Name: spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist at JoVE.com

Wir danken Mitglieder des Huse Lab um Rat und Hilfe. Unterstützt durch die US National Institutes of Health (R01-AI087644, m.h.) und P30-CA008748, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. Vorbereitung der stimulierende Glasflächen
<ol><li>Mantel acht Brunnen gekammert Deckglas mit biotinylierte Poly-L-Lysin (Bio-PLL) verdünnt 1: 500 in destilliertem, entionisiertem Wasser (DdH2O). Inkubieren Sie für 30 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschen Sie mit H2O.</li>
	<li>Dry für 2 h bei RT.</li>
	<li>Block Bio-PLL beschichtete Oberflächen mit blockierenden Puffer (HEPES gepufferten Kochsalzlösung [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], mit 2 % BSA) für 30 min bei RT<ol>
<li>Lösen Sie 5 mg Poly-L-Lysin Hydrobromide in 1 mL 10 mM NaPO4, pH 8,5.</li>
		<li>Fügen Sie 125 μmol (0,55 mg) von NHS-Biotin hinzu (aus einer 100 mg/mL Brühe in DMSO) und überprüfen Sie den pH-Wert der Reaktion. Liegt der pH-Wert unter 8,5, fügen Sie 2 μL 4 N NaOH, um zwischen pH 8,5 und 9,5 zu erhöhen.</li>
		<li>Vortex für 30 Minuten.</li>
		<li>Die Reaktion mit 50 μL der 100 mM Glycin in 20 mM Tris pH 8.0 aufgelöst zu stillen.</li>
		<li>Bei voller Leistung für 10 min drehen und den überstand auf einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bio-PLL-Qualität ist in der Regel im Vergleich zu bisherigen Vorbereitungen durch Beschichtung zweifache Verdünnungsreihen des Materials auf einer 96-Well-ELISA-Platte und Quantifizierung von Biotin Inhalt nach Inkubation mit alkalischer Phosphatase Streptavidin gekoppelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockierende Puffer zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken. Fügen Sie Streptavidin (100 µg/mL in blocking-Puffer). 1 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie in HBS. Füllen Sie und invertieren Sie Kammer Folie Brunnen 4-5mal, HBS aus dem Brunnen zu entfernen. Lassen Sie sich nicht Brunnen trocken.</li>
	<li>Fügen Sie die biotinylierte pMHC Liganden und Adhäsionsmoleküle an die Oberfläche. Bemerkung: MCC und Eizellen kann Photocaged durch Zugabe von ortho-Nitrobenzyl Basis Schutzgruppen (z. B. Nitrophenylethyl (NPE) oder Nitroveratryloxycarbonyl (SVOC)) an die ε-Aminogruppe des wichtigsten Lysines (K12 im MCC, K7 in OVA). Photocaged MCC und OVA erhalten Sie von kommerziellen Anbietern. Nach der Rekonstitution in wässrigen Puffer sind sie in bakteriell ausgedrückt-Ek und H2-Kb mit etablierten Ansätzen11,12refolded.</li>
	<li>Validierung von Photoactivatable MCC oder Eizellen Peptid<ol>
<li>Decage Peptide SVOC-geschützt durch UV Bestrahlung mit einer UV-Lampe handheld (siehe Tabelle der Materialien) für 20 min bei RT</li>
		<li>Pulse 1.0 x 105 APCs mit 1 µM nonstimulatory Peptid (negative Kontrolle, z.B. Hb), unbestrahlten Photoactivatable Peptid, bestrahlten Photoactivatable Peptid und Agonist Peptid (Positivkontrolle, z.B., MCC) für 1 h bis über Nacht bei 37 ° C.</li>
		<li>Förderung der T-Zellen, die mit dem Ausdruck der 5 C. C7/2B4/und TCR, Verwendung CH12 oder CH27 B-Zellen. Um OT1 T-Zellen zu stimulieren, verwenden Sie RMA-s oder EL4 Thymom Zellen.</li>
		<li>Mischen Sie die gepulste APCs mit einer gleichen Anzahl von T-Zellen in 96-Well Runde Bodenplatten zu einem Endvolumen von 200 µL. Inkubation bei 37 ° C für 12-24 h.</li>
		<li>Die Überstände von jedes gut erholen und IL-2 von ELISA mit Streptavidin-Meerrettich Peroxidase farbmetrischen Erkennung zu analysieren. Hinweis: Bestätigung des festsetzende Status alle Peptide durch Electrospray Massenspektrometrie vor umfaltung in MHC-komplexe, wird dringend empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Faltung und Reinigung der MHC Lichteinwirkung zu minimieren. Zum Beispiel Falten Reaktionen in Alufolie wickeln und Gel Filtration Chromatographie mit der UV-Lampe aus durchführen. Hinweis: Es hat sich herausgestellt, dass Photoactivatable MCC-I-Ek und OVA - H2-Kb induzieren UV-unabhängige T-Zell-Aktivierung in hoher Dichte, möglicherweise aufgrund von unvollständigen funktionellen Käfighaltung. Daher wird die Photoactivatable pMHC in einer 10-30 X Überschreitung des nonstimulatory pMHC (z. B. -Ek , enthalten das Hämoglobin64-76 Peptid (Hb)) während der Ruhigstellung Schritt verdünnt. Dies verbessert das Signal Rauschabstand des nachfolgenden bildgebenden Experiments.</li>
