Diese Forschung wurde durch das Department of Defense gewähren TSA 140010 MK und BC 111038 MMM Ansichten und Meinungen von und Vermerke, die von dem Autor (en) nicht genau den von der US-Armee oder dem Department of Defense unterstützt.

Alle Tierversuche wurden von Institutional Animal Care und Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center und folgen den Leitlinien gemäß dem &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot;, veröffentlicht von der National Institutes of Health zugelassen. Verwenden von acht bis zwölf Wochen alte weibliche BALB / c-Mäuse, die im Handel erhältlich sind. Injizieren Sie 1 x 10 5 4T1 oder 1 x 10 5 4T1 Zellen, die GFP, die von verschiedenen Anbietern gekauft werden können, in das Brustfettpolster. 1. Kultur von 4T1 und 4T1-GFP - Zellen und Herstellung von Tumorzellsuspension für Injektionszwecke 14 <ol><li> 4T1 und 4T1-GFP Zellkultur HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Biosicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Maintain 4T1 und 4T1-GFP-Zellen in RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin ergänztG und 100 ug / ml Streptomycinsulfat. HINWEIS: Bestimmen Sie eine Passage-Nummer von jedem Trypsinierung und Galvanisieren von Zellen zu zählen. Es ist wichtig, die Zellen mit der gleichen Durchgangszahl für alle Maus-Experimente zu verwenden, da die Anzahl der Durchgänge Zelle Tumorigenität und metastatische Potential beeinflußt. </li><li> Vor der Zellinjektionen entfernen Sie den T75 cm 2 Kolben, Tumorzellen bei 80% Konfluenz enthält, aus einem Inkubator und absaugen Medium. 10 ml PBS und drehen Sie den Kolben vorsichtig restliche Medium zu waschen, und dann PBS absaugen. </li><li> 2 ml 0,25% Trypsin - EDTA mit dem Kolben und kippen die Lösung gleichmäßig auf der Oberfläche zu verteilen und es wurde 3 min bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. </li><li> Tippen Sie auf den Kolben Ablösung von Zellen zu erleichtern und 8 ml frisches Medium. Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten. </li><li> Zentrifugenzellen für 5 min. bei 500 × g bei RT.Aspirieren den Überstand und wasche Zellen in 10 ml PBS. </li><li> Pipette nach oben und unten mehrmals Klumpen zu stören und eine Einzelzellsuspension erhalten. Nehmen Sie 100 ul einer Zellsuspension und die Zellen zählen, um die Lebensfähigkeit der Zellen-Analyzer als den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Berechnung der Anzahl der für alle Injektionen erforderlich Zellen Formel: 10 5 Zellen pro Maus x Anzahl der Mäuse in einem Experiment verwendet (immer zusätzliche Zellen vorbereiten auf einer sicheren Seite zu sein). </li><li> Zentrifugen Zellen, wie in 1.1.5. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Zellen in der Menge an frischer PBS erforderlich , um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis sie bereit zur Injektion. </li></ol></li><li> 4T1 oder 4T1-GFP Zellinjektion-Maus - Verfahren <ol><li> Am Tag vor der Injektion der Tumorzellen, betäuben Mäuse in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran. Sobald Mäuse schlafen und atmen regelmäßig statt ter die Maus auf einem OP-Pad mit der Nase in der Nase Kegel, und verbinden Sie es mit der Isofluran Verdampfer. Pflegen Anästhesie mit 2,5% Isofluran. Pinch die Maus Zehe, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt. </li><li> Bewerben Enthaarungscreme mit einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle (rechte Brustbrustfettpolster) und für 2 Minuten warten. Reinigen Sie die Website ein nasses Papiertuch verwenden, legen Sie die Maus wieder in den Käfig und zu überwachen, ein Tier, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt die Brustlage zu halten. </li><li> Am Tag der Injektion, betäuben die Mäuse wie in 1.2.2 und auf den OP-Pad. </li><li> Vortex die Röhre Tumorzellen mit einheitlichen Zellsuspension zu erhalten. Aspirat 100 &amp; mgr; l einer Zellsuspension, die 1 x 10 5 Tumorzellen in ein 0,5 ml Insulinspritze (29 G, 12,7 mm-Nadellänge). </li><li> Heben Sie die Haut mit dem Daumen und Zeigefinger in der Nähe des 2. und 3. Nippel, legen Sie die Nadel der Spritze in die Mammary fat pad knapp unterhalb der dritten Brustwarze unter der Haut zwischen den Fingern und injizieren Zellen langsam eine Blase (subkutane Injektion) zu bilden. </li><li> Platzieren Sie die Maus wieder in den Käfig nach der Injektion und zu überwachen, wie in 1.2.2. </li></ol></li><li> Überwachung Tumorwachstum <ol><li> Kalipermessungen 14 HINWEIS: Eingespritzte 4T1 oder 4T1-GFP-Zellen bilden aggressive Brusttumor. Normalerweise sind die tastbaren Tumoren erscheinen ~ am Tag 4 - 5 nach Zellinokulation. 