kammer innerhalb von 10 Sekunden, wird es als positiv phototaktisch und ist bereit, für den Test geschult werden. Failure in Phototaxis zeigt Probleme in das visuelle System und fliegt mit negativen Phototaxis aus dem Test ausgeschlossen werden müssen. </li><li> Für Aversive Phototaxis Suppression (APS) Ausbildung, tippen Sie auf die Fliege, die positive Phototaxis zeigte wieder auf die dunkle Kammer, in der Nähe der Klappe und das Licht auszuschalten. Lassen Sie 30 Sekunden akklimatisieren. Während dieser Zeit legte Filterpapier mit Chinin-Lösung in den beleuchteten Kammer. Langsam öffne die Falltür und schalten das Licht an. Lassen Sie die Fliege zu Fuß in die Chinin beschichtet beleuchteten Kammer. Nach einer Minute, tippen Sie auf die Fliege zurück in die dunkle Kammer und wiederholen Sie diesen 9 weitere Male. (In der Regel fliegt Wildtyp vermeiden beleuchteten Kammer nach 3 bis 5 Trainings-Studien.) </li><li> Unmittelbar nach dem Training werden fünf Testreihen durchgeführt werden. In jedem Test-Studie erlauben 10 Sekunden nach dem Licht ist für die Ausbildung zu fliegen, um den beleuchteten Kammer Spaziergang gemacht. Ein Verstoß gegen die brennende Flasche gehen wird als &quot;Pass&quot;, der gleichbedeutend mit &quot;Aufgabe durch Verstärkung gelernt&quot; aufgezeichnet werden. Die Pass-Rate über fünf aufeinanderfolgende Versuche aufgezeichnet und unten in Abbildung 2 als PC0 (0 Stunden nach Konditionierung) gezeigt. </li></ul></li><li> Die Beurteilung Short-Term Memory-Funktion in Flies <ul><li> Nach seiner Ausbildung und ersten PC0 Aufnahmen ist jede Fliege wieder in seine ursprüngliche Nahrung Flasche gelegt und beiseite stellen für sechs Stunden. </li><li> Sechs Stunden nach dem Training unterziehen alle fliegen nach 5 Versuchen wieder in der gleichen Weise wie zuvor, und notieren Sie die Anzahl der Male-the-fly vermeidet (pass) oder geht in (fail) die beleuchtete Durchstechflasche. Diese Erfolgsquote ist als PC6 (6 Stunden post Konditionierung), die ein Indikator für das Kurzzeitgedächtnis wird aufgezeichnet. </li></ul></li></ol> 6. Interpretation der Daten und statistische Analyse <ol><li> Negative Geotaxis Assay <ul><li> Die Rohdaten aus diesem Test erzeugt repräsentiert die Anzahl der Fliegen über den 8-cm-Marke in 10 Sekunden in jeder Gruppe. Wandeln Sie diese in Prozent und berechnet die durchschnittliche Erfolgsquote für jede Gruppe über 10 Sitzungen. </li><li> Die Daten werden grafisch als eine durchschnittliche Erfolgsquote pro Gruppe (Genotyp, Behandlung etc.) mit dem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. </li><li> Unterschiede zwischen den Gruppenkann dann bestimmt werden statistisch signifikant ist oder nicht mit einem Student T-Test oder ANOVA werden. </li></ul></li><li> Aversive Phototaxis Suppression Assay <ul><li> Die Rohdaten aus diesem Test ist als die Anzahl der jeweils zu fliegen vermeidet die beleuchteten Kammer, in fünf aufeinander folgenden Studien vertreten. Die Erfolgsquote ist als der Prozentsatz der erfolgreichen Vermeidung Studien über die gesamte Studien berechnet. Berechnen Sie die durchschnittliche Erfolgsquote auf diese Weise für ein Minimum von 15 Fliegen pro Gruppe. </li><li> Oder durchschnittliche Erfolgsquote PC6 (6 Stunden nach der Konditionierung, &quot;Speicher&quot;-Anzeige) mit den jeweiligen SEM; Daten werden grafisch als durchschnittliche Erfolgsquote PC0 (&quot;learning&quot;-Anzeige unmittelbar nach der Konditionierung) vertreten. </li><li> Lernen und Gedächtnis-Indizes sind zwischen den Gruppen mit beiden Wildtyp und &quot;genmanipulierte-gutartig&quot;-Gruppe (z. B. GFP überexprimierenden Fliegen) entsprechend verglichen. </li></ul></li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse In diesem Video-Experiment werden wir die Beurteilung Lernen und Gedächtnis und motorische Defizite in Fliegen überexprimierenden menschlichen Tau in das zentrale Nervensystem und den Vergleich ihrer Leistung mit denen von Fliegen überexprimierenden GFP. Neuronale Überexpression des menschlichen Tau in Drosophila wurde gezeigt, dass schwere Vakuolisierung im Gehirn 8 verursachen und zu erheblichen Defiziten in Lern-und Gedächtnisfunktionen 9. Wie in Abbildung 2A gezeigt, fliegt 10 Tage alten männlichen oder weiblichen überexprimierenden menschlichen Tau haben erhebliche Defizite im Vergleich zu Bewegungsapparates gleichaltrigen GFP überexprimierenden Fliegen. Darüber hinaus sind diese Fliegen, um Licht mit bitterem Geschmack assoziieren wie PC0 Erfolgsquote im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt gescheitert, ebenso wie nicht zu dieser Vereinigung erinnern, als durch einen Rückgang in PC6 Erfolgsquote (Abbildung 2B) dargestellt. Dieses Experiment ist eine weitere Bestätigung, dass Drosophila-Modelle für das Studium der menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen und rekapituliert einige der Verhaltens-Phänotypen bei Menschen und Säugetieren beobachtet verwendet werden kann. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. T-Maze-Setup für Aversive Phototaxis Suppression Assay. A. Der gesamte Versuchsaufbau für die APSA Experiment mit der Lichtquelle verbunden, die &quot;brennende&quot; Falcon-Röhrchen, mit Filterpapier und die &quot;dunkle&quot; tube auf der linken Seite (die in Folie) ausgekleidet, durch eine Falltür getrennt. B. Während des Trainings-und Testphase, ist die Fliege in die dunkle Kammer und die Falltür geöffnet, nachdem das Licht auf in der beleuchteten Kammer eingeschaltet. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus dem negativen Geotaxis und APS Experiment mit Fliegen überexprimierenden GFP oder Tau mit einem pan-neuronalen Fahrer. A. In der negativen Geotaxis Assay, 10-Tage alten männlichen (blaue Säule) oder weiblich (rote Säule) fliegt überexprimierenden GFP zeigten höhere Klettern Aktivität als Tau-überexprimierenden Fliegen. B. 20-Tage alte weibliche Fliegen überexprimierenden GFP zeigten besseres Lernen (PC0) und Speicher (PC6) Funktionen als Tau überexprimierenden Fliegen.

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Beide negativen Geotaxis und APS-Assays sind robust Verhaltens-Assays auf Veränderungen in der Bewegungsorgane oder Lern-und Speicherkapazitäten aus genetischer oder umweltbedingter Manipulation zu messen. Es gibt jedoch einige Nachteile auf diese Tests, die eine weitere Optimierung zu erwarten. In negativen Geotaxis Assay können Mutationen in bestimmten Genen schweren motorischen Dysfunktionen bei Fliegen zu machen. In solchen Fällen können die Fliegen kaum klettern die Wände in Reaktion auf die Schwerkraft auf Agitation. Andere Verhaltens-Assays, welche direkt zu messen Bewegung besser geeignet sein können. Diese Tests umfassen Gleichgewichtsreflexes Verhalten, Lähmungen und Beschlagnahme 10 und optomotorischen Verhalten 11, Verlust der Bewegungskoordination Aufzeichnungen Maßnahmen. In APS-Assay kann das erste Hindernis fliegt zufällig stoppen am Eingang der beleuchteten Kammer ohne sich zu bewegen nach vorn. Das wird eher ein Problem, wenn Altern ist eine der Bedingungen untersucht, da ältere fliegt weniger aktiv im allgemeinen und neigen dazu, zu stoppen und für längere Zeit ruhen. In diesem Fall wird der Experimentator hat auf mechanische Reize bieten, um eine Bewegung, die nicht immer effektiv zu fördern. Zweitens könnte man argumentieren, dass die Nichteinhaltung der beleuchteten Kammer ergibt sich aus einem Verlust von positiven Phototaxis gehen. Dies ist selten der Fall, da bisherige Arbeit hat gezeigt, dass Fliegen wieder einzuschalten, um Licht reagieren, wenn die negative Verstärkung 4 entfernt ist. Drittens kann die Dauer des Kontakts mit dem aversiven Reiz von Versuch zu Versuch variieren. Diese Variante kann in der Regel durch Einkreisen der Innenwand der Kammer mit getränkten Filterpapier, um Fliegen aus der Vermeidung von Chinin zu verhindern reduziert werden. Darüber hinaus kann der Experimentator sicherzustellen, dass jeder Flug genügend Zeit in Kontakt mit dem Filterpapier zu verbringen, indem die Menge an Zeit in der Kammer aus dem nichts anderes angegeben ist 1 Minute verbrachte. Zusammenfassend sind negativ Geotaxis und APS-Assays eine schnelle und einfache Methode zur Bewertung der Verhaltensdefiziten und quantitativ deuten Bewegungs-und Lern-und Gedächtnisleistung in Drosophila. Diese Assays sind besonders nützlich bei der Modellierung menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materialien </th><th> Firma </th><th> Catalog Number </th><th> Kommentar </th></tr><tr><td> Polystyrol Vial </td><td> Capitol Vial, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 mm Polystyrol Vial; Materialqualität wichtig, schlimm, wenn zu rutschig für Fliegen zu klettern. </td></tr><tr><td> Dissecting Stereoskop </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 Filialen Schwanenhals-Lichtleiter (12V/30W) </td></tr><tr><td> Chininhydrochlorid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Man löst in destilliertem Wasser. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Stecker </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> High-Density Polyethylen </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Einfache Behavioral-Systeme </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Single-Channel-200 ul Pipette </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

