Wir danken Leo Pallanck für Fliegenfischer Aktien, Christine Sommers für technische Unterstützung und Gerasimos P. Sykiotis für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Ausbildungsförderung T32CA009363 zu MCB finanziert

1. Startle-induzierte Negative Geotaxis Assay <ol><li> Wählen Fliegen des gewünschten Genotyps, trennen sie nach Geschlecht, nach dem Zufallsprinzip Gruppe sie in Kohorten von 20-30 Tieren und kippen sie in neue Nahrung Fläschchen alle 2-3 Tage; Test jeder Satz von Fliegen (dh Alter abgestimmte Kohorten, eine Kohorte / Genotyp) mindestens einmal pro Woche. </li><li> Dreißig Minuten vor der negativen Geotaxis Test, betäuben die Fliegen mit CO 2 und legen Sie sie in pre-markierten klar Kunststoffrohre mit zwei leeren Flaschen Nahrung (siehe Materialien Table), die an ihren Öffnungen mit durchsichtigem Klebeband (Kammer Maße: 19 cm x 2.85 cm). In unseren Tests verwenden wir meist 25 Fliegen / Rohr. Hinweis. Die Erholungszeit aus der Narkose kann von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden variiert werden (z. B. O / N) und sollte für die spezifischen Genotypen getestet optimiert werden. </li><li> Markieren verschiedenen Höhen (von 1 bis 20 cm) auf ein Stück Löschpapier und kleben Sie das Papier auf einer vertikalen surface, die senkrecht zu der Bank. </li><li> Legen Sie die Rohre vor dem Papier: die Rohre sollte alles ausgerichtet und so nah wie möglich an das Papier, um eine genaue Höhenmessung ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Digitalkamera (siehe &quot;Sonderausstattung&quot; Table) vor der Rohre, in einem Abstand von 20-30 cm von dem Papier, auf einem Ständer (zB eine Pipettenspitze Kasten), wählen Sie die &quot;Film&quot;-Option und starten Sie Aufnahme; zu diesem Zeitpunkt sollten Sie auch einen Timer zu starten, den Überblick über die Zeit zwischen aufeinander folgenden Prüfungen zu halten. </li><li> Lassen Sie die Fliegen an der Unterseite des Rohres durch Antippen des Röhrchens für ein paar Sekunden (zB 10 sec) zu sammeln. Dieser Schritt sollte konsequent durchgeführt werden (dh dieselbe Dauer, dieselbe Kraft, demselben Betreiber) während des gesamten Experiments. </li><li> Nimm Fliegen &#39;Bewegungen mit der Digitalkamera für 10 sec. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.7 vierzehn Mal an einem-Minuten-Intervallen. </li><li> Analysieren von Daten: <ol type="a"><li> Zähle die Anzahl der Fliegen, die über dem liegen2 cm-Marke nach 10 Sekunden durch visuelle Inspektion der aufgenommenen Filme. Hinweis: In unserem Test Bedingungen der Fliegen &quot;negative Geotaxis Verhalten nicht zuletzt über den ersten 10 Sekunden nach überraschenden (dh Fliegen setzte sich in Bewegung in alle Richtungen 10 Sekunden nach überraschenden ihnen). Der Mindestabstand kletterte um Kontrolle Fliegen (dh 1 Woche alt Fliegen Ausdruck der THGal4 Fahrer, siehe Legende von Abbildung 1) in diesem Zeitfenster von 2 cm. So nutzten wir die 2 cm Marke als Referenz für die Analyse der Aktivitäten von Klettern Fliegen unterschiedlichen Alters und Genotypen 10 Sekunden nach Einleitung des Verhaltens. Diese Parameter können verlangen Anpassung, um Unterschiede im Verhalten der Fliegen getestet (zum Beispiel aufgrund von unterschiedlichen genetischen Hintergründen oder Laborbedingungen). Beachten Sie, dass in unseren Testbedingungen getestet alle Genotypen schlechter oder ähnlich durchgeführt, um die Fliegen von der Steuerung Genotyp. </li><li> Der Mittelwert der Ergebnisse aus den fünfzehnStudien. </li><li> Express Durchschnitt als Prozentsatz der Gesamtzahl von Fliegen in das Rohr (=% steigender Aktivität), die Anzahl der Wiederholungen (N) wird durch die Anzahl der unabhängigen Kohorten für jeden Genotyp untersucht worden sind </li><li> Bewerten statistische Signifikanz zwischen den verschiedenen Genotypen im Laufe der Zeit. Dies kann mit einem Student-t-Test (beim Vergleich zweier Genotypen) oder einem 2-Wege ANOVA Analyse von Bonferroni post-hoc-Test (bei ​​der Durchführung multiple Vergleiche) unter Verwendung kommerzieller Software wie GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla gefolgt erreicht werden, CA, USA). </li></ol></li></ol> Hinweis Wir führen alle unsere Tests in der gleichen Zeit des Tages, bei RT und unter den gleichen Lichtverhältnissen. Keeping die Fliegen in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus Umfeld ist es ratsam, für die Wirkung der zirkadianen Rhythmen auf der Fliegen Bewegungsapparates Verhalten zu kontrollieren. 2. Tyrosin Hydroxylase ImmunfluoreszenzAssay von Whole-Brain-Mounts Lösungen und Puffer Fixierlösung: 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) Waschpuffer: 0,1% Triton X-100 in PBS Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA Montage Medien: Mowiol-Dabco (siehe Protokoll in Harlow E, D. Lane, Antikörper-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988) beschrieben) Vorgehensweise <ol><li> Setzen Sie fliegt in einer Dissektion Gericht mit 70% EtOH für ca. 1 min, um die Nagelhaut entfernen Wachs gefüllt. </li><li> Übertragen fliegt zu einem anderen Dissektion Gericht mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Präparieren Sie das Gehirn: <ol type="a"><li> Legen Sie die Fliege mit der Bauchseite nach oben (optional: remove Flügel und Beine). </li><li> Ziehen Sie den Kopf vom Körper weg: Verwenden Sie eine Zange, umhalten, um den Körper und eine andere zu halten, um die Nagelhaut unter dem Auge, um zu verhindern das Gehirn schädigen </li><li> Entfernen Sie die Rüssel. </li><li> Halten Sie den Kopf Kutikula auf gegenüberliegenden Seiten des Schlitzes offen gelassen nach dem Entfernen der Rüssel und ziehen in entgegengesetzte Richtungen, bis das Gehirn aus dem Kopf Kapsel entfernt wird. </li><li> Entfernen Sie alle Häutchen aus dem Gehirn. </li><li> Entfernen Sie alle luftgefüllten Luftröhrengewebe, dies wird das Gehirn vor schwimmt während der folgenden Inkubationsschritten verhindern. </li></ol></li><li> Schneiden einige Millimeter von der Spitze eines P-200 Pipettenspitze und äquilibriert mit 0,1% Triton-Lösung X-100/PBS </li><li> Verwendung der hergestellten P-200 Pipettenspitze, übertragen die Gehirne einem 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml 4% PFA / PBS gefüllt und auf Eis halten, bis die Präparation beendet. </li><li> Fix die Gehirne bei RT für 20 min: eine milde Drehung, indem Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einem Gestell und Platzierung des Racks auf einer Kolbenpendel. </li><li> Entfernen Sie das FixativVerwendung eines P-1000 micro Pipette 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, durch Umdrehen mischen und für 1 min inkubieren geschweige; wiederholen Sie diesen Schritt einmal waschen. </li><li> Entfernen Sie den Puffer aus dem zweiten Waschen, 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS und lassen Inkubation bei RT für 20 min; wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Entfernen des Waschpuffers und lassen die Gehirne in Blocking-Puffer inkubiert (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne mit einer 1:100 Verdünnung von Anti-TH-Antikörper (siehe &quot;Tabelle der spezifische Reagenzien&quot;) in Blocking-Lösung für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung (siehe Schritt 2.6.). </li><li> Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 .. </li><li> Equilibrieren die Gehirne mit einer 1:200 Verdünnung des sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung. </li><li> Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 .. </li><li> Bereiten Sie die Montage Objektträger wie in 2A dargestellt: <ol type="a"><li> Add 2 X 25 ul Tropfen Montage-Medien mit einem Deckglas (24 x 60 mm, nein. 1.5). </li><li> Platz zwei Deckgläsern (Größe 18 x 18 mm, nein. 2) an den Montage-Medien eine Lücke in der Mitte des Schlittens und trocknen lassen. </li></ol> Hinweis. Überprüfen Sie den Probenhalter auf der Bühne des konfokalen Mikroskops. Sie können das Deckglas die gleiche Größe von 25 x 75 mm Folie durch die Anbringung eines 22 x 22 mm 1,5 Deckglas auf einem der Enden (verwenden Nagellack und Band). </li><li> Entfernen Sie den Waschpuffer, fügen 50 ul Montage Medien und damit die Gehirne, um mit ihm durch Auf-und Abpipettieren Gleichgewicht. </li><li> Die Verwendung eines P-200 Pipettenspitze (siehe Schritt 2.4) übertragen die Gehirne mit dem Schlitten in den Raum zwischen den beiden Deckgläser und decken Sie sie mit einem Deckglas Nr. 1.5 (siehe Abbildung 2A; zu orientieren die Gehirne auf der Folie zu sehen 7). Hinweis: Die Proben werden zwischen zwei Deckgläsern montiert, um die Visualisierung sowohl der Front-und der poste erlaubenrior Seite des Gehirns. </li><li> Füllen Sie den gesamten Raum zwischen den Deckgläsern mit Montageplatte Medien; Pipette von einer Ecke in die Luft zu entfernen, trocknen lassen und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Um die Anzahl von dopaminergen Neuronen in einem bestimmten Cluster beurteilen erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten entlang der z-Achse mit einem 1,0 um Schrittweite mit einem konfokalen Mikroskop (für den anatomischen Identifizierung dopaminerger Cluster in der Drosophila erwachsenen Gehirn siehe 7). </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration.">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster.">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li><li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson's+disease.">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li><li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

Wir erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in 5). Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genet...

Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen 3 erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel 6) zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarboxylase-Gen und treibt transgene Expression nicht nur in DA Neuronen, sondern auch in serotonergen Neuronen und Gliazellen Teilmengen von 3 . Feany und Bender (2000) zum ersten Mal beobachtet, dass pan-neuronale Expression der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen den fortschreitenden Verlust von sta beschleunigtrtle-induzierten negativen Geotaxis Verhalten in Drosophila. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit dem DA-Neuron-spezifische THGal4 Linie, um die Expression von α-Synuclein eine transgene 10 fahren beobachtet und verwendet diese funktionelle ausgelesen, um die neuroprotektive Rolle des Nrf2-Signalweg in dieser Studie Drosophila-Modell der PD 14. Die spezifischen Assay hier beschriebenen 2 und 3 angepasst. Die Drosophila Gehirn enthält mehr als 100 DA Neuronen, in mindestens 5 verschiedenen Clustern angeordnet (pPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), die visualisiert werden in ganze Gehirn Halterungen durch konfokale Mikroskopie können (siehe zum Beispiel 11 und 7). Es ist noch umstritten, ob die Anzahl der DA Neurone im Gehirn Drosophila mit dem Alter abnimmt 9, 11, jedoch altersabhängige Neurodegeneration bei Fliegen beobachtet wird, wo PD-chromosomale Gene mutiert worden / überexprimiert um menschliche Krankheiten zu modellieren5. Die Expression von humanen α-Synuclein in DA Neuronen hat eine solche Wirkung und damit als Modell für PD verwendet worden. Hier beschreiben wir einen Test für DA Neurone im gesamten Gehirns zählen Aktivierungen mit TH als Zell-Marker. Dieser Test wurde von 13 und 10 angepasst.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und Alzheimer-5 zu modellieren. Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion 2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD 8 zu identifizieren. Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung 3, 10 erreicht werden.

Wir haben die verwendeten Assays beschrieben hier die Rolle der Beanspruchung schützende Nrf2-Signalweg in Drosophila Modell der PD 14 zu studieren. Dieses Modell beruht auf der Expression des humanen α-Synuclein-Gen in DA Neuronen mit einem TH Gal4 Treiber 2, 10. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Schreckreaktion-induzierten negativen Geotaxis (Klettern)-Assay in männlichen Fliegen, die verschiedene Transgene unter der Ko...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining at JoVE.com

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt;: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K Aufrufe.  University of Rochester Medical Center. Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren Drosophila: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Serie: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Riech Assays für Mausmodelle für Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.