Diese Arbeit wurde von Project Grants # 1010395 (BQ und CP) und # 525431 (CR), und einem Programm Zuschuss # 455395 (CP) aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, einem australischen Zentrum für Hepatitis-und HIV-Virologie EOI unterstützt 2012 Stipendium (CR und RJJ) und einem Zuschuss von der Gordon und Gretel Bootes Foundation (BQ und CR). Wir möchten Harpreet Vohra und Michael Devoy für ihre hervorragende Pflege des JCSMR FACS Labor danken, die australische Cancer Research Foundation Biomolekulare Ressourcenfazilität, JCSMR, ANU, für die Peptidsynthese, und Dr. David Boyle, CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australien für die Bereitstellung der Mutter HIV-Impfstoff-Aktien.

Hinweis: Die Mäuse aus diesem Protokoll wurden gemäß den Richtlinien der Australian National University Tierversuche Ethikkommission und Mäuse behandelt wurden durch Genickbruch getötet. 1. Dye-und Peptid Vorbereitung <ol><li> Dye Vorbereitung Hinweis: Die Farbstoffe werden in unterschiedlichen Konzentrationen vorverdünnt die Kennzeichnung von Zellen an diskreten Fluoreszenzintensitäten ermöglichen. CFSE ist sieben Konzentrationen über 3,5-fach serielle Verdünnungen verwendet und CTV und CPD sind an sechs verschiedenen Konzentrationen über 3,7-fache serielle Verdünnungen verwendet (siehe Tabellen 2-4). Die Aktien Konzentrationen in den Tabellen 2-4 aufgeführten Farbstoffe verwendet werden, um Zielzellen bei den in den Tabellen 2-4 aufgeführt endgültige Farbstoffkonzentrationen zu markieren. Farbstoffe reagieren bei Einwirkung von wässriger Lösung. Es ist daher wichtig, daß Fläschchen auf RT vor dem Öffnen, um die Exposition von Farbstoffen, um eine Kondensation zu minimieren äquilibriert werden. <ol><li> CFSE Hinweis: CFSE als Carboxyfluoresceindiacetat succinimidylester (CFDA, SE; MW 557,47) gekauft, in der Regel bei 25 mg / Fläschchen. <ol><li> Resuspendieren 25 mg in 4,48 ml CFSE DMSO, um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten. </li><li> Serienmäßig verdünnen CFSE: Fügen Sie 35 ul 10 mM CFSE Lager in 87,5 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 3 zu geben. </li></ol></li><li> CTV Hinweis: CTV wird typischerweise in Packungen 9 Ampullen, die jeweils mit 10 &amp;mgr; l DMSO aufgelöst werden, um eine 10 mM Lösung des Farbstoffs zu erzeugen gekauft. <ol><li> Rekonstituieren und Pool Alle 9 Fläschchen CTV mit 90 ul DMSO, um eine 10 mM Lösung. </li><li> Serienmäßig verdünnen CTV: Fügen Sie 11 ul 10 mM CTV Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 2 zu geben. </li></ol></li><li> CPD Hinweis: CPD (MW 792,6) ist typischly gekauft als 0,5 mg / Fläschchen. <ol><li> Resuspendieren 0,5 mg CPD in 63 ml DMSO, um eine 10 mM Lösung zu erhalten. </li><li> Serienmäßig verdünnen CPD: Fügen Sie 11 ul 10 mM CPD Lager in 29,7 ul DMSO und wiederholen Sie dies mit verdünnter Stammlösung, um jede Farbstoffkonzentration in der Tabelle 4 geben. Hinweis: Dye Aktien können bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden und kann mehrmals aufgetaut und wieder eingefroren werden, ohne signifikanten Verlust in der Funktion. </li></ol></li></ol></li><li> Peptid-Vorbereitung Hinweis: MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 10fache Verdünnungen von einer Startkonzentration von 1 &amp;mgr; M (Tabelle 5). MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden werden im Allgemeinen verwendet, um Zielzellen bei 6 verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Impuls 3 fachen Verdünnungen von einer Ausgangskonzentration von 400 &amp;mgr; M (Tabelle 5). Jedes Peptid wird mit 2x Endkonzentration in PBS wie that jedes Peptidkonzentration hat eine Mindestmenge von 250 ul. Peptid-Aktien können vor der FTA Konstruktion