LPE ist ein schottischer Senior Clinical Fellow und erkennt die Unterstützung des Chief Scientist Office (SCD/03). Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Project Grant LPE (089.930) finanziert. NarG wurde von einem Wellcome Trust Programm Grant (080.088) und einer Ausrüstung Grant (075.470) (für DeltaVision), und durch eine FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 bis 260.338-Allfun) finanziert. Wir würden gerne die University of Aberdeen Bildgebung Anlage, insbesondere Kevin MacKenzie, für hilfreiche Unterstützung und Beratung danken.

Ein. C. albicans Wachstum und AGB <ol><li> Planen SC Ura-Agarplatten, indem 6,9 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenin Hemisulfat-Salz und 20 g technisches Agar (zuvor ausführlich in 11 beschrieben). Make-up Volumen auf 900 ml mit destilliertem H 2 O. Autoklaven ermöglichen Agar abkühlen, aber nicht genug, sich zu verfestigen, und fügen Sie dann 50 ml sterile 40% D-Glucose und 50 ml sterile 4% SC-Ura Dropout unter aseptischen Bedingungen. Mischen, in Petrischalen gießen und verlassen Agarplatten zu kühlen und zu verfestigen. Laden Agarplatten bei 5 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Streak C. albicans Serotyp Stamm CAI4 + CIp10 aus Glycerinstammkulturen bei -80 ° C auf SC Ura-Agar-Platte. </li><li> Inkubieren Platte bei 30 ° C bis Kolonien bilden und speichern bei 5 ° C. </li><li> Kultur ein einziges C. albicans-Kolonie in 5 ml SC-URA-Medium (Rezeptur wie in 1.1, aber ohne technische Agar) und Inkubation über Nacht bei 30° C, 200 Upm bis zur stationären Phase C zu erzeugen albicans. </li></ol> 2. C. albicans Färbung mit Fluorescein Isothiocyanate (FITC) <ol><li> Fügen Sie 10 ul C. albicans Übernachtkultur zu 990 ul PBS (pH 7,4) und führen eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Zur Visualisierung von C. helfen albicans während Phagozytose-Assays, Fleck 1 × 10 8 C. albicans unter Verwendung von 1 mg / ml FITC in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Um ungebundenen FITC entfernen, waschen C. albicans in 1 ml 1 x PBS, Zentrifuge bei 3.000 × g für 5 min, entfernen Überstand und Pellet in 1 ml 1 x PBS. 3 Mal wiederholen. </li><li> Pellet bei 1 × 10 6 Zellen / ul in 1 x PBS. </li></ol> 3. Herstellung des J774.1 Maus-Makrophagen-Zelllinie <ol><li> Pflegen J774.1 Makrophagen in 75 cm 2 GewebeKulturflaschen in DMEM-Medium mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Die Herstellung der primären Makrophagen anderer Stelle im Detail 12, 13 beschrieben. </li><li> Kratzen J774.1 Zellen aus der Zellkulturflasche und übertragen auf eine 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min, um eine Zelle Pellet zu erhalten. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in 10 ml vorgewärmten ergänzt DMEM Medium. Zählen von Zellen mit einem Hämocytometer und Platte 1 × 10 6 J774.1 Makrophagen in 2 ml ergänzt DMEM-Medium in einer 35 mm Glas-basierten Imaging Gericht. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Vor der Bebilderung, ersetzen ergänzt DMEM-Medium mit 2 ml vorgewärmt ergänzt CO 2-unabhängiges Medium (mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) mit 1 uM LysoTracker Red DND-99.</li></ol> 4. Live Cell Video Microscopy Phagozytose Assay <ol><li> Die Wahl des Mikroskops wird auf das, was lokal verfügbar ist, sondern das Mikroskop Setup benötigen, um eine invertierte Bühne, ein Klimakammer erhitzt bis 37 zählen ° C und Anregung / Emission Filter für die ausgewählten Flecken (FITC und TRITC). </li><li> Einschalten des Mikroskops Heizeinrichtung vor dem Experiment und wenn genügend Zeit für die Umwelt Steuerkammer auf 37 ° C erwärmen Die Zeit für Kammertemperatur zu stabilisieren getroffen werden für verschiedene Mikroskop Setups variieren. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und laden Sie die Imaging-Software. Montieren Sie den Imaging-Schüssel auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus auf die J774.1 Makrophagen zu finden. Optimieren das Aussehen TRITC und DIC Bildern durch Einstellen des Prozentsatzes von übertragenem Licht und Belichtungszeiten. </li><li> Entfernen Sie die Imaging-Schüssel und fügen Sie 3 × 10 6 FITC gefärbten C. albicans bis ter austeilen. Notieren Sie sich die Zeit, dass C. albicans ist zu der Schale hinzugefügt. Bringen Sie den Teller auf die Bühne und optimieren das Erscheinungsbild der FITC Bilder, wenn nötig. Richten Sie eine Punkteliste, falls erforderlich. </li><li> Abbildungssystem beginnen, wenn alle Punkte in Fokus sind, und die Kanäle optimiert sind. Erfassen FITC, TRITC und DIC Bilder pro Minute für 6 Stunden. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren. NG ist ein Empfänger des uneingeschränkten Zuschüsse für die Grundlagenforschung von Gilead Sciences. LE arbeitet als Berater für GSK in der frühen Entwicklung von Medikamenten.

