Die Autoren möchten sich an die US Army Medical Research und Materiel Command (Grant Numbers W81XWH-09-1 bis 0386 und W81XWH-10-1-0806) für die finanzielle Unterstützung und danken Dr. Shawn Rigby von der Iowa State University Durchflusszytometrie Facility for seine kompetente technische Unterstützung.

1. Ernte Alveolarmakrophagen (AMɸ) aus der Maus über Lungenlavage <ol><li> Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), wie einen Laborkittel, Einweg-Handschuhe und entsprechende Schutzkleidung. </li><li> Bereiten Sie komplette AMɸ (cAMɸ) Medium vor Beginn der Ernte. In 2,5 ml Penicillin / Streptomycin (Penicillin / Streptomycin)-Lösung, 250 ul β-Mercaptoethanol (2-Mercaptoethanol), und 25 ml Hitze-inaktiviertem fetalen Rinderserum (FBS) bis 222,25 ml Dulbelcco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Filter-sterilisiert cAMɸ Medium unter Verwendung eines 0,2 &amp;mgr; m Porengröße Bottle Top-Filter unter Vakuum. </li><li> Euthanize eine gesunde Maus durch CO 2-Erstickung in einer Nottötung Kammer. Obwohl ein C57BL / 6 Mäuse (6-8 Wochen alt) für die Zwecke des Projekts verwendet wurde, kann diese Lungenspülung Technik, auf jedem Mausstamm durchgeführt werden. Verwendung einer Druckgasflasche, können Gasstrom in die Kammer für 1 min vor dem Platzieren der Maus in der chBernstein, um sicherzustellen, dass die Kammer voll ist mit CO 2 belastet. Platzieren Sie die Maus in der Kammer für mindestens eine Minute, um die Maus einschläfern. Darüber hinaus exsanguinate jede Maus über Herzpunktion als physikalisches Verfahren zur Maus Tod bestätigen, wie unter 1.4 beschrieben. </li><li> Lay Maus auf dem Rücken (dorsal), Spray mit 70% Ethanol, suchen Sie das Brustbein und bei einem Winkel von 30 Grad aus dem Bauch, legen Sie eine 23-Gauge-Nadel (verbunden mit einer 1 ml-Spritze) ca. 50 mm in die Brusthöhle . Bei richtiger Platzierung der Nadel, sollte es möglich sein, zwischen 0,4 und 1 ml Blut in Abhängigkeit von der Größe der Maus erhalten. Untersuchen Sie das Tier für die Einstellung der Vitalfunktionen. </li><li> Bewegen Sie die Maus auf dem Labortisch, so dass sie sich auf den Bauch (Bauchseite) liegen. Spray-Maus mit 70% Ethanol, um die Arbeitsumgebung zu sterilisieren. Pinch Haut etwa auf halbem Weg über den Rücken der Maus. Mit Schere Dissektion, die mit 70% Ethanol sterilisiert wurden, machen einen kleinen Schnitt durch die Haut. &lt;/ Li&gt; <li> Besorgen Sie sich die Haut auf beiden Seiten des Schnittes und ziehen Sie die Haut in entgegengesetzte Richtungen entlang der Schädelbasis-caudale Achse der Maus. Wenn es richtig gemacht, wird die Haut von der darunter liegenden Kadaver entfernt werden. </li><li> Der Hals der Maus sollte jetzt ausgesetzt Muskeln und Drüsen. Schneiden Sie vorsichtig, dass Gewebe und ziehen Sie sie in Richtung der vorderen der Maus mit einer Pinzette, wodurch der Kehlkopf, Luftröhre, Speiseröhre und der Maus. Vermeiden Sie das Schneiden der Halsschlagader oder Halsschlagader. </li><li> Die Luftröhre ist nun sichtbar und erkennbar ist, wenn das Gewebe mit Knorpelringe um ihn herum. Fein halten die Luftröhre mit einer Pinzette und leicht anzuheben und zu trennen die Luftröhre von der Speiseröhre, die auf der dorsalen Seite befindet. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt anterior, wo man hält die Luftröhre, sondern hinter dem Kehlkopf. Der Schnitt sollte bei ca. 45 °-Grad-Winkel erfolgen. Auch nicht ganz durchschneiden die Luftröhre, wie diese wird es ab Einfahren verhindern indie Körperhöhle. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einem Kater Katheter mit sterilem PBS in Vorbereitung, um den Katheter in das Lumen der Luftröhre legen ausgerüstet. Halten Sie die Luftröhre mit einer Pinzette und mit der Hand zu halten, den Katheter in der Nähe der Spitze, um die Kontrolle zu erhöhen und schieben Sie sie vorsichtig in die Luftröhre Inzisionsstelle. Setzen Sie vorsichtig Katheter in Luftröhre etwa 20 mm. Fassen Sie die Luftröhre, die sich um den Katheterschlauch ist, die Befreiung der anderen Seite. </li><li> Mit einer 1 ml Spritze mit dem Katheter angebracht, vorsichtig ziehen 0,75 ml Raumtemperatur, sterilem PBS in die Lunge und dann sanft saugen Sie den PBS zurück in die Spritze aufziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, während extern Massieren der Brust. Trennen Sie die Spritze aus dem Katheter und Abgeben der Spülflüssigkeit in eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Nach dem Befüllen der Spritze mit 0,75 ml frisches PBS und wieder die Spritze an den Katheter, wiederholen Sie die Schritte 1.9 und 1.10 zweimal für jede Maus. Fluidrückgewinnungssystem aber auch nur teilweise erhalten, weniger als die volume infundiert. Wenn das Sammeln Zellen, die aus mehr als einer Maus, legen Sie die 15-ml-Tube mit den geernteten Zellen auf Eis, bis alle Lungen-Lavage durchgeführt wurden. </li></ol> 2. Die Verarbeitung von Lungenlavage AMɸ Ernte <ol><li> Zentrifuge Lungenwasch-Flüssigkeit bei 250 xg für 10 min bei 4 ° C </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken dekantieren in geeignete Abfallbehälter innerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank. Das Zellpellet durch leichtes harken das Zentrifugenröhrchen über den oberen Teil ein Reagenzglas Rack. 1 mL cAMɸ Medium, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe eines Coulter Particle Counter Z1 durch Pipettieren 20 uL von Zellen in 10 ml Isoton II Diluent im Coulter Counter Fläschchen. In 3 bis 4 Tropfen des Zap-oglobin II Lysereagenz in Fläschchen vorsichtig umdrehen 3 bis 4 mal und legen Sie das Probenfläschchen auf den Tresen, um eine Zelle Konzentration zu erhalten. Achten Sie darauf, um den Zähler mit einem Verdünnungsfaktor von 2 x 10 4 zu programmieren, um die AnzeigeZellkonzentration wie die Anzahl der Zellen pro ml. </li><li> Verdünnte-Zellen zu 2,5 × 10 5 pro ml mit cAMɸ Medium. </li><li> Dosiernadel 2 ml von 2,5 × 10 5 Zellen / ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatten. </li><li> Um für AMɸ, inkubieren Kulturschalen in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre für 6 h bereichern zu lassen Zellen auf den Grund des gut haften. Den Überstand vorsichtig absaugen, um nicht zu stören anhaftenden Zellen. </li><li> Spülen Sie die Wells mit sterilem PBS (Calcium und Magnesium kostenlos), um nicht-adhärente Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Geben Sie 2 ml cAMɸ Medium in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren Zellen über Nacht in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre vor der Zugabe von Stimulanzien. Nach diesem Schritt Bereicherung, sind ca. 87% der Zellen positiv für den Makrophagen-Marker CD11b und F4/80 (Abbildung 2c). </li></ol> 3. Die Zugabe von Polyanhydride Nanopartikel und Kontrollbehandlungen <ol><li> Fabrizieren Nanopartikeln über Polyanhydrid Antilösungsmittel Nanoverkapselung 15. Bei diesem Verfahren wird das Polymer in Methylenchlorid gelöst (4 ° C bei einer Konzentration von 25 mg / ml) extrahiert und in Pentan (-20 ° C bei einem Verhältnis von 1:200 Methylenchlorid: Pentan). </li><li> Abwiegen Polyanhydrid Nanopartikel mit Hilfe von sterilisierten wiegen Papier auf einer Waage, die genau messen kann Mikrogramm-Mengen. In Teilchen zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Resuspendieren Sie die Nanopartikel in eiskaltem cAMɸ. Berechnungen werden, so dass nicht mehr als 0,3 ml Medium zu jeder Vertiefung zugegeben, um die gewünschte Konzentration von Nanopartikeln zu erhalten. Halten Sie die resuspendierten Partikel auf Eis, bis die Nanopartikel zur Kultur hinzugefügt gut. </li><li> Vor der Zugabe der Nanopartikel an die AMɸ Kulturen, beschallen Teilchen mit Hilfe eines Ultraschallgeräts Tischgerät mit einer Mikrospitze. Sterilisieren Mikrospitzen durch Besprühen mit 70% Ethanol und