Hirschil Trust, Michael Saperstein Medical Wissenschaftler Forschungsgelder und die NYU Whitehead Gemeinschaft unterstützt diese Arbeit.

1. Beschichtung der Mikrotiterplatte Wells Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Beschichtung Polystyroloberflächen mit ICAM-1 als Liganden für die T-Zell-LFA-1 zu dienen. <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Lösungen: <ol><li> Vorbereitung der Beschichtungslösung durch Resuspendieren rekombinantem ICAM-1 mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) mit Calcium (1 mM angereichert CaCl 2) und Magnesium (2 nM MgCl 2). Achten Sie darauf, dass die endgültige Konzentration von ICAM-1 ist 10 ug / ml, von einer 0,7 mg / ml Stammlösung hergestellt und in einem -80 ° C Gefrierschrank aufbewahrt. </li><li> Vorbereitung der Haftlösung durch Anreicherung PBS mit 0,5% menschlichem (oder Rinder-), Serumalbumin (HSA / BSA), 2 mM MgCl 2 und 1 mM CaCl 2. </li><li> Bereiten Sie die Waschlösung durch Zugabe von 2 mM MgCl 2 und 1 mM CaCl 2 bis PBS. Warm alle Lösungen auf 37° C vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> Wasch 24 Vertiefungen mit 50 &amp;mgr; l Waschlösung. Dazu gehören ungewaschenen Brunnen, positive (PMA behandelten Zellen) und negativ (unbeschichteten Wells) Kontrollen. Für jede Bedingung gesetzt mindestens drei Brunnen (dreifach). </li><li> Dann werden 50 ul Beschichtungslösung in jede Vertiefung. Auf die unbeschichteten Kontrollvertiefungen nicht hinzufügen. Inkubieren für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator. </li><li> Saugen Sie den Beschichtungslösung sanft, ohne dass die Spitze auf den Boden der Wells berühren. Einmal mit 50 &amp;mgr; l der Waschlösung waschen. </li><li> In 50 ul Haftlösung und inkubieren Sie die Platte für eine Stunde innerhalb 37 ° C Inkubator. </li><li> Saugen Sie sanft und einmal waschen mit 50 ul Waschlösung. Verwenden Sie die Platte am selben Tag, jedoch ist es möglich, sie bei 4 ° C über Nacht zu halten und ihn am folgenden Tag. </li></ol> 2. T-Zell-Isolierung aus Blut <ol><li> In humanen T-Zell-Anreicherung Cocktail in 50 ul / ml of Vollblut (zB für 3 ml Antikoagulans (Heparin, EDTA oder Citrat) Vollblut, fügen Sie 150 ul Cocktail). Gut mischen. </li><li> Inkubieren 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> In ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen 3 ml behandeltem Blut und ein gleiches Volumen von PBS (ohne Calcium und Magnesium) mit 1% D-Glucose bei Raumtemperatur angereichert. Mischen Sie vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette. </li><li> 15 ml Ficoll-Paque PLUS in das Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vorsichtig schichten 6 ml Blutprobe auf der Lymphozytenisolationsmedium verdünnt. </li><li> Zentrifuge bei 400 g für 20 min bei 20 ° C mit Break aus. </li><li> Zeichnen Sie die obere Schicht mit einem sauberen Pasteur-Pipette, so dass die Lymphozyten-Schicht ungestört an der Schnittstelle. Die obere Schicht des Plasma kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Mit einem sauberen Pasteur-Pipette übertragen Sie die Lymphozytenschicht auf ein sauberes Zentrifugenrohr. </li><li> Add 3 Volumina (9 ml) PBS zu den Lymphozyten. Suspend die Zellen durch leichtes draFlügel sie in eine und aus einer Pasteur-Pipette. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 20 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Die Lymphozyten sollte nun in der geeigneten Medium zur Anwendung ausgesetzt. Übertragung der Zellen auf ein T-75 Kulturflasche in 20 ml RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin. </li></ol> 3. Präparation der Zellen Hinweis: Voraussetzung ist, dass die Zellen mit einem fluoreszierenden Reagens markiert werden. In diesem Protokoll Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE), aber das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren, Zellen sind eine akzeptable Alternative. <ol><li> Zählen 2,4 x 10 6 T-Zellen (1 × 10 5 pro Vertiefung) mit einer Zählkammer. </li><li> Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium kein Serum (Serumentzug). Die Zellen für 2 Stunden inkubieren bei 37 ° C im Brutschrank. </li><li> Zentrifugieren der Zellen für 5 min (400 × g). Saugen Sie die Medien undResuspendieren in 1 ml PBS. </li><li> In CFSE bei 1:1000 Verdünnung (Lager bis 5 mm). Cover von Licht und Inkubation für 8 min bei Raumtemperatur. </li><li> Die Reaktion durch Zugabe von 10 ml 37 ° C PBS und Spin bei 400 g für 5 min. </li><li> Resuspendieren Zellpellet mit 1,2 ml vorgewärmter Haftlösung (1 × 10 5 Zellen pro 50 ul). </li></ol> 4. Stimulation der Zellen Hinweis: Um die Adhäsion zu initiieren, müssen Zellen stimuliert werden. Im folgenden Experiment werden die Zellen über die TCR-Verwendung von Anti-CD3-Antikörper stimuliert Vernetzungs jedoch löslich SDF-1 könnte als Alternative dienen. Je nach Ziel der Experimente könnten verschiedene pharmakologische Reagenzien vor oder während der Stimulation zugegeben werden, um die Auswirkungen auf zelluläre Adhäsion zu untersuchen. Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) ist ein Phorbolester, die strukturell ähnlich zu der zweiten Messenger Diacylglycerol (DAG) ist und somit aktiviert mehreren Kinases Downstream der TCR (hauptsächlich Protein Kinase C); Hier ist es als eine positive Kontrolle verwendet wird. <ol><li> Wärmen Sie die Mikrotiterplatte bis 37 ° C </li><li> Teilen Sie die Zellen in 1,5 ml 8 leere Rohre (150 ul in jeder Röhre), ein Rohr für jede Bedingung. </li><li> Behandeln Sie die Zellen entsprechend: <ol><li> Stimulieren Sie ein Rohr mit PMA bei 10 ng / ml als Positivkontrolle dienen. Halten Sie drei Rohre unbehandelt, als Steuer zur Stimulation (&quot;keine Stimulation&quot;), ungewaschen Ladekontrolle (&quot;no wash&quot;) und Steuerung für ICAM-1-Beschichtung (&quot;unbeschichtet&quot;) dienen. </li><li> Stimulieren vier Röhren mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper (0,1, 1, 5 und 10 ug / ml). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerungen. </li></ol></li><li> Aliquot 50 ul stimulierten Zellgemisch in jedem leeren Brunnen. Die endgültige Anzahl der Zellen pro 1 x 10 5. </li><li> Setzen Sie den Mikroplatten im 37 ° C Inkubator für 15 min. Hinweis: Einige T-Zelllinien erfordern kürzere Stimulation<html> tion der Zeit. Während dieser Zeit werden die Zellen an den Boden der Wells niederzulassen und sich an die Zielliganden. </li></ol> 5. Abwaschen nicht adhärenten Zellen Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, Zellen, die nicht in der Lage, enge Kontakte mit dem Liganden-beschichteten Oberflächen zu bilden waren zu entfernen. Verwenden einer Mehrkanalpipette zu diesem Schritt, um zu gewährleisten, dass die gleiche physikalische Kräfte in jede Vertiefung aufgetragen. Es ist wichtig, die angegebenen Kontrollvertiefungen ungewaschen, in die Berechnung des Prozentsatzes der adhärenten Zellen behilflich zu halten. <ol><li> In 150 ul warmen Haftung Lösung zu jedem Brunnen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig für einige Sekunden, bevor Sie das Medium aus den Vertiefungen. Den Boden der Wells Berühren Sie nicht mit den Tipps. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Ändern Sie die Richtung der Pipette beim Pipettieren der Puffer ein und aus. </li></ol> 6. Bestimmung der Prozentsatz der adhärenten Zellen _content &quot;&gt; Hinweis: In diesem Schritt wird ein Fluoreszenzplattenlesegerät wird die Fluoreszenzintensität in jedem gut messen Die Intensität ist in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der adhärenten Zellen.. <ol><li> Schalten Sie den Plattenlesegerät. Öffnen Sie die Platte-Reader-Software, indem Sie auf das Verknüpfungssymbol auf dem Desktop. <ol><li> Wählen Sie im Menü &quot;Task&quot; klicken Sie auf &quot;Neu&quot;, um die Einrichtung eines neuen Protokolls. </li><li> Wählen Sie im Menü &quot;Aktionen&quot; wählen Sie die Option &quot;Lesen&quot;. Klicken Sie auf &quot;Fluoreszenzintensität&quot; und auf den &quot;Ok&quot;-Registerkarte. </li><li> Wählen Sie im Dropdown-Menü wählen Sie &quot;Anregungswellenlänge 485&quot; und &quot;Emissionswellenlänge 528&quot;. Drücken Sie die &quot;OK&quot;-Registerkarte. </li><li> In &quot;Optik&quot; Optionsmenü wählen Sie &quot;Bottom&quot; und auf den &quot;Ok&quot;-Registerkarte. Gehen Sie zurück in das Menü &quot;Aktionen&quot; und die Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf &quot;Ok&quot;. </li><li> Legen Sie die in den Mikroplattenleser undklicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Das Ergebnis wird in Excel-Tabelle exportiert werden. </li></ol></li><li> Der prozentuale Anteil der adhärenten Zellen unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Anteil der anhaftenden Zellen = (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Vertiefungen Lesen) / (durchschnittliche Fluoreszenzintensität in der gewaschenen Zellen gelesen) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt verschiedene Tests, um Signale an LFA-1-Aktivierung und T-Zell-Adhäsion 12 studieren. Durchflusszytometrie wird verwendet, um LFA-1-Affinität Zustände in lebenden Zellen messen mit monoklonalen Antikörpern, die selektiv entweder gebogen oder verlängert LFA-1 zu binden. Eine der Einschränkungen dieser Methode ist, dass es nicht auf das Konto der Integrine &#39;Gier zu nehmen. Migration-Assays sind nützliche Werkzeuge, aber sie mickrige Haftung an einem bestimmten Zeitpunkt zu messen Migration, u...

