Wir danken John Darga der MGH DNA-Core für die Erstellung des DNA-Screening-Bibliothek. Christopher Chigas von Perkin Elmer unschätzbare Unterstützung für unsere Wallac 1420 Luminometer. Steven Ciacco und Martin Thomae von Agilent unterstützte die Bravo-Roboter. Wir danken Ron Johnson und Steve Titus am NIH für die großzügige Bereitstellung ihrer Dual-Luciferase-Assay-Protokoll glühen.

Für eine experimentelle Übersicht siehe Abbildung 1. 1. Bereiten Reporter Plasmide, die die Alpha-Synuclein Promoter Regulatorischen Elemente des alpha-Synuclein-Gen (Fig. 2) erstrecken etwa 10 kb, von der stromaufwärts NACP (Nicht-A-beta-Peptid Amyloid-Komponente) 1,2-Dinukleotid-Repeat-Sequenz durch Introns 2 3. Wir schließen einen Teil dieser Region unsere Reporter-Konstrukt. Wir fanden, daß Plasmide, die Intron 2 erforderliche spezielle Verfahren für das Wachstum, wie unten beschrieben. Die Luciferase-Plasmiden pGL4.10 und pGL4.75 (Fig. 3), sind im Handel von Promega und kann unter Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Protokollen vermehrt werden. <ol><li> Verstärken die zwei Komponenten des Alpha-Synuclein-Promotor in getrennten PCRs mit dem Rezept in Tabelle 1 und der Primer in Tabelle 2. </li><li> Verify PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel und sauber unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) unter Elution in 50 &amp;mgr; l TE (Tris-EDTA). Bewahren Sie die eluierten 0,9 kb-Fragment bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. </li><li> Verdauen das gesamte Volumen des 3,4 kb PCR-Fragment sowie 5 ug pGL4.10, mit SacI und XhoI. Behandeln Sie den Vektor mit Kalbsdarm-Alkalische Phosphatase (Roche) und Gel reinigen mit dem Purelink Schnell Gel Extraction Kit (Invitrogen). </li><li> Ligation des Fragments und Vektor Verwendung von T4-DNA-Ligase (NEB). Reinigen Sie das ausgefüllte Reaktion unter Verwendung des Purelink Micro PCR-Kit (Invitrogen) unter Elution in 10 ul TE-Puffer. </li><li> Transformations 2 ul des gereinigten, Ligation in 20 ul ElectroMAX Stbl4 kompetente Zellen (Invitrogen) und Elektroporation gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schütteln in einem 30 ° C Inkubator bei 225 Upm für 90 min. Verbreiten 2 Volumina auf LB-Platten, die 100 mg / ml Ampicillin und Inkubieren bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Mit einem Zahnstocher, wählen Sie 4-6 kleine Kolonien für die Impfung in 2 ml TB (Terrific Broth). Wachsen diese Miniprep Kulturen in ein 30 º C-Schüttler O / N. </li><li> Reinige Plasmid-DNA aus 1,5 ml jeder Kultur Miniprep mit dem Purelink HiPure Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen). </li><li> Verdauen die Minipräparationen mit BamHI und Elektrophorese auf einem Agarose-Gel. Die richtige Klon sollte Fragmente von 2,8 kb und 4,9 kb zu produzieren. </li><li> Restreak die verbleibende Miniprep-Kultur von der richtigen Klons auf eine frische LB (Luria Broth)-Platte und wachsen bei 30 ° C für 2 Tage. </li><li> Wählen Sie einen kleinen Kolonie und impfen 1,5 ml TB Starterkultur. Schütteln Sie O / N bei 30 ° C Lassen Sie sich nicht die Starterkultur zur Sättigung wachsen. </li><li> Verdünnt das gesamte Starterkultur in 150 ml vorgewärmtem TB und schüttelt bei 30 ° C für 2 Tage. Bevor Sie mit dem nächsten Schritt, verwenden Sie 1,5 ml dieser Kultur für eine zusätzliche Miniprep und Verdauung zu bestätigen, dass der Klon nicht während replicati mutieren<html> auf. </li><li> Reinige Plasmid-DNA aus den verbleibenden Kultur mit dem Purelink HiPure Maxiprep Plasmid-Kit (Invitrogen). Erwartete Erträge dieses Zwischen Plasmid sind 50-150 g pro 150 ml der Kultur. </li><li> Auftauen 0,9 kb-Fragment in Schritt 1.2 eingefroren. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.12, die 0,9 kb-Fragment in die Zwischen Plasmid klonen, zu verdauen, statt mit KpnI und SacI. Ligats, umzuwandeln, wählen Sie, und wachsen für Maxipreps wie oben. Digestion mit BamHI sollten Fragmente von 5,8 kb und 2,8 kb ergeben. Dies ist das Plasmid, das für den Bildschirm verwendet werden. </li></ol> 2. Bereiten 293T-Zellen, Reporter Plasmide und DNA-Bibliothek für Screening 293T-Zellen werden zunächst in 96-Well-Platten transfiziert und am folgenden Tag. Reporter-Plasmide und DNA-Bibliothek werden in 96-Well-Platten verdünnt. Wir erhaltenen Platten der Transfektion-Grade-Bibliothek-DNA aus der DNA-Core am Massachusetts General Hospital (bekommen = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Dieses Protokoll transfiziert eine einzelne Bibliothek Platte in zwei identische Platten von 293T-Zellen (Abbildung 1), sollten also 2 Platten von Zellen für jede Bibliothek Platte abgeschirmt werden ausgesät werden. Hinweis: Wachsen Zellen in Medium ohne Phenolrot oder Antibiotika, da diese nicht mit den Luciferase-Assays und erhöhen Toxizität während der Transfektion sind. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, resuspendieren trypsiniert 293T Zellen auf eine Konzentration von 1,5 x 10 5 Zellen / ml in DMEM, das 14% FBS gescreent werden. Gießen Sie in einen sterilen Behälter (Axygen). </li><li> Setzen Sie den Behälter, 2 klarem Boden, 96-Well-Platten (Corning) und eine Schachtel Filterpipettenspitzen (Agilent) auf der Roboter-Deck. Verteilen von 100 &amp;mgr; l Zellen in jede Vertiefung der beiden Platten bei einer Dichte von 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellplatten bei 50 g für 2 min, mit niedrigen Drehzahlen, gleiche Rampe zu gewährleistenZelldichte während jeder gut. Bei 37 ° C und 10% CO 2 O / N. </li><li> Verdünnen Sie die Firefly-und Renilla Reporterplasmide bis 5 ng / ul in Serum-freien Medien. Kombinieren der Verdünnungen im Verhältnis 5:3 Glühwürmchen Renilla-Plasmid (das Volumen) in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pipettieren die kombinierten Plasmide in jedes Well einer 96-Well-Platte, Abgabe 17 ul pro Bibliotheksplatte plus 2-10 ul Überschuss, in jede Vertiefung. </li><li> Erhalten Transfektion-Grade-DNA-Bibliothek Platten wie oben und mit Wasser auf 13,3 ng / ul mit Endotoxin-freiem Wasser. Das Mindestvolumen pro Well 28 ul sein sollte. </li></ol> 3. Führen Transfektionen Am Tag 2 des Bildschirms werden Reporterplasmide und Bibliotheks DNAs in 293T-Zellen transfiziert. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, mischen 107,5 ul RT Optifect (Invitrogen) mit 4,3 ml Serum-freien Medien (1:40-Verdünnung) in einem Polystyrolröhrchen. Inkubation für 5 min bei RT undn verzichten 44 ul (pro Bibliothek Platte) in jedes Well einer 96-Well-, Polystyrol V-Bodenplatte (Greiner). </li><li> Die Platte des verwässerten Optifect, Reporter-Plasmide (Schritt 2.5), Bibliothek DNAs (Schritt 2.6), und eine Schachtel-Pipettenspitzen auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 17 ul Reporterplasmide, 43 ul verdünnte Optifect und 26 ul DNA-Bibliothek, Einfügen eines 5 ul Luftspalt zwischen den einzelnen Streben. Die Bibliothek DNA sollte zuletzt angesaugt werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. Dispense den Inhalt der Tipps in eine neue Polystyrol V-förmigen Platte, mischen, Deckel, und beiseite stellen für 20 Minuten, damit Lipid / DNA-Komplexe zu bilden. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Pipettenspitzen und Bibliotheksplatte, und wiederholen. </li><li> Entdecken Sie die Optifect / DNA-Gemisch Platte und legen Sie es auf die Roboterplattform mit 2 Platten von 293T-Zellen. Mit einer einzigen Box von Pipettenspitzen, aspirieren 80 ul der Optifect: DNA-Gemisch und langsam 40 ul verzichten auf jede Platte von Zellen. Wenn transkleinerung, Desinfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Optifect: DNA-Platten. Decken-Zellen. </li><li> Zentrifugieren der Zellplatten bei 1200 × g für 30 min. Decken und zurück in den Inkubator. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen für 4-6 Stunden. Während dieser Inkubation bereiten frische Medien durch Mischen von 12 ml DMEM mit 10% FBS und 10 pg / ml Ciprofloxacin (CellGro) für jede Bibliothek transfiziert Platte. Gießen Sie frisches Medium in einem sterilen Behälter. </li><li> Platz 2 Boxen der Roboter-Tipps, eine einzige Platte von Zellen, das Reservoir mit frischem Medium und einen Abfallbehälter auf der Roboterplattform. Aspirat 100 ul Medium aus den Zellen und Abgabe in den Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Mit frischen Tipps, absaugen 100 ml frisches Medien und langsam auf die Zellen zu verzichten. Wiederholung für alle Platten der Zellen. </li><li> Rückgabe Platten in den Inkubator für 48 Stunden. </li></ol> 4. Führen Dual-Luciferase-Assays Am Tag 4 des Bildschirms, dieGlühwürmchen-und Renilla-Luciferase-Assays durchgeführt werden. Hinweis: Die Dual-Luciferase-Assay erfordert die sequentielle Zugabe von 2-Assay-Puffer, 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und 3X Renilla Assaypuffer, wie in Tabelle 3 beschrieben Firefly Luciferase und Renilla nicht sezerniert wird, so müssen die Zellen vor der Messung der Luciferase-Aktivität, lysiert werden. . Firefly-Assay-Puffer lysiert Zellen und bietet Substrat für die Firefly Luziferase; Renilla-Assay-Puffer löscht den Glühwürmchen-Signal und liefert Substrat für die Renilla-Luciferase. <ol><li> Für jede Bibliothek Platte, bereiten 8 ml 3X Glühwürmchen Testpuffer aus Stammlösungen, wie in Tabelle 3 beschrieben, und verzichten 82 ul in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. </li><li> Für jede Bibliothek Platte, bereiten auch 12 ml 3X Renilla-Assay-Puffer und 122 ul verzichten in jedes Well einer 96-Well-V-Bodenplatte. Beiseite sowohl dieGlühwürmchen und Renilla-Assay-Puffer. </li><li> Legen Sie ein Feld von Pipettenspitzen, ein Abfallbehälter und 2 Platten von Zellen (aus derselben Bibliothek Platte transfiziert) auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 60 ul Medien von jeder Platte und entsorgen in der Abfallbehälter teilweise mit 70% Ethanol gefüllt. Deckplatten und beiseite stellen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Sätze Teller. </li><li> Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 40 ul 3X Glühwürmchen-Assay-Puffer und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf neue Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Zeigen Zellen bei RT für 10 min, um die Lyse zu vervollständigen. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, ersetzen Sie die Boxen von Tipps und Zellplatten, und wiederholen. </li><li> Rekord Lumineszenz aus jeder Vertiefung jeder Zelle Platte auf einem Luminometer, Aufzeichnung für 1 Sekunde pro Vertiefung. Rückgabe Platten auf den RoboterDeck. </li><li> Platz 2 Boxen von Pipettenspitzen, die Platte von 3X Renilla-Assay-Puffer, und eine Reihe von Zellplatten auf der Roboterplattform. </li><li> Saugen Sie 60 ul 3X Renilla-Assay-Puffer, und es an die erste Platte von Zellen hinzuzufügen, gründlich mischen. Die Umstellung auf eine neue Box von Pipettenspitzen, wiederholen Sie für die zweite Zelle Platte. Wenn Transfektion mehrere Bibliotheksplatten, wiederholen Sie für alle Gruppen von Zellplatten. </li><li> Rekord Lumineszenz von allen Platten auf einem Luminometer, Aufzeichnen jeder gut 1 Sekunde wie oben. Entsorgen Platten. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Berechnen Sie die Glühwürmchen: Renilla-Lumineszenz-Verhältnis (&quot;F: R-Verhältnis&quot;) für jede gut durch Teilung des Grafen von Glühwürmchen-Signal von den Grafen von Renilla-Signal. </li><li> Berechnung der Induktion durch Teilen der F R-Verhältnis jedes vom durchschnittlichen F: R-Verhältnis der Platte, mit Ausnahme der höchsten und der niedrigsten 25% der Vertiefungen. </li><li> Mittelwert der Induktionswerte über Wiederholungenfür eine einzelne Bibliothek transfiziert Platte. Gene induzieren oder Unterdrückung alpha-Synuclein mehr als drei Falten werden in diesem Bildschirm als &quot;Treffer&quot; und unterliegen weiteren Validierung und sekundären Bildschirmen. </li></ol>

<ol>
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Diese Arbeit wurde durch Lizenzgebühren von der Lizenzierung BacMamreagents (US Patent 5.731.182) erhalten unterstützt.

Alpha-Synuclein in der Parkinson-Krankheit (PD) als Bestandteil der Lewy-Körper 4, intrazellulären Einschlüssen als pathognomonisch für die Krankheit in Verbindung gebracht. Zahlreiche genomweiten Assoziationsstudien haben Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Alpha-Synuclein mit einem erhöhten Risiko für sporadische PD 5,6,7 verbunden. Obwohl weniger verbreitet als sporadische PD, familiäre PD kann auch durch Mutationen im Alpha-Synuclein 8 verursacht werden, sowie Vervielfältigung...

Die Fähigkeit, wichtige genetische Regulationselemente und die Faktoren, die auf sie einwirken zu identifizieren, ist für die Exploration von zahlreichen biologischen Prozessen fundamental. Jedoch Faktoren zu identifizieren, die die Expression von Genen in seltenen Zelltypen regulieren, wie spezifische neuronale Populationen, kann schwierig sein. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von neuartigen Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein (SNCA) präsentieren wir ein Gen, das mit der Parkinson-Krankheit und der dopaminergen Neuronen in der substantianigra ausgedrückt pars compacta Bereich des Mittelhirns. Wir erreichen dies mit einem Hochdurchsatz-, Dual-Luciferase, in-vitro-Reporter Bildschirm, um Alpha-Synuclein-Expression in 293T-Zellen zu dekonstruieren. Die alpha-Synuclein-Promotor wird zunächst in einem Reporterplasmid, das den Glühwürmchen-Luciferase-Gen kloniert. Ein handelsübliches Plasmid, das das Renilla-Luciferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors dient als interne Kontrolle. These-Reporter-Konstrukte in 293T-Zellen cotransfiziert in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek, so dass jede Vertiefung mit einer einzigen Bibliothek transfiziert. Nach 48 Stunden Luciferase-Aktivität für jeden Reporter sequentiell unter Verwendung eines Dual-Schein-Assay gemessen. Renilla-Luciferase-Aktivität in jeder Vertiefung (F: R-Verhältnis) nach der Plattenbasis Normalisierung der relativen