	<li>Zu Photoactivate CD4+ T Zellen, gemeinsam verwenden eine Mischung aus biotinylierte Hb-I-Ek (3 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable MCC-I-E-k (0,1 µg/mL) und biotinylierte Antikörper gegen die Klasse ich MHC H2-Kk (0,5 µg / mL). der Antikörper Anti-H2-Kk fördert 5 C. C7/2B4/und T-Zellen, die H2-Kk, um auf die Glasoberfläche zu verbreiten, ohne Aktivierung zum Ausdruck bringen.</li>
	<li>Für CD8+ T Zellen, verwenden Sie eine Mischung aus biotinylierte H2-Db trägt das Peptid KAVYDFATL (1 µg/mL), biotinylierte Photoactivatable OVA-H2-Kb (0,1 µg/mL), und der extrazellulären Domäne des das Adhäsionsmolekül ICAM-1 (2 µg/mL produziert von Insekten Zelle Kultur13). Die ICAM-1 fördert enge Kontakt Bildung durch die Gewinnung der Integrin LFA1 auf der T-Zell-Oberfläche.</li>
	<li>Gelten Sie alle Protein-Mischungen in blockierende Puffer, gefolgt von Inkubation für 1 h bei RT oder mindestens 2 h bei 4 ° C. Hinweis: Die molekulare Dichte auf Oberflächen dieser Art zu ~ 8000 pro µm2 wurde zuvor ermittelte6. Da die Photoactivatable pMHC ~1/30 darstellt werdenth biotinylierte Protein auf der Oberfläche, seine Dichte ~ 267 Moleküle pro µm2, vor decaging.</li>
	<li>Waschen Sie wie in Schritt 1.6 und in HBS erst unmittelbar vor Gebrauch.</li>
	<li>Fügen Sie 200.000 CD4+ oder CD8+ T Zellen, mit dem Ausdruck der entsprechenden TCR in jede Vertiefung und lassen Zellen bei 37 ° C für 15 min einhalten. Sobald Zellen befestigt und auf der Fläche verteilt haben, sind sie bereit für photoaktivierungen und Imaging. Hinweis: Retrovirale Transduktion von T-Effektorzellen mit fluoreszierenden bildgebende Sonden wird im Detail Elswhere6,7beschrieben. Kalzium-Signalisierung kann auch mit untransduced T-Zellen geladen mit dem Kalzium sensibler Farbstoff Fluo-46untersucht werden. Der ratiometrischen Farbstoff Fura-2 ist nicht empfehlenswert, weil es Erregung im UV-Bereich erfordert, die auch induziert decaging von Photoactivatable pMHC.</li>
</ol>2. die Bildaufnahme
<ol><li>Verwenden Sie einem inversen TIRF-Mikroskop mit einem UV kompatibel 150 X Objektiv für die Bildaufnahme ausgestattet. UV bestrahlen benutzerdefinierte Regionen mit einer digitalen Membran-System angeschlossen, um ein 100 W-Quecksilber-Lampe (HBO). Direkte UV-Licht von dieser Lampe auf die Probe mit einem 400 nm langen Pass Spiegel.</li>
	<li>Verwenden Sie Bildanalyse-Software für lokalisierte photoaktivierungen und Zeitraffer Erwerb. In den meisten Experimenten überwachen Sonden in den grünen und roten Kanälen mit 488 nm und 561 nm Anregung Laser, beziehungsweise. Laserlicht ist gerichtet auf die Probe mit einem Dual-Bandpass dichroitischen Spiegel, der auch im UV-Bereich (um decaging ermöglichen) überträgt. Weitere Informationen auf mikroskopkonfiguration finden Sie in der Tabelle der Werkstoffe und Abbildung 6 .</li>
	<li>Passen Sie nach der Montage der Kammer-Folie mit der T-Zellen Einstellungen an, um TIRF oder Epifluoreszenz-Beleuchtung, wie nötig zu erhalten. Wählen Sie im live-Modus einen Bereich von Zellen, die die fluoreszierenden Wortanzahl von Interesse zum Ausdruck bringen. Mikron-Skala Regionen für photoaktivierungen unter Einzelzellen mit Softwaresteuerung zu etablieren.</li>
	<li>Beginnen Sie Time-Lapse Erwerb. In der Regel 80 Zeitpunkten erworben werden, mit einem Intervall von 5 s zwischen jeden Zeitpunkt. Somit bleibt mehr als genug Zeit für sequentielle 488 nm und 563 nm Expositionen bei dual Farbe Experimente.</li>
	<li>Nach 10 Zeitpunkte, Photoactivate die ausgewählten Regionen durch Öffnen der digitalen Membran für 1-1.5 s Verschlusszeit.</li>