hergestellt und bei -20 ° C ohne wesentliche Funktionsverlust gelagert werden. <ol><li> Vorbereiten Lager MHC-Klasse-I-bindenden Peptiden </li><li> Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop zu 2 uM Stammlösungen (2x 1 uM) </li><li> Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-I-bindende Peptide: add 44,4 ul 2 uM Peptid-Stammlösung in 400 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in der Tabelle 5 zu geben. </li><li> Vorbereiten Lager MHC-Klasse-II-bindenden Peptide </li><li> Bereiten Sie die höchste Konzentration von jedem Peptid-Epitop bis 800 um Stammlösungen (2x 400 uM). </li><li> Serienmäßig verdünnen MHC-Klasse-II-bindenden Peptide: add 150 ul 800 uM Peptid-Lösung in 300 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verdünnter Stammlösung, um jede Peptidkonzentration in Tabelle 5 geben </strong&gt;. </li></ol></li></ol> 2. FTA Vorbereitung Hinweis: Das folgende Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA von Zellen mit 7 verschiedenen Peptid-Epitopen gepulst bei 6 unterschiedlichen Konzentrationen (dh 42 Zellcluster.) 6 mal wiederholt, um 252 erkennbaren Zellcluster zu erzeugen besteht. In jeder Wiederholung ein Zellcluster mit keinem Epitop (null) gepulst wird, wird als Kontrolle eingeschlossen. Es ist hilfreich für Freihandelsabkommen, eine CD45 Allotyp Unterschied Wirtstiere müssen ihre Diskriminierung von Empfängerzellen durch Antikörpermarkierung zum Zeitpunkt der Analyse zu ermöglichen. Ansonsten Freihandelsabkommen mit anderen Farbstoffen wie PKH-26 für diesen Zweck (in Schritt 2.6 beschrieben) gekennzeichnet werden. Typischerweise wird die FTA Vorbereitung Verfahren von Anfang durchgeführt, um während einer Sitzung zu beenden. <ol><li> Etikett 42, 10 ml Kunststoffröhrchen mit konischem Boden 1-42 (wie in Tabelle 1 zum Beispiel). </li><li> Vorbereitung der Zellen <ol><li> Isolieren Milz und / oder lymphnodes von Mäusen. Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben und zählen Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Resuspendieren Lymphozyten bei bis zu 200 x 10 6 Zellen / ml in 11,5 ml Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, oder Äquivalent), das 5% fötales Kälberserum (FCS). Hinweis: Es ist wichtig, einen Puffer mit hohem Amingehalt zu verwenden, um die Toxizität für Zellen Farbstoff 3 zu minimieren. </li></ol></li><li> CTV Kennzeichnung Hinweis: Die Zellen werden zunächst mit sechs Konzentrationen von CTV markiert. <ol><li> Die Zellen gründlich resuspendieren durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6 der 10-ml-Röhrchen beschriftet 37-42, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen. </li><li> Um Zellen mit CTV beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal. </li><li> In 83 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add 17 ul Lager CTV (siehe Tab.le 2, für die Stammlösung wird auf die Tube) zugeordnet. Hinweis: Ein nicht benetzt Rohr ist wichtig, um die Zellsuspension Bewegung und vorzeitiges Mischen der Zelllösung mit der Farbstofflösung zu verhindern. </li><li> Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2-2.3.4 für die Stammlösungen von CTV in den in Tabelle 2 beschrieben bezeichnet Röhren. </li><li> Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C). </li></ol></li><li> CFSE Kennzeichnung <ol><li> Nach CTV Kennzeichnung, 5 ml RPMI mit 5% FCS in jedes Röhrchen und gründlich resuspendieren durch Vortexen. <ol><li> Von Rohr 37 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 31, 25, 19, 13, 7 und 1. </li><li> Von Rohr 38 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 32, 26, 20, 14, 8 und 2. </li><li> Von Rohr 39 1 ml der Zellsuspension in die Rohre 33, 27, 21, 15, 9 und 3. </li><li> Von