Expression von alpha-Synuclein in Reaktion auf jede Bibliothek Gen wird durch das Verhältnis von Glühwürmchen abgeleitet. Dieses Protokoll stellt die Fähigkeit, eine große Anzahl von Genen (~ 2.500 pro Woche) auf ihre Fähigkeit, ein Reportergen zu trans Verwendung minimaler Arbeitskraft (1-2 Personen) und minimalen Kosten (etwa 3 $ Reagenzienkosten pro Mikroassay) zu screenen. Transkriptionsregulatoren der neuronalen Gene (z. B. alpha-Synuclein), die schwierig in kultivierten Neuronen refraktär genetische Manipulation zu studieren, können Seite an Seite in dieser direkten funktionellen Assay verglichen werden. Wir sind in unsererProtokoll eine ausführliche Verfahren für das Klonen und das Wachstum der Plasmide, die das Alpha-Synuclein-Promotor, da wir festgestellt, dass Plasmide, die diese Region instabil sind, wenn sie mit herkömmlichen Verfahren (siehe Diskussion) gewachsen. Wir berücksichtigen auch eine kostengünstige Alternative zu handelsüblichen Dual-Luciferase-Reagenzien für die Hochdurchsatz-Assays. Dieses Protokoll kann leicht an andere regulatorische Elemente von Interesse, oder zu jedem Prozess eine hohe Durchsatz transienten Transfektionen Ziel werden.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

Wir stellen eine schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-Screening-Protokoll zur Transkriptionsregulatoren der alpha-Synuclein-Gen mit einer Parkinson-Krankheit zu identifizieren. 293T-Zellen transient mit Plasmiden aus einem Array ORF Expressionsbibliothek transfiziert zusammen mit Luciferase-Reporter-Plasmide, in einem Ein-Gen-per-Well-Mikroformat. Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wird nach 48 Stunden, um die Wirkungen von jeder Bibliothek Gen auf alpha-Synuclein-Transkription, normiert auf die Expression von einer internen Kontrollkonstrukt (hCMV-Promotor, eine Renilla-Luciferase) zu bestimmen, untersucht. Dieses Protokoll wird von einer Bank-Top-Roboter in einer Biosicherheitsschrank eingeschlossen, die aseptische Handhabung von Flüssigkeiten in 96-Well-Format führt erleichtert. Unsere automatisierten Transfektionsprotokolls ist leicht an Hochdurchsatz-Bibliothek lentivirale Produktion oder andere funktionelle Screening-Protokolle Triple-Transfektionen von einer großen Anzahl von einzigartigen Bibliothek Plasmide in konjugierte erfordernnktion mit einem gemeinsamen Satz von Helfer-Plasmide. Wir stellen auch eine kostengünstige und validiert Alternative zu handelsüblichen, Dual-Luciferase-Reagenzien, PTC124, EDTA und Pyrophosphat Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität vor der Messung der Renilla-Luciferase verwendet drücken. Mit Hilfe dieser Methoden, abgeschirmt wir 7670 menschliche Gene identifiziert und 68 Regulatoren der alpha-Synuclein. Dieses Protokoll ist leicht modifizierbar, um andere Gene von Interesse abzielen.

Typische Luciferase-Werte, F: R-Verhältnisse und Induktion Werte für ein einzelnes Halbplatte sind in Abbildung 4 dargestellt Beachten Sie die Hit in gut H2, einem 32-fach-Induktor.. Gene verursacht übermäßige Toxizität (z. B. auch E3), oder Brunnen, die schlecht transfiziert wurden, werden niedrige Werte sowohl für Glühwürmchen und Renilla Luciferase produzieren, aber eine durchschnittliche Induktionswert. Genen, die nicht-spezifische Induktion der Luciferase-Aktivität, möglicherwei...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital.  Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen. 

Serie: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...