wiping mit einer sterilen Kimwipe vor der Beschallung. Beschallen bei 10-20 Joule für 30 bis 45 s, während die Röhrchen auf Eis. Beachten Sie Nanopartikel-Suspension makroskopisch. Wenn Teilchen nicht ausreichend dispergiert werden, damit die Suspension auf Eis für 1 bis 2 min eingestellt, um sicherzustellen, dass die Nanopartikel unterhalb der Glasübergangstemperatur des Polymers vor Beschallen wieder für 30 bis 45 Sekunden. Der Zweck dieses Beschallungsschritt ist ausreichend zu dispergieren die Nanopartikel als 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel neigen dazu, zusammen, wenn sie einer wässrigen Umgebung ausgesetzt. Jedoch können einige kleine Aggregate von Nanopartikeln noch in der Suspension verbleiben. </li><li> Nanopartikel-Suspension (ausreichend dispergiert) sollten auf Eis gehalten werden und sofort verwendet werden, um ein vorzeitiges Oberflächenerosion oder Aggregation zu verhindern. </li><li> Entfernen Sie die Kulturschalen mit dem AMɸ von Inkubator und Platz in der Biosicherheitswerkbank. Tilt Platte ungefähr in einem Winkel von 45 Grad und Pipette aus der Menge der medium aus, der der Nanopartikel-Suspension (es sollte nicht mehr als 0,3 ml) zugesetzt werden. Bitte nicht stören die adhärenten Zellen beim Entfernen des Mediums. </li><li> Vortex Polyanhydrid der Nanopartikel-Suspension kurz vor der Zugabe zu den entsprechenden Vertiefungen. Pipettieren die Menge an Nanopartikel-Suspension (nicht mehr als 0,3 ml) in die auch spezifische (n) jedoch nicht und Abpipettieren zu mischen. Diese Aktion könnte die Anhänger AMɸ lösen aus dem Brunnen. Die Partikel werden an der Unterseite des gut einleben und an die Zellen. Für die Studien in diesem Bericht beschriebenen, war die endgültige Konzentration von Nanopartikeln mit dem AMɸ kokultiviert 125 ug / ml. Fahren Sie mit dem nachfolgenden Brunnen und gewünschte Behandlungsgruppen. Positive und negative Kontrollgruppe, wie nur Medium und 200 ng / ml Lipopolysaccharid (LPS) an bestimmte Vertiefungen. </li><li> Senden Sie die Kulturschalen auf die 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2-Atmosphäre für 48 Stunden. Kinetische Untersuchungen in unserem laboratory 48 Stunden haben gezeigt, dass die optimale Kultur Zeitraums für die Bewertung sowohl Zell-Oberflächen-Marker-Expression und Zytokin-Sekretion, da es ausreichend Zeit erlaubt für die Transkription und Proteinsynthese stattfindet sein. Obwohl ein höheres Maß an Zytokinen während eines längeren Zeitraums Kultur (dh 72 Stunden) anfallen, kann die Bewertung Zelloberflächenmarker Ausdruck zu diesem Zeitpunkt durch den Beitrag der erhöhte Spiegel von Zytokinen verwechselt werden. Die Veränderungen der Oberfläche Marker-Expression beobachtet möglicherweise nicht direkt zurechenbaren Stimulation mit den Nanopartikeln selbst. </li></ol> 4. Auswerten AMɸ Aktivierung mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Planen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Puffer (0,1% Natriumazid und 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in 0,1 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) vor dem Ernten der plattierten Makrophagen, die mit Nanopartikeln haben o co-kultiviertr Stimulanzien. </li><li> Planen Arbeitslösungen der Blocking-Puffer und den monoklonalen Antikörpern. Um die Blockpuffer herzustellen, zu verdünnen Ratten-IgG (Sigma) und anti-CD16/32 (eBioscience) auf 1 mg / ml und 10 mg / ml, jeweils in FACS-Puffer. Verdünnen Oberfläche Marker-Antikörper-Panel in FACS-Puffer entweder vom Hersteller empfohlenen Konzentration oder dem Benutzer optimierte Konzentration. Für die Ergebnisse in dieser Arbeit vorgestellten besteht die Oberfläche Marker-Panel von Antikörpern gegen MHC II, CD86, CD40 und CIRE (CD209). Anti-Maus-Antikörper gegen den Makrophagen-Marker F4/80 und CD11b sind auch in der Platte enthalten, um positiv zu identifizieren, der die Makrophagen-Phänotyp bei