Rohr 40 1 ml der ZellSuspension Rohre 34, 28, 22, 16, 10 und 4. </li><li> Von Rohr 41 je 1 ml der Zellsuspension in Rohren 35, 29, 23, 17, 11 und 5. </li><li> Von Rohr 42 je 1 ml der Zellsuspension auf Rohre 36, 30, 24, 18, 12 und 6 Hinweis: Achten Sie darauf, die obere Hälfte der Rohre während der Schritte 2.4.1.1-2.4.1.6 benetzen. </li></ol></li><li> Um Zellen mit CFSE beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal. </li><li> In 103 ml PBS auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 7 ml Stamm CFSE hinzufügen (siehe Tabelle 3, für die Stammlösung wird auf die Röhre zugeordnet). </li><li> Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen. </li><li> Haben Schritte 2.4.2-2.4.4 für die Stammlösungen von CFSE in den in Tabelle 3 beschrieben bezeichnet Röhren. </li><li> Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C). </li><li> Waschen der Zellen: Zellsuspension verdünnt mit 9 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS, Sediment durch Zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C und entfernt Überstände durch Absaugen mit einer Transferpipette. </li></ol></li><li> Peptid-Pulsen und Zellwasch Hinweis: Nach der Zellen mit CTV und CFSE markiert worden sind, werden sie mit MHC-Klasse-I-und / oder MHC-Klasse-II-bindenden Peptide (in 1.2 hergestellten) gepulst. Eine der Zellpopulationen sind ebenfalls nicht mit Peptid (zB. Nil in Tabelle 1) gepulst werden und als negative Kontrolle für die Berechnung der T-Zell-Reaktionen verwendet. <ol><li> Peptid-Pulsen <ol><li> Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 250 ul RPMI mit 5% FCS. Anmerkung: In der Regel 50 ul Zellsuspension verbleibt nach dem Absaugen des Überstands am Ende von Schritt 2.4.7 daher mit 200 ul Medium, um Pellets Zelle. </li><li> Add 250 ul Peptid pre bereit Bestände (wie in Tabelle 5), die Rohre (wie in Tabelle 1) entsprechend bezeichnet und sein surallein e, ein Steuerrohr des PBS aufgenommen sind ohne Peptid als Nil Kontrolle. </li><li> Mischen Zellsuspensionen mit einem Wirbel. Hinweis: Es ist wichtig, dass jedes Peptid-Epitop und jede Peptidkonzentration an einem einzelnen Rohr zugeordnet und diese eindeutig auf der Grundlage der erwarteten Fluoreszenz der Zellen in diesem Rohr erfaßt wird, weil die Fluoreszenz-Signatur des Clusters wird dieses Peptid zu definieren (wie in Tabelle 1 zum Beispiel). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Zellwasch <ol><li> 5 ml eiskaltem (4 º C) RPMI mit 5% FCS zu der Zellsuspension und resuspendieren Zellen durch Umdrehen des Röhrchens. Sorgfältig Unterlage der Zellsuspension mit 3 ml eiskaltem (4 ° C) FCS. </li><li> Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Verwenden langsame Beschleunigung und Bremsen, um die Schnittstelle des FCS zu gewährleisten und die Zellsuspension Lösung aufrechterhalten wird. </li><li> Vorsichtig absaugen und dann das RPMIdie FCS mit einer Transferpipette, so dass die gewaschenen Zellpellets ungestört. Anmerkung: Die Verwendung einer Unterlage FCS zu Zellen zu waschen hilft sicherzustellen soviel Peptidlösung aus den Zellen wie möglich entfernt und dadurch Belichtung der Zellpopulation, um mehrere freie Peptide Begrenzung, wenn die Zellen gepoolt. </li><li> Waschen der Zellen wieder: Resuspendieren der Zellpellets in 10 ml 4 º C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C Gießen Sie die Überstände. </li><li> Pool alle Zellpopulationen in einem einzigen Rohr mit einer Pipette unter Verwendung von 6 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. </li></ol></li></ol></li><li> CPD Zellmarkierung Anmerkung: An diesem Punkt sechs Intra-Assay Wiederholungen können durch Markierung Peptid gepulste Zellen mit 6 verschiedenen Konzentrationen