Hier wird das Verfahren für die Verwendung von lebenden Zellen zu Makrophagen Videomikroskopie Phagozytose zu untersuchen beschrieben. Video-Mikroskopie bietet mehrere zusätzliche Schichten von Informationen für die Analyse. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Aufnahme von Daten erzeugt werden (aus einem einzigen Experiment) für jeden Zeitpunkt während des Beobachtungszeitraums von 6 Stunden werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht das beschriebene Verfahren differentiellen Analyse der einzelnen Phasen der Phagozytose. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass Veränderungen in der gesamten Aufnahme von C. albicans Glykosylierung und Morphogenese Mutanten durch Makrophagen Zelllinien und primäre Makrophagen kann entweder eine Folge von Änderungen der Makrophagen-Migrations-Richtung Zielzellen oder Rate von einmal engulfment Zell-Zell-Kontakt hergestellt 7 sein. Es gibt eine Anzahl von Fallen zu vermeiden, wenn die Durchführung dieser Versuche. Erstens ist es sehr wichtig, um stabile Umgebungsbedingungen über den Versuchszeitraum Verfah sicherzustellenDure. Dies wird am besten in einer Klimakammer, die den experimentellen Bedingungen mehrere Stunden vor Beginn des Experiments eingestellt ist erreicht. Video Qualität ist stark abhängig von anspruchsvollen Module, Infrarot-Laser verwenden, um automatisch die Probe z-Position, unabhängig von mechanischen oder thermischen Veränderungen wodurch die Notwendigkeit für manuelle Fokussierung Korrekturen. Angesichts der verlängerte Natur der Experimente ist es wichtig, Laserlicht ausgesetzt und die damit verbundenen Photobleichen und Photokonversion Effekte, die durch den Einsatz stark fluoreszierende Marker, die geringer Belichtungszeiten erleichtern minimiert werden kann, einschränken. Die FITC Färbung hier beschriebene Protokoll ist schnell und zuverlässig. Als FITC ist ein sehr helles und stabile Fleck, niedrige Belichtungszeiten erforderlich sind und dies macht FITC ideal für ausgedehnte Zeitraffer-Filme. Allerdings verwenden wir routinemäßig eine Vielzahl von verschiedenen Ziel-Flecken, einschließlich Calcofluor Weiß und PKH Farbstoffe sowie getaggt Organismen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die meisten unserer veröffentlichten Arbeit wird unter Verwendung eines Weitwinkel-Mikroskop, sondern Exposition kann durch die Verwendung eines Spinning Disc konfokalen Mikroskop und in unseren Händen das ist wesentlich für Zeitraffer-3D-Video-Mikroskopie minimiert werden. Während dieser Studie wurden Bilder von 1 min Intervallen über einen 6 h Phagozytose Assay erfasst. Das Intervall zwischen den Bildern kann angepasst je nach Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel kann der Abstand verringert, wenn die Untersuchung schnelle Prozesse, wie Vesikeltransport werden. Das minimale Zeitintervall wird von Mikroskop und Kamera Spezifikationen. Es gibt einige Überlegungen zu bedenken, beim Einstellen Timings. Zunächst wird die Verringerung der Abstand zwischen Snapshots bedeutet weniger Punkte abgebildet werden können und die Dateigröße erheblich erhöht werden. Im Gegenteil, wird die Erhöhung der Bild-Intervall zu viel machen den Film zu verlieren Kontinuität. Dieser Ansatz kann angewendet werdenim Prinzip zu studieren anderen Krankheitserregern und die Aufnahme von sterbenden Wirtszellen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem gezeigt, dass Knochenmark-Makrophagen aus Sialoadhesin-defizienten Mäusen erheblich weisen verminderte Bindung und Phagozytose von sialylierten Campylobacter jejuni 8. Jedoch ist Zielgröße eine wichtige Determinante für Durchführbarkeit als Bildanalyse wird zunehmend schwieriger mit einer Reduzierung der Zielzelle skalieren. Anspruchsvolle Bildanalysesoftware notwendig für schnelle Videomikroskopie Analyse, und dies sollte mit entsprechenden