Advances in genetischen Methoden haben die Untersuchung von Genen in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit Drosophila als Modellsystem 1 beteiligt aktiviert. Die meisten dieser Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit werden durch altersabhängige Verschlechterung Lernen und Gedächtnis-Funktionen und Bewegungskoordination 2 gekennzeichnet. Hier verwenden wir Verhaltens-Assays, einschließlich der negativen Geotaxis Test 3 und die aversive phototaxic Unterdrückung Assay (APS-Assay) 4,5, um zu zeigen, dass einige der Verhaltensmerkmale mit menschlichen Neurodegeneration verbunden in Fliegen können rekapituliert werden. In der negativen Geotaxis Assay, fliegt die natürliche Tendenz der gegen die Schwerkraft zu bewegen, wenn bewegt wird genutzt, um Gene oder Bedingungen, die Bewegungs-Fähigkeiten verhindern kann studieren. In der APS-Assay werden die Lern-und Gedächtnisfunktionen in positiv-phototaktischen getestet Fliegen trainiert, Licht mit aversive bitteren Geschmack verbinden und somit vermeiden diese sonst natürliche Tendenz, in Richtung Licht zu rücken. Der Test dieser Ausbildung fliegt 6 Stunden nach dem Training verwendet wird, um Speicher-Funktionen zu beurteilen. Mit diesen Tests kann der Beitrag eines genetischer oder umweltbedingter Faktoren auf die Entwicklung Neurodegeneration leicht in Fliegen untersucht werden.

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.4K Aufrufe.  University of Miami, Miller School of Medicine. Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung in Drosophila.

Serie: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying Bewegungsaktivität zu zirkadianen Rhythmen Study and Sleep Parameter in Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer's Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

Morris Water Maze-Test für Lern-und Gedächtnisstörungen bei Alzheimer-Modell Mäuse

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Bestimmung der spontanen lokomotorischen Aktivität in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Die Beurteilung räumliches Lernen und Gedächtnis in Klein squamate Reptilien

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...