der CPD erzeugt werden. <ol><li> In 11,4 ml 20 ° CRPMI mit 5% FCS zu der gepoolten Zellpellet resuspendieren sorgfältig mit einer Pipette. </li><li> Fügen Sie 1,9 ml der Zellsuspension in 6, 10-ml-Röhrchen beschriftet AF, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhren zu benetzen. </li><li> Um Zellen mit CPD beschriften, entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal. </li><li> In 92 ul PBS zu dem nicht benetzten Teil am oberen Ende des Rohres, und dieses Add Lager CPD (siehe Tabelle 4 für die Menge der Stammlösung in jedes Röhrchen zugeordnet). </li><li> Das Röhrchen und mischen Sie die Zellsuspension mit dem Farbstoff schnell und gründlich durch Vortexen. </li><li> . 2.6.3-2.6.5 Sie Schritte für die Stammlösungen der CPD in den in Tabelle 4 beschrieben bezeichnet Rohre Hinweis: Im Gegensatz CFSE und CTV, ist die CPD Kennzeichnung Konzentration nicht exakt linear zu der resultierenden Fluoreszenzintensität der markierten Zellen verwandt und so die Kennzeichnung Konzentration verwendet werden, um gleich weit Fluoreszenzspitzen von mehreren markierten Populationen zu erhalten, wurdeempirisch ermittelt (siehe Tabelle 4). </li><li> Inkubiere Zellen für mindestens 5 min bei RT (20 ° C). </li><li> Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen. </li><li> Pool alle Zellen in einer einzigen Röhre mit 8 ml 4 ° C RPMI mit 5% FCS mit einer Pipette. Sediment gesammelt Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und absaugen des Überstandes mit einer Transferpipette. </li></ol></li><li> (Optional) PKH-26 Zellmarkierung Hinweis: Wenn Freihandelsabkommen kann nicht mit Zellen eine CD45 exprimieren allotypische Unterschied um Mäuse Gastgeber konstruiert werden, können sie mit PKH-26 markiert werden, um ihre Diskriminierung von Empfängerzellen zu ermöglichen. <ol><li> Hinzufügen von 2,9 ml 20 ° C PBS gepoolten Zellpellet zu resuspendieren und sorgfältig mit einer Pipette. </li><li> In Zellsuspension auf eine nichtn benetzt 10-ml-Tube, kümmert sich nicht um die obere Hälfte der Röhre zu benetzen. </li><li> Entfernen Sie die Rohrkappe und legte den Schlauch horizontal. </li><li> In 58 ul Verdünnungsmittel C (im PKH-26-Farbstoff-Kit) auf die nicht benetzt Abschnitt an der Oberseite der Röhre, und diese 42 ul 1 mM Stamm PKH-26 hinzufügen. </li><li> Das Röhrchen und mischen Zelllösung mit dem Farbstoff gründlich durch Rühren. </li><li> Zellen, Inkubation für mindestens 10 min bei RT (20 ° C). </li><li> Waschen der Zellen zweimal: Die Zellen auf 10 ml mit 20 ° C RPMI mit 5% FCS. Sedimentieren der Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Absaugen Überstand mit einer Transferpipette. Wiederholen. </li></ol></li><li> Injizieren Freihandelsabkommen in Wirtstiere Hinweis: Um die T-Zellreaktionen in vivo zu messen, werden FHA in Tieren, die eine aktive Immunantwort haben und in situ belassen bis zu 24 Std. Es ist entscheidend, dass die FHA werden ebenfalls in einem naiven Tier als negative Kontrolle injiziert.<ol><li> Die Zellen zählen und bei 2,5 x 10 8 Zellen pro ml in PBS. Injizieren Sie 200 ul von Zellen intravenös in Mäuse-Host, einschließlich einer naiven Tier als Kontrolle. </li></ol></li></ol> 3. Durchflusszytometrie <ol><li> 18-24 Stunden nach der Injektion FTA Ernte Blut oder Milz (oder anderen Geweben von Interesse) von Host-Mäusen. </li><li> Bereiten Einzelzellsuspension von Gewebe durch Maischen durch eine 70 um brütete Sieb mit einer 5 ml Spritzenkolben. </li><li> Die Zellen mit bis zu 65 x 10 6 Zellen / ml in PBS, enthaltend 0,1% BSA. </li><li> Verteilen von 100 &amp;mgr; l Aliquots der Zellsuspension in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Antikörpermarkierung. </li><li> Label-Zellen mit Fluorochrom markierten Antikörper und fluoreszierende Sonden Lebensfähigkeit mit spektral kompatibel Fluoreszenz CFSE, CTV und CPD. Hinweis: Antikörper gegen Zellmarker wie B220 und Aktivierungsmarkern wie CD69 B sind für die B-Zell-Aktivierung zu messen, wenn mit Hilfe der FTA bis H T-Zellreaktionen zu messen 2. Fügen Sie einen Antikörper gegen CD45.1 und / oder wenn die Freihandelsabkommen CD45.2-und Host-Mäuse haben eine CD45 allotypische Unterschied. </li><li> 100 l 2x Stammlösung von Antikörper / Lebensfähigkeit Farbstoffe (in PBS mit 0,1% BSA) bis 100 ul Aliquots von Zellen, gut mischen und Inkubation auf Eis (4 ° C) für 30 min. </li><li> Waschen der Zellen: Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen. Die Zellen in 200 &amp;mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Sediment Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C Überstand zu entfernen. </li><li> Die Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 &amp;mgr; l PBS, enthaltend 0,1% BSA, Filterzellen durch einen 70 &amp;mgr; m-Mesh und durch Durchflusszytometrie analysiert Strömungs im Durchflußzytometer der Lage, die entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen und Konjugate. Sammeln Sie bis zu 3 x 10 6 Lymphozyten-Ereignisse, um jede Zelle FTA-Cluster zu lösen und zu gewinnen genug Zellen für die statistischecal-Analyse. Hinweis: Stellen Sie sicher, alle typischen Steuerelemente (z. B. Einzelbunt Kontrollen) für die Durchflusszytometrie eingesetzt werden. Typischerweise erfordert CFSE Anregung aus einer blauen Laserquelle (in der Regel bei 488 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 520 nm zentriert; CTV erfordert Anregung aus einem violetten Laserquelle (in der Regel bei 405 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 450 nm zentriert; und CPD erfordert Anregung von einem roten Laserquelle (in der Regel bei 633 nm oder 640 nm) und Detektion mit Bandpass-Filter über 670 nm zentriert. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Durchflusszytometrie Daten mit Standard-Durchflusszytometrie-Software (siehe repräsentatives Ergebnis für ein Beispiel von der Art der Gating-Strategie beschäftigt). </li><li> Für% spezifisch Tötung ermitteln Sie die Anzahl der Zellen in jeder Zelle FTA-Cluster mit MHC-Klasse-I-bindenden Peptide und der FTA-Cluster, die nicht gepulst wurden Peptid (&quot;Null&quot;), gepulst und mit folgender Formel zu berechnenSpezifische% Töten. Spezifische% Töten <img alt="Formel" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51627/formula.jpg" width="200" /> Anmerkung: In der obigen Formel &quot;grundiert&quot; bezieht sich auf Ziele von Tieren, die gedacht sind, um eine Immunantwort gegen die Zielpeptide &quot;naiven&quot; bezieht sich auf Ziele von naiven Tieren, &quot;Peptid&quot; bezieht sich auf Ziele mit Peptiden und &quot;nil&quot; gepulst bezieht sich auf Ziele nicht mit Peptiden gepulst. </li><li> Für B-Zell-Aktivierung als Maß der T-H-Aktivität, die Berechnung der geometrischen mittleren Fluoreszenzintensität (GMFI) des CD69-Antikörper Fluoreszenz auf FTA B-Zellen mit MHC-Klasse-II-Bindungspeptide in &quot;grundiert&quot; Tiere und von diesem subtrahieren GMFI gepulst CD69 Expression auf den entsprechenden FTA-B-Zellen in &quot;naiv&quot; Tiere um ein Maß der T-H-Aktivität zu geben. </li><li> Von den in den Schritten 4.2 und 4.3, die Verwendung erzeugt Statistikenmathematischen Tabellenkalkulationssoftware wie GraphPad Prism zu anderen quantitativen und qualitativen Parameter wie Fläche unter der Kurve und EC 50 (eine in der Tiefe Beschreibung, wie diese Berechnungen durchgeführt für AUC berechnen sind zu finden unter http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, und EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm). </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response.">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li><li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer/antigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays.">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li><li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells.">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li><li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies.">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li><li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry.">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li><li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+(ELISPOT)+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells.">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li><li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells.">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance.">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der Vorteil der FTA-basierten Assays ist, dass sie die Unterscheidung von&gt; 250 lebensfähigen und funktionsZielZellPopulationen aus einer Wirtstier durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dies bietet ein Maß an Komplexität in vivo Durchflusszytometrie basierenden Assays, die bisher nicht möglich war vor. Dies wird in den 2 oben gezeigt Tierversuchen, in Reaktion auf 7 verschiedene virale Epitope bei 6 Konzentrationen könnten in Replikaten von 6 gleichzeitig in einem einzigen Tier erlaubt Parameter wi...

T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in der adaptiven Immunantwort und werden oft für die Manipulation in der Immuntherapie richtet. CD4 + Effektor-T-Zellen reagieren auf fremde Antigen durch Sekretion von Zytokinen, die viele Aspekte der Immunität regulieren und kann auch direkt helfen, B-Zellen, Antikörper zu produzieren. CD8 + zytotoxischer T-Zellen (CTLs) können auch Fremdantigen reagieren durch Sekretion von Zytokinen und spielt eine zentrale Rolle bei der Abtötung von Zellen direkt ein fremdes Antigen exprimiert. Die grundlegende Interaktion, die diese T-Zell-Effektorfunktionen initiiert beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptor (TCR) mit fremden Peptiden auf MHC-Molekülen auf der Oberfläche von Zellen angezeigt. CD4 + T-Zellen erkennen Peptide an MHC-Klasse-II-Molekülen auf Antigen-präsentierenden Zellen und CD8 + T-Zellen erkennen das Peptiden auf MHC-Klasse-I-Moleküle, die typischerweise auf Mikrobe infizierten Zellen angezeigt werden, angezeigt. Umdie Rolle T-Zellen in einer Immunantwort spielen zu beurteilen, ist es wichtig, dass ihre Effektor-Funktionen werden durch zuverlässige und empfindliche Methoden gemessen. Gemeinsame Methoden für die T-Zellantwort Bewertung einzubeziehen; MHC-Tetramer class-I/II/peptide Reaktivität; Zytokin-Produktion durch ELISPOT und intrazellulären Zytokin-Färbung; und Tötungskapazität von 51 Cr-Release-Assays. Diese Tests sind jedoch in der Regel ex vivo durchgeführt in vitro Stimulation oder einen begrenzten Einblick in die T-Zellfunktion. Idealerweise bei der Messung von T-Zellantworten wäre es vorteilhaft, diese in situ zu beurteilen, in vivo, wie sie auftreten, ohne Manipulation von T-Zellen, so dass Änderungen der funktionellen Parameter, die durch in vitro-Stimulation auftreten können, zu vermeiden. Einige der am häufigsten in vivo T-Zell-Funktionsassays verwendet werden zur Messung CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen, die mit MHC-Klasse I-bindenden Peptiden gepulst, die in vivo aufgezählt werden basierendüber deren Nachweis durch Fluoreszenzmarkierung mit Vitalfarbstoffe wie CFSE. Während diese