Bioinformatik Träger gekoppelt werden, um die Erzeugung von Algorithmen, um die Migration der einzelnen Zellen und ganzen Zellpopulationen 7 studieren erleichtern. Live-cell Videomikroskopie in Kombination mit anspruchsvollen Bildanalyse-Software für die von Minute zu Minute Analyse von Migration und individuellen Makrophagen-C.albicans Interaktionen, bietet einen einzigartigen Einblick in die Komplexität von C. albicans Phagozytose durch macrophages. Es gibt ein enormes Potenzial, um diese Methoden zu erweitern, um andere Krankheitserreger und Fresszellen (dendritische Zellen, Neutrophile) zu studieren und 3D-Video-Mikroskopie Bild Zell-Zell-Interaktionen näher oder mehr physiologischen Oberflächen wie Epithel-und Endothelzellen Schichten zu entwickeln. Diese Technik ist Teil der nächsten Generation von Werkzeugen in der Studie der Wirt-Pathogen-Interaktionen und wird dazu beitragen detaillierte räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Adenin Hemisulfat Salz </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar technischen (Nr. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura Dropout </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Natriumcarbonat </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Lonza </td><td> BE17-605e </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm Glas-Gerichte </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Phagozytische Abstand von pilzlichen Pathogenen und Mikroorganismen allgemein kann als aus vier verschiedenen Phasen bestehen: (i) die Migration von Phagozyten an den Ort, wo Krankheitserreger befinden, (ii) die Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) durch Muster Erkennungsrezeptoren (PRRs), (iii) engulfment von Mikroorganismen gebunden an den Phagozyten Zellmembran, und (iv) Verarbeitung des Reifung verschlungen Zellen innerhalb Phagosomen und Verdauung der eingenommenen Teilchens. Studien, die Phagozytose Beurteilung in seiner Gesamtheit sind informativ 1, 2, 3, 4, 5, aber begrenzt sind, dass sie in der Regel nicht zu brechen den Vorgang ab in die Migration, engulfment und Phagosomenreifung, die unterschiedlich betroffen sein. Weiterhin Messung solcher Studien Aufnahme als ein einziges Ereignis, und nicht als ein kontinuierlicher dynamischer Prozess. Wir haben vor kurzem erweiterten Live-Cell-Imaging-Technologien entwickelt und kombiniert haben diese mit genetischen funktionelle Analyse von sowohlErreger und Wirtszellen, um eine übergreifende Plattform für die Analyse des angeborenen Immunsystems Zellfunktion und Pathogenität von Pilzen. Diese Studien haben neue Aspekte der Phagozytose, die nur beobachtet, wenn systematische zeitliche Analyse der molekularen und zellulären Interaktionen zwischen menschlichen Phagozyten und pilzlichen Krankheitserregern und infektiösen Mikroorganismen allgemein werden konnte aufgedeckt. Zum Beispiel haben wir begonnen, folgendes zu definieren: (a) die Komponenten der Zelloberfläche für jede Stufe des Prozesses der Erkennung, engulfment und Tötung von Pilzzellen 1, 6, 7, 8 erforderlich, (b), wie Oberflächengeometrie Einfluss auf die Effizienz der Makrophagen Aufnahme und Tötung von Hefe und Hyphen Zellen 7 und (c) wie engulfment führt zu Veränderungen des Zellzyklus und das Verhalten der Makrophagen 9, 10. Im Gegensatz zum einzigen Zeitpunkt Momentaufnahmen, ermöglicht die Live-Video-Mikroskopie Zelle eine Vielzahl von Wirtszellen und Pathogenen als Co untersuchendenntinuous Sequenzen über längere Zeiträume, eine räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen, einschließlich der Zellmigration, Replikation und Vesikeltransport. Hier beschreiben wir detailliert, wie Host-und Pilzzellen vorzubereiten, und die Video-Mikroskopie Experimente durchzuführen. Diese Methoden können eine Benutzer-Leitfaden für künftige Studien mit anderen Phagozyten und Mikroorganismen.

Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse für C. albicans Aufnahme durch einen murinen Makrophagen-Zelllinie J774.1 während einer 6 Stunden lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment. Abbildung 1 ist eine repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Film und zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Live-cell Videomikroskopie können Internalisierung von C. albicans zu sein, ohne die Notwendigkeit, externe Candida Färbung visualisiert. jedoch während dieser Experimente, C. albicans wurde angefärbt unter Verwendung des pH-empfindlichen Farbstoff FITC (grün), die während des Ansäuerns des Makrophagen Phagosom abgeschreckt wird, und erleichtert eine Bestätigung, dass Candida internalisiert wurde (Abbildung 1). Zur weiteren Unterstützung Visualisierung der aufgenommenen C. albicans, Makrophagen wurden angefärbt unter Verwendung des roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99, welche Flecken sauren Abteile und dient als ein nicht-spezifischer Marker für Phagosomenreifung.2 ist ein Standbild von einer Live-Video-Mikroskopie Zelle Experiment und veranschaulicht die Veränderung in der Anzahl von C. albicans eingenommen durch einzelne J774.1 Makrophagen. In diesem Experiment wurden 82% der verschlungen J774.1 Makrophagen mindestens eine C albicans-Zelle am Ende der 6 h Phagozytose Assay. In Abbildung 3 ist die Zahl der verinnerlichten C. albicans Zellen pro Makrophagen gemeldet. Die mittlere Anzahl der C. albicans pro up Makrophagen aufgenommen ist 3,4, aber interessanterweise Makrophagen kann Ingest bis 16 Pilzzellen. Abbildung 4 ist eine Folge von Standbildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen phagozytierenden C. albicans-Zellen, Hyphe Wachstum mit der Makrophagen und letztlich Makrophagen Lyse. Abbildung 4 zeigt, dass Videomikroskopie ermöglicht die Analyse von Ereignissen nach engulfment von Zielzellen, dh Daten des ki erzeugt werdenlling von Makrophagen durch C. albicans Hyphen in Bezug auf die Anzahl der aufgenommenen und Morphogenese Zielzellen und wie Makrophagen Tötung betrifft Phagosomenreifung die in Echtzeit untersucht werden kann. Abbildung 1. Live-cell Videomikroskopie Film zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Makrophagen und C. albicans wurden für einen Zeitraum von 6 h ​​bei 37 ° C co-kultiviert in vollständiger CO 2-unabhängiges Medium. Die Bilder wurden bei 1 min Intervalle für 6 Stunden gefangen. Makrophagen ersichtlich Einrichtung Zell-Zell-Kontakt mit C werden albicans, die dann durch Aufnahme von C folgt albicans in Makrophagen Phagosomen. Pfeile zeigen auf C. albicans vor durch J774.1 Makrophagen Phagozytose. Dieses Video zeigt auch, dass FITC Fluoreszenz QuEnched folgenden engulfment von C. albicans. Maßstab, 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Standbild zeigt Variierung in der Anzahl von C.albicans durch einzelne Makrophagen verschlungen. Makrophagen (gebeizt mit LysoTracker roten DND-99) wurden mit FITC-gefärbte C. co-kultiviert albicans (grün). Es gibt Schwankungen in der Anzahl von C. albicans verschlungen (eine Zahl neben einem Pfeil zeigt die Anzahl von C. albicans verschlungen) und in C. albicans Morphologie (dh Hefe Verse Hyphen). Maßstab, 20 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Abbildung 3. Graph zeigt die Anzahl der C. albicans pro Einnahme J774.1 murinen Makrophagen am Ende der 6 h Phagozytose Assays. Die Daten repräsentieren 2 unabhängigen Experimenten. Insgesamt 100 Makrophagen wurden aus 3 Felder aus jedem Experiment gezählt, was eine Gesamtzahl von 600 einzelnen Makrophagen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Abbildung 4. Eine Reihe von Bildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen (M) und C. albicans (C) vor und während der Erkennung (A, B), und während und nach der Aufnahme (C, D). C. albicans Hyphen weiterhin im Makrophagen-(E, F), die in Makrophagen Lyse (G) führen können wachsen. Andere Makrophagen gezielt zum Ort des Bruches und versuchen, den Freigabe C. Ingest rekrutiert albicans (H). Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Beachten Sie, dass FITC Färbung nach C abgeschreckt albicans Aufnahme durch Makrophagen J774.1 (C). Maßstab, 10 mm.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Wir beschreiben Methoden für Live-Cell-Video-Mikroskopie<em&gt; Candida albicans</em&gt; Phagocytose durch Makrophagen. Diese Methoden ermöglichen stage-spezifische Analyse der Makrophagen-Migrations-, Anerkennung, engulfment und Phagosomenreifung und zeigen neue Aspekte der Phagozytose.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K Aufrufe.  University of Aberdeen. Wir beschreiben Methoden für Live-Cell-Video-Mikroskopie Candida albicans Phagocytose durch Makrophagen. Diese Methoden ermöglichen stage-spezifische Analyse der Makrophagen-Migrations-, Anerkennung, engulfment und Phagosomenreifung und zeigen neue Aspekte der Phagozytose.

Serie: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Live Cell Imaging von Alphaherpes Virus Anterograde Transport und Aufstrich

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Biolistischen Transformation einer Leuchtstoff Tagged-Gens in den Opportunistic Pilzpathogenentwicklung<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie