Das hier beschriebene Protokoll misst die Efferozytose der Lunge nach Exposition gegenüber einem Kriterium Luftschadstoffozon. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Ozonexposition die Alveolarmakrophagen-Efferozytose verringert und somit ein Mechanismus dafür sein könnte, warum erhöhte Ozonwerte die Inzidenz von Lungenerkrankungen erhöhen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine in vivo Bewertung der alveolar Makrophagen-Efferozytose ohne Ex-vivo-Manipulationen der Makrophagen ermöglicht, die ihren Phänotyp oder ihre Funktion verändern können.
Diese Technik hat einen neuartigen Mechanismus aufgedeckt, mit dem sich die Lunge nach der Exposition durch Luftverschmutzung nicht selbst reparieren kann. Darüber hinaus kann diese Technik neue Wege zu Zielen offenbaren, die die Efferozytose in der Lunge verändern. Diese Methode kann auf jedes Modell von Lungenverletzungen oder Entzündungen angewendet werden.
Allerdings muss der Benutzer optimieren, wenn es am besten ist, die Efferozytose nach einer Lungenverletzung zu bewerten. Die Durchführung der oropharyngealen Aspiration kann technisch eine Herausforderung sein. Ich würde empfehlen, mit Ihrem Veterinärpersonal zusammenzuarbeiten, um sicherzustellen, dass Sie Ihre Technik optimiert haben, um dieses Verfahren durchzuführen.
Beginnen Sie mit der Kultivierung von Jurkat-T-Zellen in Basalzellkulturmedium, ergänzt nach den Manuskriptrichtungen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Jurkat-T-Zellen sind eine Suspensionszelllinie, die durch Durchlaufen in vorgewärmte Kultivierungsmedien alle drei Tage aufrechterhalten werden kann. Bereiten Sie apoptotische Zellen vor, indem Sie sie auf 90% Konfluenz anbauen, was drei bis vier Tage nach dem Passieren dauert.
Wachsen Sie Zellen in fünf T75-Kolben, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für dieses Protokoll zu erhalten. Sobald die Zellen fertig sind, aspirieren Sie den Kolbeninhalt ca. 24 Milliliter und übertragen Sie sie in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Zählen Sie die Zellen mit Trypan Blue Färbung und einem Hämozytometer.
Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 271 mal g für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Dann setzen Sie die Zellen in den Medien wieder aus, um drei Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Aliquot die Zellen in 100 mal 20 Millimeter Gewebekultur-Gerichte durch die Übertragung von fünf Milliliter Zellen pro Schale.
Bereiten Sie etwa neun Kulturgerichte zu. Legen Sie eine Schale als unbelichtete Kontrolle beiseite und setzen Sie die restlichen Schalen UV aus. Stellen Sie den UV-Verkreuzer auf das richtige Energieniveau, indem Sie die Energietaste drücken und 600 mit dem Nummernblock eingeben. Bestrahlen Sie alle Gerichte mit den Zellen mit Ausnahme der Kontrolle, um sicherzustellen, dass die obere Abdeckung der Gewebekulturschale während der UV-Exposition zu entfernen.
Dann alle Gerichte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier Stunden inkubieren. Nach der Inkubation alle bestrahlten Zellen zu einem 50 Milliliter konischen Rohr kombinieren und durch Zentrifugieren bei 271 mal g fünf Minuten pellet. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 24 Millilitersterilen PBS wieder aus.
Zentrifugieren Sie das Rohr erneut und entfernen Sie den Überstand. Bereiten Sie die Zellen für die Mäusezujespere vor, indem Sie sie in PBS in der entsprechenden Konzentration wieder aussetzen. Sobald die Maus richtig anästhesiert ist, legen Sie sie in eine halbliegende Rückenlage.
Verwenden Sie chirurgische Schnur zwischen Stiften auf einer schrägen Acryl-Blatt-Platte gebunden, um die Maus durch die Kieferschneidezähne zu suspendieren. Verwenden Sie ein Paar stumpfe, nicht gerittene Zangen, um die Mauszunge leicht zu greifen und zu ziehen und die apoptotischen Zellen mit einer P200-Pipette in die Mundhöhle einzuflößen. Dosierung ist erfolgreich, wenn Mäuse ein bis zwei Sekunden nach Erhalt der Dosis ein Knistern machen.
Mit einem Gehandicaptfinger die Nase der Maus vorsichtig bedecken, bis sie einatmet, während die Zunge eingefahren wird. Halten Sie die Nase bedeckt, bis keine Flüssigkeit in der Mundhöhle sichtbar ist und die Maus zwei oder mehr Inhalationen genommen hat. Entfernen Sie die Maus von der Impftafel und geben Sie sie in den Käfig zurück, damit sie sich von der Anästhesie erholen kann, um sicherzustellen, dass die Maus auf den Rücken gelegt wird, um zu verhindern, dass Trümmer die Nares blockieren.
Nachdem alle Mäuse aus der Anästhesie erwacht sind, warten Sie 90 Minuten, um alveolare Makrophagen den Zustrom von apoptotischen Zellen zu verschlingen. Um Lavaflüssigkeit zu sammeln, bereiten Sie die eingeschläferte Maus entsprechend den Manuskriptanweisungen vor. Drücken Sie PBS langsam in die Lunge, damit sie sich aufblasen können, und ziehen Sie dann das gleiche Volumen wieder heraus, um sicherzustellen, dass die PBS die Nasenlöcher nicht verlässt.
Sammeln Sie die gepoolte Spülung von jeder Maus in einem 15 Milliliter Rohr. Zentrifugieren Sie die Bronchoalveolar-Lavage oder BAL bei 610 mal g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius, sammeln Sie den Überstand in ein 1,5 Milliliter-Rohr und frieren Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius ein. Das Pellet stellt die Zellen aus dem bronchoalveolarraum.
Fügen Sie dem Pellet einen Milliliter ACK-Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu entfernen. Wirbel und Lyse für eine Minute auf Eis, dann fügen Sie vier Milliliter PBS, um die Lyse-Reaktion zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 610 mal g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger.
Setzen Sie dann die Zellen in einem Milliliter PBS mit 10% FBS wieder aus und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer ohne Trypan Blue. Zentrifugieren Sie 120 Mikroliter jeder Probe auf Dias bei 12-fachm g für drei Minuten mit mittlerer Beschleunigung und einer Zytozentrifuge. Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen.
Am nächsten Tag färben Sie die Dias mit Hämatoxylin und Eosin, um sowohl efferozytische als auch differenzielle Zellzahlen zu berechnen. Sehen Sie dann Dias unter einer Brightfield-Einstellung auf einem biologischen Mikroskop mit einem 20X- oder 40X-Objektiv. Berechnen Sie den efferozytischen Index basierend auf dem Verhältnis von alveolar-Makrophagen, die phagozytotische Jurkat-T-Zellen zu alveolar-Makrophagen ohne apoptotische Zellaufnahme haben, um sicherzustellen, dass mindestens 200 Zellen aus jeder Folie gezählt werden.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Ozonexposition auf Lungenentzündungen zu untersuchen. Ozonexponierte Mäuse zeigten eine Zunahme von Makrophagen und Neutrophilen im Luftraum im Vergleich zur gefilterten Luftkontrollgruppe und hatten eine Zunahme des BAL-Proteins, einem Marker der alveolären epithelialen Dysfunktion. Vor der Mäusen-Dosierung wurde die Apoptose in Jurkat-T-Zellen mit Durchflusszytometrie bestätigt.
Die UV-Exposition s. 60 Milli Joule und die inkubationszeit von vier Stunden führten zu sich wiederholenden Ergebnissen von etwa 75% apoptotischen Zellen. Efferozytische Makrophagen wurden als Makrophagen identifiziert, die eine Jurkat-T-Zelle im Vergleich zu regulären Alveolar-Makrophagen verschlungen hatten. Es gab eine signifikante Abnahme des efferozytischen Index der ozonexponierten Gruppe im Vergleich zu den gefilterten Luftkontrollen, was darauf hindeutet, dass ozoninduzierte Lungenentzündungen mit einer verringerten Clearance von apoptotischen Zellen verbunden sind.
Die Liebe zum Detail und das Aufschreiben der beobachteten Unterschiede ist bei diesem Verfahren von entscheidender Bedeutung. Es wird auch empfohlen, die Proben für die Analyse zu blenden und zwei verschiedene Personen die Makrophagen zählen lassen. Nach der Isolierung können die BAL-Zellen für die mRNA-Analyse verwendet werden, für zusätzliche Marker durch Immunfluoreszenz gebeizt werden und/oder auf einem Durchflusszytometer laufen, um phänotypische Veränderungen zu unterscheiden.