Arten von Tests können CTL-vermittelte Abtötung von Zielen zu überwachen, wenn sie in vivo vorkommen, sie vorher eine relativ begrenzte Kapazität zur Tötung von mehreren Zielen präsentiert verschiedenen Konzentrationen und verschiedenen Typen von Peptid-Epitopen, die erforderlich ist, qualitative Parameter, damit beurteilt hatten als funktionelle Avidität und Epitop Variante Kreuzreaktivität bewertet werden. Diese Tests auch nicht bieten keine Informationen über CD4 + T-Zell-vermittelte Reaktionen. Zu überwinden viele der Beschränkungen verwendet werden, um T-Zellreaktionen zu bewerten gegenwärtigen Verfahren, haben wir vor kurzem ein Multiplex-Assay auf Basis von fluoreszierenden Zielarrays (FHA), die die Kontrolle der T-Zell-Antworten gegen&gt; 250 Zielzellen gleichzeitig in einem tierischen ermöglicht entwickelten Durchflusszytometrie 1, 2. Freihandelsabkommen sind von Lymphozyten mit meh beschriftet umfasstBundes Konzentrationen und Kombinationen von Vitalfarbstoffe wie CFSE, CTV und CPD erlaubt&gt; 250 Zellhaufen von einzigartigen Fluoreszenz erzeugt werden. Da diese Zellen lebensfähig und funktionsfähig bleiben, können sie in Tiere injiziert werden, um die Überwachung ihrer Wechselwirkung mit Effektor-T-Zellen in vivo 3 zu ermöglichen. Zum Beispiel kann die FTA Zellcluster mit MHC-Klasse-I-bindende Peptide gepulst werden, um Beurteilung der Antigen-spezifischen CTL-vermittelte Abtötung von Zielzellen 1 zu ermöglichen. Darüber hinaus können die FTA Zellcluster auch mit MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden, das eine Bewertung von Antigen-spezifischen T-Helferzellen (T H)-Aktivität durch Bestimmung der Aktivierung (durch Bewertung des Aktivierungsmarker, wie CD69, CD44 und / oder CD62L) von B-Zellen in der FTA Lager verwandten Peptid 2. Seit mehr als 250 Ziele können gleichzeitig erfasst werden, ist es möglich, CTL und T H-Antworten gegen viele Zielzellcluster mit n gepulst messenahlreiche Peptide bei verschiedenen Konzentrationen und die Aufnahme der vielen Wiederholungen. Die FTA-Test ist daher ein beispielloses Niveau von T-Zell-Antwort-Effektor Beurteilung in vivo. Hier beschreiben wir im Detail die Konstruktion einer FTA und zeigen, wie sie zur Bestimmung der T-Zellantworten in vivo angewendet werden. Das Verfahren beschreibt die Konstruktion eines FTA 252 erkennbaren Zellcluster durch die Verwendung von drei Vitalfarbstoffen, 6 Wiederholungen der 42 Zellcluster mit MHC-Klasse-I und-II-bindenden Peptiden gepulst aufweist, aufweisend. Die Markierung von Zellclustern 42 erfolgt in 10 ml-Röhrchen mit konischem Boden und es ist hilfreich, um diese in einem Reagenzglasgestell lag wie in Tabelle 1 dargestellt. Dieses Verfahren kann für eine kleinere Anzahl von erkennbaren Cluster eingestellt, wie durch die Verringerung der Menge der Markierung erforderlich jeder Farbstoff 1 durchgeführt. Wir zeigen den Nutzen des Tests zeigen, wie es Respons messenes durch rekombinante Pocken-Virus-Impfung gegen mehrere Epitope in einer kleinen Kohorte von Mäusen erzeugt. Dies zeigt, wie das Freihandelsabkommen Test kann verwendet werden, um kumulative Antworten und funktionelle Avidität durch zu messen, bzw. die Verwendung von Fläche unter der Kurve (AUC) Untersuchungen bzw. die Messung der effektiven erforderlich, um die Hälfte der maximalen Antworten (EG 50) erzeugen Peptidkonzentration werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:71px;">Serana</td>
			<td style="width:119px;">FCS-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CTV</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C34557</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CFDA, SE</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">CPD</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">65-0840-90</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-B220 PerCp-Cy5.5</td>