der Datenanalyse. Ist darauf zu achten bei der Auswahl der Antikörper gegen MHC II-Moleküle, wie Inzucht-Mausstämmen oft in ihren MHC-II-Haplotypen unterscheiden. Die Antikörper ausgewählt werden, müssen mit den spezifischen MHC Alloantigene von der Maus Stamm von Interesse bekundet reagieren. </li><li> Nach 48 h Inkubation mit Nanopartikeln und / oderStimulanzien, Ort Zellkulturschalen auf Eis für 20 min. Um die adhärenten Makrophagen von den Platten entfernen, vorsichtig abkratzen Brunnen mit einem 24 cm Zellschaber. </li><li> Mit einem 5 ml serologische Pipette vorsichtig aspirieren Zellen und Medium nach oben und unten fünf Mal, um eine einzelne Zellsuspension zu generieren. Pipettieren Sie die Inhalte der einzelnen Vertiefungen in separate 5 ml Polystyrol-Röhrchen, um nicht zu vermischen und Zellen aus verschiedenen experimentellen Behandlungen. </li><li> 2 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen. </li><li> Zentrifugenröhrchen von Zellen bei 250 × g bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand dekantieren und vorsichtig resuspendieren Zellpellet in Restflüssigkeit durch Rechen die Rohre im oberen Bereich ein Reagenzglas Rack. </li><li> Um unspezifische Bindung der monoklonalen Antikörper zu verhindern, fügen 10 l Blocking-Puffer (hergestellt in 4,2) in jedes Röhrchen von Zellen. Wirbelröhren und inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> Fügen Sie entsprechende Volumen der verdünnten monoklonalen Antikörper in jedes Röhrchen und incubaß im Dunkeln auf Eis für 15 min. Rohre, die Proben enthalten, analysiert werden sollen erhalten die Kombination von Antikörpern der polycromatic Platte (früheren Optimierung der Kombination von Antikörpern sollten von den einzelnen Labors durchgeführt werden). Zusätzliche Kontrollgruppen sollten einbezogen, um korrekte Werte in die Aufnahme-Parameter am Durchflusszytometer, darunter ein Rohr von Zellen, die nicht gekennzeichnet wurden, und Schläuche, die zum Ausgleich markierten Zellen unter Verwendung jedes einzelnen Farbe separat zu entsprechen. Um richtig eingestellt die Tore für die durchflusszytometrische Analyse, die Fluoreszenz Minus One (FMO) Kontrollen sollten während der Erfassung einbezogen werden. FMO Kontrollen sind Zellen, die mit allen Fluorochrom-konjugierten Antikörper, die auf der Platte bis auf eine, die von ihren Isotyp-Kontrolle ersetzt werden markiert. Positive und negative Populationen (dh, unabhängig Aliquots von Zellen mit einer positiven Kontrolle Stimulans und Medium allein behandelt wurden) sollten auch in FMO und Entschädigung Kontrollröhrchen einbezogen werden. </li><li&gt; 2 ml FACS-Puffer in jedes Röhrchen, vortexen und zentrifugieren bei 250 x g bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren Zellpellet in Restflüssigkeit durch Harken die Röhren über die Oberseite eines Reagenzglasständer. </li><li> Wenn der Antikörper-Panel besteht aus einem Antikörper nicht direkt an ein Fluorochrom konjugiert sondern ist an Biotin konjugiert, wird ein Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin erforderlich, um die Oberflächen-Marker zu visualisieren. In diesem Schritt fügen Sie eine entsprechende Volumen des verdünnten Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin und Inkubation im Dunkeln für 15 Minuten auf Eis. Wie in 4.2 wird die Streptavidin in einer Konzentration vom Hersteller empfohlen oder einem durch den Benutzer optimiert verdünnt werden. Dieser Schritt ist nur für Platten, die biotinylierte Primärantikörper benötigt. </li><li> Führen Sie ein Waschschritt wie in 4.10 beschrieben. </li><li> Verdünnen Sie ein entsprechendes Volumen von BD Stabilisierung Fixativ 1:3 in entionisiertem Wasser. Je 100 ul verdünnte Fixativ in jedes Röhrchen, während sanft vortexing Verklumpen zu verhindern von Zellen. Markierte und fixierten Zellen kann stabil in der Dunkelheit bei 4 ° C für etwa eine Woche vor der Übernahme