	<li>Nachdem die Zeitspanne abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Feld der Zellen, und wiederholen Sie den Vorgang.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
Hinweis: Lokalisierte photoaktivierungen immobilisierten Liganden erstellt eine wohldefinierte, stationäre stimulierende Region, die für Quantitative Analyse der Signalisierung Antworten und Zytoskeletts umgestaltet Veranstaltungen verwendet werden kann. Analyse Protokolle in der Regel beinhalten, Quantifizierung der Fluoreszenzintensität innerhalb der bestrahlten Region oder über der bestrahlten Region als positionelle Endpunkt für Distanzmessungen (zB. für die Beurteilung der Polarisation des Centrosome, die bestrahlten Region). Beide Analyseprotokolle sind nachfolgend beschrieben. Verschiedene interaktive Analyse Bildprogramme können verwendet werden, um Intensität und Abstandsmessungen, dann Ausgang zur weiteren Verarbeitung und Analyse werden kann.
<ol><li>
Fluoreszenzintensität
	<ol>
<li>Bestimmen der Fluoreszenzintensität (FI) einer Hintergrund-Region außerhalb der Zelle (FIb). Dies wird für die Hintergrundkorrektur verwendet werden.<ol>
<li>Zeichnen Sie einen Mikrometer großen quadratischen Bereich außerhalb der Zelle und machen Sie eine Maske zu. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte. Hinweis: Modalitäten (z.B. 3.1.1.1) beziehen sich auf Slidebook Software (siehe Tabelle der Materialien). Durchführung dieses Protokolls mit anderen Software-Paketen (zB., Fidschi) etwas anders.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die FI in der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt zu bestimmen.<ol>
<li>Wählen Sie die Maske um den Bereich zu markieren, der photoaktiviert war. Um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen, klicken Sie auf analysieren | Maske Statistik. Wählen Sie Meine Fluoreszenzintensität und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund FI aus den Messwerten der FI in der Region. Dann die korrigierte FI Messungen geteilt durch die durchschnittliche normalisieren, Hintergrund korrigiert FI die ersten 9 Frames vor photoaktivierungen. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FIb)). Hinweis: Graph ΔF/F als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernung
	<ol>
<li>Rufen Sie die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region, wählen Sie Maske um den Bereich zu markieren, die photoaktiviert war. Sobald die Region des photoaktivierungen markiert ist, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bestimmen die x- und y-Koordinaten für die fluoreszierenden Sonde von Interesse für jeden Zeitpunkt. Dies geschieht in der Regel durch manuelle oder automatisierte Teilchen verfolgen.<ol>
<li>Zu bestimmen, die x und y Koordinaten der fluoreszierenden Sonde von Interesse, wählen Sie Manuell Particle Tracking und klicken Sie auf die fluoreszierende Sonde von Interesse im Laufe der Zeit. Sobald alle Zeitpunkte verfolgt haben, wählen Sie analysieren | Statistiken zu maskieren | Der Mittelbereich und exportieren Sie die Werte.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie den Abstand zwischen den fluoreszierenden Proteins des Interesses und der Mitte der photoaktiviert Region für jeden Zeitpunkt unter Verwendung der Gleichung: Abstand = √ ((x2- X1)2+ (y2-y1)2), die x2 und y sind2 die Koordinaten des fluoreszierenden Proteins von Interesse und X1 und y1 die Koordinaten des Zentrums der photoaktiviert Region.</li>
		<li>Diagramm der Abstand als Funktion der Zeit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In den letzten Jahren hat Licht als ein ausgezeichnetes Werkzeug für raumzeitlich kontrollierte Aktivierung von zellulären Prozessen entstanden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, jede mit damit verbundenen vor- und Nachteile. Das System hier beschrieben wird, die auf die decaging von immobilisierten, extrazellulären Liganden, eignet sich besonders für die Analyse von rapid, subzelluläre, polarisierte Signalisierung Antworten. Dieser Ansatz wurde angewandt, um IS Bildung in T-Zellen wie oben beschrieben zu unt...

T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Immunität durch das erkennen Antigene Peptide, die im Rahmen der Zelloberfläche MHC angezeigt. Antigen-Anerkennung, die durch die TCR vermittelt wird, treibt die Differenzierung der naiven T-Zellen und fördert die Lieferung der Zytolyse und kommunikative Reaktionen der Effektor Populationen. TCR Engagement induziert auch dramatische Veränderungen in der zellulären Architektur. Innerhalb von Minuten die T-Zellen gloms auf der Seite der Antigen-präsentierenden Zelle (APC), bilden eine polarisierte Schnittstelle bekannt als der immunologischen Synapse (IS)1,2. Der IS potenziert T-Zell-Effektor-Reaktionen durch die Aktivierung der direktionalen Freisetzung von Zytokinen oder, im Falle von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs), lytische Proteine, die die APC zerstören.
TCR Engagement von pMHC induziert die schnelle Phosphorylierung mehrere nachgeschaltete Adapter Moleküle, einschließlich Linker für die Aktivierung von T-Zellen (LAT), die letztlich fördert robuste Umgestaltung der synaptischen cytoskelett2. Kortikale filamentösen Aktin (F-Aktin) treibt T Zelle auf der APC-Oberfläche verteilt und löst sich dann in eine ringförmige Struktur zeichnet sich durch F-Aktin-Ansammlung an der Peripherie IS und Erschöpfung von der Mitte. F-Aktin Ringbildung ist eng an die Neuausrichtung der Mikrotubuli organisierenden Zentrum (MTOC, auch genannt die Centrosome in T-Zellen) an eine Position unterhalb der Mitte der Schnittstelle gekoppelt. Beide Veranstaltungen auftreten innerhalb von Minuten der erste Antigen-Anerkennung und den architektonischen Kontext, in dem nachfolgenden Aktivierung Veranstaltungen, den und Effektor Reaktionen auftreten, zu etablieren.
Um IS Bildung zu untersuchen, haben verschiedene Labors Ansätze entwickelt, in denen die APC durch eine Glasoberfläche, die ersetzt wird entweder immobilisierte Liganden TCR enthält oder ein Lipid Bilayer unterstützt, dass selbst die Liganden3,4enthält. T-Zellen bilden IS-ähnliche Kontakte auf diesen Flächen, die durch Totalreflexion Fluoreszenzmikroskop (TIRF) oder konfokalen Mikroskopie, hochauflösende Studien der frühen T-Zellaktivierung und IS Bildung abgebildet werden können.
Obwohl diese Ansätze für ausgezeichnete Visualisierung des fertig montierten IS erlaubt haben, tritt ein Großteil der Signalisierung folgende TCR:pMHC Ligatur innerhalb von Sekunden, erschweren die Bemühungen um die Abfolge der Ereignisse nach TCR Aktivierung genau bestimmen . Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein photoaktivierungen Konzept entwickelt, in denen verwendet wird Photoactivatable pMHC, räumlich-zeitliche Kontrolle der TCR Aktivierung5,6,7zu erreichen. In diesem System sind T-Zellen Glasflächen mit Photoactivatable pMHC, die nicht-stimulierende, TCR bis Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht ist beigefügt. UV-Bestrahlung ein Mikrometer großen Bereich der Oberfläche unter der T-Zelle entfernt die Photocage schaffen eine anregende Zone, die von der T-Zellen erkannt werden kann. Ereignisse nach dem Bilanzstichtag Signalisierung und Zytoskeletts Umbau werden dann durch genetisch codierte fluoreszierende Reporter überwacht. Zwei Photoactivatable Versionen von Antigenen Peptide, Motte Cytochrom C88-103 (MCC) und Ovalbumin257-264 (OVA), die im Zusammenhang mit der Klasse II MHC-Ek und die Klasse ich MHC H2-Kb, bzw. vorgestellt werden, wurden entwickelt (Abbildung 1). Dies ermöglicht die Analyse der beiden CD4+ T-Zellen spezifisch für MCC-I-E-k (mit dem Ausdruck der 5 C. C7, 2B4, oder AND TCR) und CD8+ T-Zellen spezifisch für OVA-H2-Kb (mit dem Ausdruck der OT1 TCR).
Im letzten Jahrzehnt ist der TCR photoaktivierungen und Imaging-Ansatz, die präzise Kinetik der frühen TCR Signalisierung Schritte zu etablieren und zu identifizieren, die molekulare Wege polarisiert Zellskelett Umbau5, EZB verwendet worden 6 , 7 , 8 , 9 , 10. beispielsweise der Test war maßgeblich bei der Bestimmung, dass Centrosome Neuorientierung in Richtung der APC wird durch eine lokalisierte Steigung von Lipid zweite Bote Diacylglycerol zentriert auf den IS vermittelt. Es wird erwartet, dass diese Methodik wird weiterhin wertvoll für Anwendungen, die hochauflösenden bildgebenden Analyse des T-Zellfunktion zu fordern.