T-Lymphozyten-Adhäsion ist ein fundamentaler Prozess der Immunantwort 1. Es ist für die T-Zell-Interaktion mit Endothelzellen, die Dekoration der Gefäßwände erforderlich ist, zum Abtasten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in die Lymphknoten und die für die Bildung von immunologischen Synapsen (IS) mit Zielzellen 2. Diese Anforderungen sind funktionell und kinetisch deutlich. Der Prozess der Lymphozyten-Extravasation besteht aus Chemoattraktion, Rollen, feste Adhäsion und Transmigration. Der Übergang von der rollenden Adhäsion festigen erfordert T-Zellen zu einer G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Signal schnell zu reagieren. Diese Antwort ergibt einen Integrin-Ligand-Wechselwirkung, die Verhaftungen und verlangsamt den Rollzelle 3. Eine sofortige Änderung in der Integrin-Avidität vermittelt diesen Prozess. Migration erfordert dynamischen Wechselwirkungen betweenTcells und Endothelzellen mit der Bildung von Verwachsungen an der &quot;Front-End&quot; und Bruch von Adhäsionen in der &quot;hinteren Ende&quot;mit einem Intervall von etwa einer Minute zwischen Form-und Bruch 4. Der IS bildet inminutes, muss aber für 6 Stunden intakt bleiben. Interessanterweise, ein Adhäsionsmolekül das Integrin Familienmitglied Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) - 1 ist, wichtig für all diese Prozesse 5. LFA-1 vermittelt Adhäsion durch Interaktionen mit mehreren Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie. Die am besten untersuchten Liganden mit der höchsten Affinität an LFA-1 ist das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1. Nicht-aktivierte zirkulierenden Lymphozyten exprimieren geringe Affinität LFA-1 auf der Zelloberfläche und sind daher nicht an ICAM-1-beschichteten Oberflächen anhaften. LFA-1-Affinität ist variabel und von mehreren Signalereignisse wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, Zytokin-Stimulation, und Signale, die von T-Zell-Rezeptoren (TCR) vermittelt geregelt. Die daraus resultierende hohe Affinität Form von LFA-1 fördert die intrazelluläre Aktivierung auf den extrazellulären Raum turch Wechselwirkung mit ICAM-1. Dieser Weg wird von innen nach außen bezeichnet Signal 7. Ebenso Signalgebung durch LFA-1 aus dem extrazellulären Raum außerhalb-der Signalisierung genannt. Die intrazelluläre Signalkaskaden in Inside-out-und Outside-In-Signalübertragung beteiligt sind ein Schwerpunkt der aktuellen Forschung. Die kleine GTPase Rap1 hat vor kurzem als die Schlüsselkomponente der inside-out signalisiert, dass es üblich, sowohl TCR-Ligation und Zytokin-Signal 8. Die kritische Rolle in Rap1 Integrin-Aktivierung wird von der Entdeckung, dass eine Überexpression von Rap1 stimuliert Integrin-abhängige Adhäsion von T-Zellen markiert, während T-Zell-Adhäsion wird durch Expression von dominant-negativen Rap1 9 blockiert. Diese Fortschritte in unserem Verständnis der Integrin-Regulation durch Rap1 wurden mit in vitro-Tools durchgeführt. Unter ihnen ist der hier beschriebene statische Adhäsionsassay. Das Ziel dieser Methode ist es, T studierenZellhaftfähigkeit an ICAM-1-beschichteten Oberflächen. Genauer gesagt, wird es verwendet, um objektiv zu messen und zu quantifizieren, LFA-1-Affinität zu seinem Gegenliganden in lebenden Zellen in Echtzeit, unter verschiedenen Bedingungen. Diese Technik verwendet Polystyrol Vertiefungen mit ICAM-1 beschichtet, um die Zelloberflächen, die die T-Zellen interagieren mit imitieren. Viele zuvor beschriebenen statischen T-Zell-Adhäsions-Assays wurden experimentell komplex. Diese Assays oft für T-Zellen erforderlich ist, um radioaktiv markiert werden kann, verwendet kultivierten Rinder-Hornhaut-Zellen eine extrazelluläre Matrix, als Substrat für die T-Zell-Adhäsion zu erzeugen, oder für nicht-physiologischen T-Zell-Stimulation über eine längere Dauer, um T-Zell-Adhäsion zu fördern 10 bezeichnet. Die Verwendung von fluorometrischen Messung an T-Zellen zu quantifizieren folgenden Haft Inkubation ist eine empfindliche und genaue Verfahren zur Quantifizierung verglichen mit Durchflusszytometrie und Mikroskopie fließen, wie sie in vielen Assaysystemen 11 verwendet. Zusätzlich einzelnen Zelle mikroskopischIC-Analyse von Integrin Lokalisation nicht für die breite Bevölkerung basierten Analyse in der gleichen Weise wie die fluorometrische Messung zu ermöglichen. Während Aktivierungszustand spezifische LFA-1-Antikörper sind kommerziell erhältlich, bieten diese Antikörper geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Methode, die hier skizziert. Der wesentliche Vorteil gegenüber alternativen Techniken ist die Einfachheit und die Fähigkeit, mehrere Versuchsbedingungen gleichzeitig zu untersuchen. Bei der Betrachtung dieser Verfahren für eine bestimmte Anwendung, sollte man berücksichtigen, dass T-Zellen sollten negativ gewählt werden, frisch isoliert und mit einem fluoreszierenden Marker markiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

T-Lymphozyten-Adhäsion wird für mehrere T-Zell-Funktionen, einschließlich der Migration zu Entzündungsstellen und die Bildung von immunologischen Synapsen mit Antigen präsentierenden Zellen erforderlich. T-Zellen zu erreichen geregelte Haftung durch Steuerung der Klebeeigenschaften von Integrinen, einer Klasse von Zelladhäsionsmolekülen aus heterodimeren Paare von Transmembranproteinen, die mit den Zielmolekülen wechselwirken auf Partnerzellen oder extrazelluläre Matrix. Der prominenteste T-Zell-Integrin Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen (LFA) -1, von Untereinheiten &amp;agr; L und β2, deren Ziel die intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM) -1 besteht. Die Fähigkeit eines T-Zell-Adhäsion zu steuern leitet sich aus der Möglichkeit, die Affinitätszustände einzelner Integrine regulieren. Inside-Out-Signalisierung beschreibt die Verfahren, bei dem Signale in einer Zelle bewirken, dass die externe Domänen der Integrine in einen aktivierten Zustand übernehmen. Vieles von unserem Wissen über diese komplexen Phänomene auf mechanistische BasisStudien in vitro vereinfachten Modellsystemen durchgeführt. Die hier beschriebene T-Lymphozyten-Adhäsion Assay ist ein hervorragendes Werkzeug, die T-Zellen zu halten, um Moleküle unter statischen Bedingungen zielen, ermöglicht, und nutzt eine Fluoreszenzplattenlesegerät zu Haft dann quantifizieren. Dieser Assay wurde bei der Definition Haft stimulierende oder hemmende Substanzen, die auf Lymphozyten wirken, sowie die Charakterisierung der Signalwege beteiligt nützlich. Obwohl hier für LFA-1 beschrieben - ICAM-1 vermittelte Adhäsion; Dieser Assay kann leicht angepasst werden, um für die Untersuchung von anderen adhäsiven Wechselwirkungen (zB VLA-4 - Fibronektin) zu ermöglichen.

Unten ist ein Beispiel der Adhäsion Assay unter Verwendung von primären T-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Anti-CD3-Antikörper stimuliert. Es ist nützlich, um die Fluoreszenz des ungewaschenen Zellen (dh die Gesamtbelastung) kennen. Unstimulierte Zellen dienen als negative Kontrolle und PMA-behandelten Zellen die positive Kontrolle für die Anti-CD3-Antikörper. Zellen in unbeschichteten Vertiefungen plattiert dienen als Kontrolle für ICAM-1. In einem typischen Versuch wurde der Anteil der adh?...

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

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15.9K Aufrufe.  New York University School of Medicine.  Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt. 

Serie: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...