mit einem Durchflusszytometer. </li></ol> 5. Repräsentative Daten Nanopartikel in Schritt 3.1 hergestellt hatten einen mittleren Durchmesser von 163 ± 24 nm und eine Morphologie mit dem von früheren Studien 5,16 erhalten. Nanopartikel in Lösung vor und nach der Beschallung sind in 1 gezeigt, um die Notwendigkeit für die Beschallung zeigen, um eine angemessene Verteilung der Partikel zu gewährleisten. Die durchflusszytometrische Analyse der geernteten AMɸs über Lungenlavage erhalten wird, in Abbildung 2 dargestellt. Markieren von Zellen mit einer Kombination von Anti-Maus-CD11b und anti-Maus-Antikörper F4/80 sowie die entsprechenden FMO Steuerelemente können zum Herstellen Hintergrundmarkierung, Identifizieren AMɸs und Gating für die weitere Analyse. Die Behandlung von Alveolarmakrophagen mit PolyanhydridNanopartikel erhöht Aktivierung durch die erhöhte mittlere Fluoreszenzintensität von MHC II, CD40, CD86 und CIRE (Abbildung 3). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" /> . Abbildung 1 50:50 CPTEG: CPH-Nanopartikel vor (a) und nach (B) 30 s Beschallung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" /> 2. Die durchflusszytometrische Analyse geerntet alveolären Makrophagen, die mit (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b und der PE-Cy7 FMO Kontrolle, (B) Alexa Fluor 700 FMO sowie der PE-Cy7 anti-F4/80 markiert und (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b-und PE-Cy7 anti-F4/80. Die Zahl in der oberen rechten Ecke stellt den Prozentsatz der doppelt-positiven Zellen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" /> 3. Histogramme zeigen eine Zunahme der Fluoreszenz Absichtensität für die Oberflächenexpression von MHC-II (A), CD40 (B), CD86 (C) und CIRE (D) nach Co-Kultur von alveolaren Makrophagen mit 50:50 CPTEG: CPH Polyanhydrid Nanopartikel für 48 Stunden. Histogramme zeigen Ergebnisse für AMɸ als FMO Kontrollen beschriftet ( <img alt="Graph-Linie 1" src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" /> ), Unbehandelt AMɸ beschriftet mit Antikörpern gegen alle Zelloberflächenmarker ( <img alt="Graph-Linie 3" src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" /> ) Und AMɸ kultiviert mit Nanopartikeln und beschriftet mit Antikörpern gegen alle Zelloberflächenmarker ( <img alt="Graph-Linie 2" src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" /> ).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Polyanhydrid Nanopartikel-Impfstoff-Plattformen haben die Wirksamkeit gezeigt, wenn intranasal in einzelnen Dosierungen 5 verwaltet. Messung der Aktivierung der ansässigen phagozytischen Zellpopulationen in der Lunge durch diesen Impfstoff induziert Delivery-Plattform ermöglicht eine Bewertung der potenziellen Fähigkeit, letztlich in der adaptiven Immunantwort. Insbesondere Ernte Alveolarmakrophagen aus Lungenlavage und behandelt sie mit verschiedenen Formulierungen der Nanopar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> cAM Medien </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 15 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> 50 mM 2-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M3148-25ML </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 10000 ug / ml Lösung </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td></td></tr><tr><td> FACS-Puffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumphosphat </td><td> Fisher Scientific </td><td> MK7868500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat </td><td> Fisher Scientific </td><td> P288-200 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) </td><td> Sigma </td><td> A7888 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td> Antikörper </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ratten-IgG </td><td> Sigma </td><td> I4341 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Frau CD16/32 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Frau