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Will be used to biotinylate proteins</td></tr><tr><td>Biotinylated Hb I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &amp;alpha;H2-K&lt;sup&gt;k&lt;/sup&gt; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-OVA H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Hand held UV lamp</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamp is held &amp;lt; 1 cm from the sample.&amp;nbsp; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Additional information about the imaging system can be found in &lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 6&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

T-Lymphozyten engagieren sich in schnellen, polarisierte Signale, tritt innerhalb von Minuten nach der Aktivierung des TCR. Dies induziert Bildung der immunologischen Synapse, eine stereotype Zell-Zell-Kreuzung, die T-Zell-Aktivierung reguliert und direktional richtet sich an Effektor Antworten. Um diese Prozesse effektiv zu studieren, ist ein bildgebender Ansatz, der zugeschnitten ist zur Erfassung schneller, polarisierter Antworten notwendig. Dieses Protokoll beschreibt ein solches System, basiert auf einer Photoactivatable Peptid-Major Histocompatibility complex (pMHC), das nicht-stimulierende bis UV-Licht ausgesetzt ist. Gezielte decaging von diesem Reagens während Videomicroscopy Experimente ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der TCR-Aktivierung und hochauflösende Überwachung der anschließende zelluläre Reaktionen der Totalreflexion (TIRF) imaging. Dieser Ansatz ist auch kompatibel mit genetischen und pharmakologischen Störung Strategien. Dies ermöglicht die Montage von klar definierten Molekulare Signalwege, die TCR-Signalisierung link zur Bildung der polarisierten Zellskelett Strukturen, die die immunologische Synapse zugrunde liegen.

Der photoaktivierungen und Imaging Ansatz ermöglicht für Beobachtung und einfache Quantifizierung von rapid, polarisierte Signalisierung Antworten. Um seine Fähigkeiten, reproduziert zu illustrieren hier ist ein Experiment, die räumlich-zeitliche Korrelation zwischen TCR-induzierte DAG Akkumulation und Centrosome Neuorientierung zu prüfen. 5 C. C7 T Zelle Blasten waren retrovirally mit zwei Leuchtstoffröhren Reporter ausgestrahlt: ein DAG-Biosensor mit Tandem-C1-Domänen von Protein...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Aufrufe.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Dieses Protokoll beschreibt eine Imaging-basierte Methode zur Aktivierung der T-Lymphozyten mit Photoactivatable Peptid-MHC, ermöglicht präzise räumlich-zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung.