			<td style="width:71px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">110730</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">anti-CD69 brilliant violet 605</td>
			<td style="width:71px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">104529</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">PKH-26</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PKH26GL-1KT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Material Name</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source)</td>
			<td style="width:71px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of fluorescent target arrays for assessment of t cell responses in vivo

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten in vivo zu überwachen, ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort und die Gestaltung der Immuntherapie. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FTA)-Technologie, die Vitalfarbstoffe wie Carboxyfluoreszein Succinimidylester (CFSE), violetten Laser erregbar Farbstoffe (CellTrace Violett: CTV) nutzt und rote Laser erregbar Farbstoffe (Dye Cell Proliferation eFluor 670: CPD ) Etiketten Maus Lymphozyten in&gt; 250 erkennbar fluoreszierenden Zellhaufen kombinato. Zellhaufen innerhalb dieser Freihandelsabkommen mit Haupthistokompatibilitäts (MHC)-Klasse-I und MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden gepulst werden und dienen als Zielzellen für CD8 + und CD4 + T-Zellen, die jeweils damit. Diese FTA Zellen lebensfähig bleiben und voll funktionsfähig und kann daher in Mäuse verabreicht werden, um Beurteilung der CD8 + T-Zell-vermittelte Abtötung von Zielzellen und FTA CD4 + T-Zell-meditierten hel ermöglichenp von freien Zielzellen B-Zellen in Echtzeit in vivo durch Durchflusszytometrie. Da&gt; 250 Zielzellen auf einmal geprüft werden, ermöglicht die Technik der Überwachung der T-Zell-Antworten gegen verschiedene Antigen-Epitope in verschiedenen Konzentrationen und in mehreren Wiederholungen. Als solche kann die Technik T-Zell-Antworten sowohl auf quantitative (zB der kumulativen Größe der Antwort) und eine qualitative (z. B.. Funktionelle Avidität und Epitop-Kreuzreaktivität der Antwort-) Pegel zu messen. Hier beschreiben wir, wie diese Freihandelsabkommen sind konstruiert und geben ein Beispiel, wie sie angewendet werden, um T-Zell-Antworten durch einen rekombinanten Pockenvirus-Impfstoff induziert beurteilen.

Als ein Beispiel der Verwendung des FHA-Assay wurde eine BALB / c-Maus, die mit rekombinantem Vaccinia-Virus (VV), das HIV-I-Epitope (VV-HIV) und Antworten auf die HIV-I-CTL-Epitope immunisiert, Gag, Gag mut, Env und Pol, der VV CTL-Epitope F2L und F2L mut, und die HIV-I T H-Zell-Epitop, Gag Th (wie unter 2 beschrieben) wurden mit einem 252-Parameter FTA-Assay (Abbildung 1B) bewertet. Epitop-Varianten Gag (Gag mut) und F2L (F2L mut) sind nicht im VV-HIV-Vektor exprimiert und daher ...

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The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,&gt; 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

14.3K Aufrufe.  Australian National University.  Die Fähigkeit, T-Zell-Antworten im Detail in vivo Überwachung ist wichtig für die Entwicklung des Verständnisses der Immunantwort. Hier beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Zielarrays (FHA) in einem in vivo-T-Zell-Assay,> 250 Parameter beurteilt gleichzeitig mittels Durchflusszytometrie. 

Serie: The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Einzelne Kette MHC-Technologie zur Co-Agonismus in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...