MHC II Haplotyp IA / IE, Klon M5/114.15.2, konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) </td><td> EBIOSissenschaft </td><td> 11-5321 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD86, Klon GL-1, konjugiertes Allophycocyanin (APC)-Cy7 </td><td> BioLegend </td><td> 105030 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD40, Klon 1C10, konjugiert mit APC </td><td> eBioscience </td><td> 17-0401 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD209, Klon 5h10, konjugiert mit Biotin </td><td> eBioscience </td><td> 13-2091 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11b, Klon M1/70, konjugiert mit Alexa Fluor 700 </td><td> eBioscience </td><td> 56-0112 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus F4/80, Klon BM8, konjugiert mit Phycoerythrin (PE)-Cy7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-4801 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Texas-Rot konjugierten Streptavidin </td><td> BD Biosciences </td><td> 551487 </td><td></td></tr><tr><td> Sonstiges Zubehör und Reagenzien </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A405-20 </td><td> Wird als 70% (v / v) </td></tr><tr><td> Komprimiertem CO 2 </td><td> Linweld </td><td> 16000060 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml-Spritze </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Sovereign 3 ½ &quot;Fr Tom Catcatheter </td><td> Kendall </td><td> 703021 </td><td></td></tr><tr><td> Biosicherheitswerkbank </td><td> NuAire </td><td> Serie 22 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Schere </td><td> Fischer </td><td> 138082 </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td> Roboz </td><td> RS-8254 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 1x ohne Calcium und Magnesium </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 040-CM </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss </td><td> VWR International </td><td> 21008-216 </td><td></td></tr><tr><td> Sechs-Well-Platten Zellkulturbehandelt </td><td> Costar </td><td> 3516 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffrohr Racks </td><td> Nalgene </td><td> 5970 </td><td></td></tr><tr><td> Zellschaber 24 cm </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polystyrol Rundboden-Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Hilfe-XL </td><td> Drummond </td><td> 4-000-105 </td><td></td></tr><tr><td> 10, 5, und 2 ml-Pipetten </td><td> Fischer </td><td> 13-675 </td><td></td></tr><tr><td> 200 und 10 ul Mikroliterpipetten </td><td> Gilson Pipetman </td><td> F123601 </td><td></td></tr><tr><td> 200 und 10 ul Pipettenspitzen </td><td> Fischer </td><td> 02-707 </td><td></td></tr><tr><td> BD StabilisierendeFixativ </td><td> BD Biosciences </td><td> 338036 </td><td></td></tr><tr><td> Isoton II Diluent </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 8546719 </td><td></td></tr><tr><td> Zap-oglobin II-Lysereagenz </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 7546138 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Counter Vials Polystyrol </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 14310-684 </td><td></td></tr><tr><td> Reagenzgläser </td><td> BD Biosciences </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> Ausrüstung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kühlzentrifuge </td><td> Labnet </td><td> 50075040 </td><td></td></tr><tr><td> Befeuchteten Inkubator CO 2 </td><td> NuAire </td><td> Modell Autoflow 8500 </td><td></td></tr><tr><td> FACSCanto Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> 338960 </td><td></td></tr><tr><td> Coulter Particle Counter Z1 </td><td> Beckman-Coulter </td><td> WS-Z1DUALPC </td><td></td></tr><tr><td> Sonicator Liquid Processing Equipment mit Mikrospitzen </td><td> Misonix </td><td> Modell Nr. S-4000 </td><td></td></tr></tbody></table>

harvesting murine alveolar macrophages and evaluating cellular activation induced by polyanhydride nanoparticles