Serie: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Forschung

Biotechnik

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genetik

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Immunologie und Infektion

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologie

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Neurowissenschaften

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

Einzelne Kette MHC-Technologie zur Co-Agonismus in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain unanswered. One requirement for advancements in our understanding of the underlying disease mechanisms and cellular dynamics is the precise coupling of the microanatomical location of cell subsets with downstream molecular or functional analyses; a goal that has traditionally been difficult to achieve. The development of stable photoactivatable biological fluorophores and their integration into reporter strains has recently enabled precise microanatomical labeling and tracking of cellular subsets in murine models. Here, we describe how the ability to analyze autoreactive lymphocytes from single germinal centers may help to provide novel insights into autoimmunity, using the combination of a novel chimeric model of autoimmunity with a photoactivatable reporter as an example. We demonstrate a procedure for generating mixed chimeras with spontaneous autoreactive germinal centers populated by lymphocytes carrying a photoactivatable green fluorescent protein reporter. Using in vivo labeling strategies, single germinal centers can be visualized in explanted lymphoid tissues and their cellular constituents photoactivated by two-photon microscopy. Photoactivated lymphocytes from single germinal centers can then be analyzed or sorted flow cytometrically, as single cells or in bulk, and may be subjected to additional downstream molecular and functional analyses. This approach may directly be applied to provide renewed insights in the field of autoimmunity, but the procedure for generating bone marrow chimeras and the photoactivation procedure may additionally find broad application in studies of infectious diseases and tumor metastases.

This protocol describes the generation of mixed murine bone marrow chimeras with spontaneous autoimmune germinal centers, in which autoreactive lymphocytes carry a photoactivatable green fluorescent protein (PA-GFP) reporter. This provides the ability to link cellular location in tissues with downstream molecular and functional analyses.

Abfragenden einzelne autoreaktive Germinal Center von Photoaktivierungen in einem gemischten Chimären Modell von Autoimmunität

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optogenetische Kontrolle der Enzymaktivität mit lichtregulierten allosterischen Schaltern

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most optogenetic approaches often face significant challenges in integrating multiple capabilities in a single tool applicable to a wide range of target proteins. Achieving precise control over ON/OFF kinetics, ensuring minimum leakiness in the dark, and demonstrating efficient performance in mammalian cells with subcellular precision are some of the most common challenges faced in this field. A promising solution lies in the application of rationally designed light-sensitive domains to allosterically control protein activity. Using that strategy, we generated an optogenetic method combining all the desired features. The approach involves the incorporation of the Light-regulated allosteric switch module (LightR) in the target protein to regulate enzyme activity using blue (465 nm) light. The LightR domain is generated by linking two Vivid (VVD) photoreceptor domains, creating a light-sensitive clamp that can be incorporated into a small flexible loop within the catalytic domain of an enzyme. In its dark state, LightR clamp is open, thus distorting the enzyme&#39;s catalytic domain and inactivating it. Upon exposure to blue light, the LightR domain closes and restores the catalytic domain&#39;s structure and enzyme activity. In this manuscript, we discuss design strategies&#160;to generate a light-regulated protein kinase and demonstrate its control by blue light, reversibility, kinetics, and precise regulation at the subcellular level, enabling tight spatiotemporal precision. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, we showcase a protocol for effectively regulating LightR-Src kinase activity. We also demonstrate LightR applicability across different enzyme classes, expanding the utility of the tool system in addressing mechanistic questions of signaling pathways in different diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>Raumzeitliche Steuerung der Proteinaktivität durch optogenetische allosterische Regulation

This protocol describes the application of an engineered blue-light-activated allosteric switch (LightR) domain for reversible spatiotemporal control of protein activity. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, this study offers an elaborate protocol for developing and characterizing light-regulated Src (LightR-Src). It demonstrates the versatility of this approach across enzyme classes.