Biologisch abbaubare Nanopartikel als vielseitige Plattform für die Konzeption und Umsetzung von neuen intranasale Impfstoffe gegen respiratorische Infektionskrankheiten aufgetaucht. Insbesondere Nanopartikel Polyanhydrid aus der aliphatischen Sebacinsäure (SA), das aromatische 1,6-Bis (p-carboxyphenoxy) hexan (BER), oder die amphiphilen 1,8-Bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) haben einzigartige Masse und Oberflächenerosion Kinetik 1,2 und kann genutzt werden, um langsam freisetzen funktionelle Biomoleküle (zB Protein-Antigene, Immunglobuline, usw.) sind in vivo 3,4,5 werden. Diese Nanopartikel besitzen auch intrinsische Adjuvans-Aktivität, so dass sie eine ausgezeichnete Wahl für einen Impfstoff-Delivery-Plattform 6,7,8. Um die Mechanismen für die Aktivierung der angeborenen Immunität nach intranasaler Schleimhaut Impfung aufzuklären, muss man beurteilen, die molekularen und zellulären Reaktionen des Antigens pübelnehmend Zellen (APC) verantwortlich für die Initiierung Immunantworten. Dendritische Zellen sind die wichtigsten APCs in leitenden Atemwege vor, während Alveolarmakrophagen (AMɸ) im Lungenparenchym 9,10,11 überwiegen. AMɸ sind hoch effizient bei der Räumung in die Lunge von mikrobiellen Krankheitserregern und Zelltrümmer 12,13. Darüber hinaus spielt dieser Zelltyp eine wertvolle Rolle bei der Beförderung von mikrobiellen Antigenen zu den Lymphknoten, die ein wichtiger erster Schritt bei der Initiation einer adaptiven Immunantwort 9 ist. AMɸ auch zum Ausdruck bringen erhöhte Werte von angeborenen Mustererkennung und Scavenger-Rezeptoren, sezernieren pro-inflammatorischen Mediatoren und prime naiven T-Zellen 12,14. Ein relativ reine Population von AMɸ (z. B. größer als 80%) kann ebenfalls in Lungenspülung für Studie im Labor erhalten werden. Wohnhaft AMɸ von immunkompetenten Tieren geerntet werden einen repräsentativen Phänotyp der Makrophagen, wird encounter die Partikel-basierten Impfstoff in vivo. Hier beschreiben wir die Protokolle verwendet werden, um Ernte und Kultur AMɸ von Mäusen zu untersuchen und die Aktivierung der Makrophagen-Phänotyp nach Behandlung mit Polyanhydrid Nanopartikel in vitro.

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.7K Aufrufe.  Iowa State University. Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Serie: Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea (ureolysis) in naturally occurring environments through secretion of an enzyme urease. This process of ureolysis, through a chain of chemical reactions, leads to the formation of calcium carbonate precipitates. This is known as Microbiologically Induced Calcite Precipitation (MICP). The proper culture protocols for MICP are detailed here. Finally, visualization experiments under different modes of microscopy were performed to understand various aspects of the precipitation process. Techniques like optical microscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and X-Ray Photo-electron Spectroscopy (XPS)&#160;were employed to chemically characterize the end-product. Further, the ability of these precipitates to clog pores inside a natural porous medium was demonstrated through a qualitative experiment where sponge bars were used to mimic a pore-network with a range of length scales. A sponge bar dipped in the culture medium containing the bacterial cells hardens due to the clogging of its pores resulting from the continuous process of chemical precipitation. This hardened sponge bar exhibits superior strength when compared to a control sponge bar which becomes compressed and squeezed under the action of an applied external load, while the hardened bar is able to support the same weight with little deformation.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Mikrobiologisch Induzierte Calcitausfällung Vermittelt durch<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...