4T1-GFP-Zellen bilden Tumoren, die langsamer wachsen und Metastasen später geben. Messen Sie den Tumor zwei- bis dreimal pro Woche. Wenn klinischen Zustand der Tiere verschlechtert, Tiere verlieren mehr als 10% des Körpergewichts übersteigen Tumoren 10% des Körpergewichts oder vereitert werden, einschläfern sofort Mäuse. <ol><li> Anesthetize eine Maus, wie in Abschnitt 1.2.1., Wiegen, Platz auf dem OP-Pad und benetzen Sie den Bereich mit 70% Ethanol. </li><li> Palpieren Geschwulst in der Injektionsstelle (4 - 5 Tage nach der Inokulation Zelle). </li> &lt;li&gt; Messen der größte Durchmesser (D) und kleineren Durchmesser (d1) mit einem Sattel. </li><li> Berechnen Tumorvolumen Formel Lautstärke mit = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Überwachen Sie die Maus aus der Narkose wie in 1.2.2. </li></ol></li><li> Imaging (Nur für 4T1 GFP - Zellen) <ol><li> Anesthetize die Maus wie in Abschnitt 1.2.1. Platzieren Sie die Maus auf einer beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments. Pflegen Anästhesie durch die Nase Kegel. </li><li> Schalten Sie das Abbildungsinstrument und die Lichtquelle als den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Erwerb&quot; Gehe zu &quot;Beleuchtung&quot; und wechseln Sie in die leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Stellen Sie sicher, dass der Light-Engine ist ON und wählen Sie &quot;Trans&quot; in dem Lichttisch. </li><li> Unter dem Reiter &quot;Mikroskop&quot;, wählen Sie &quot;Clear&quot; Emissionsfilter und 0,5X Vergrößerung. In der &quot;Kamera&quot; Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning &quot;1 x 1 &#39;und Vorschau&quot; 4 x 4&#39;. </li&gt; <li> Klicken Sie auf Vorschau, den Tumor in weißem Licht ausfindig zu machen, konzentrieren klares Bild zu bekommen, und Capture. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Acquisition&quot; Registerkarte und ändern Beleuchtung zu filtern 1 (Filter für GFP gemäß Herstelleranweisung). Im &quot;Mikroskop&quot; Registerkarte ändern Emissionsfilter auf &quot;530/20 GF&quot;. Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten. </li><li> Bewerben Pseudo auf das Bild , und speichern Sie in den entsprechenden Ordner (Abbildung 1). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Die intranasale Verabreichung von Liposome 10 HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter Verwendung von sterilen Lösungen in einem laminaren Luftstrom (LAF) Bio-Sicherheitsschrank, sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Am 6. Tag nach der Tumorzellinjektion betäuben Mäuse wie in Abschnitt 1.2.1. </li><li> Vortex die Clodronat oder Kontrolle (PBS) Liposomensuspension vom Hersteller erhalten. Nehmen Sie 60 ul Liposomen sUSSETZUNG mit einer sterilen Pipettenspitze. </li><li> Freisetzung langsam Liposom-Lösung (5 ul jedes Mal) in der Nähe der Nase der Maus ermöglicht in der Lösung zu atmen, wiederholen, bis die gesamte Dosis von 60 &amp; mgr; l verabreicht. </li><li> Lassen Sie die Maus wieder zu Bewusstsein kommen, bevor es Platzierung in den Käfig zurück. </li><li> Wiederholen Sie Liposom Verabreichung alle 3 Tage, bis die Mäuse getötet. Nicht anwenden Liposomen an einem Tag des Opfers. </li></ol> 3. Maus-Opfer und Gewebeentnahme HINWEIS: Die Verwendung autoklaviert und sterile Instrumente für Maus-Dissektion. Euthanize Mäuse während der Narkose durch die Ausblutung und die Entfernung der lebenswichtigen Organe. <ol><li> Am Tag 22 (Für 4T1-Zellen) oder Tag 26 (für 4T1-GFP-Zellen) nach der Injektion von Tumorzellen der Maus, wie in Abschnitt 1.2.1 betäuben. und auf den OP-Pad mit einem Nasenkegel auf Verdampfer verbunden ist, halten Anästhesie wie in Abschnitt 1.2.1. Einklemmen einer der Zehen, dass der m, um sicherzustellen,Ouse ist bewusstlos. </li><li> Stecken Sie die Zehen mit Nadeln zur Dissektion Bord. Spray Ethanol auf die Haut von Mäusen. </li><li> Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und einen Schnitt machen die chirurgische Schere. Langsam das Peritoneum aussetzen und fortsetzen, bis die Haut am Hals durch den Brustkorb zu schneiden. </li><li> Unter Verwendung der chirurgischen Schere einen Einschnitt in das Peritoneum machen und sorgfältig die Organe mit Baumwollspitzen ausgesetzt werden Schäden an den Blutgefäßen zu vermeiden. </li><li> Verschieben Sie die Organe auf der einen Seite und setzen die untere Hohlvene. Die Punktion der Vene und sammeln Blut mit dem 29 G Insulinspritze. Legen Sie gesammelte Blut in das Röhrchen und verlassen auf dem Eis zur weiteren Verarbeitung. </li><li> Schneiden Sie die Membran der Brustkorb, Lunge und Herz zu belichten. schneiden Sie langsam den Brustkorb auf beiden Seiten des Knochenschneider und heben Sie die Spitze der Brustkorb mit. Ergreifen Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie das Bindegewebe, das Herz und die Lunge in die Brusthöhle verbindet. </li><li> Platzieren Sie die Lungen in kleinen Menge PBS in den 60 mmPetrischale auf Eis, bis sie bereit für die Bildgebung und die Weiterverarbeitung zu Gefrierschnitten für Immunfluoreszenz-Mikroskopie oder Routine-Histologie [einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung]. </li></ol> 4. Lungenmetastasen Bewertung <ol><li> Zählen und Scoring Oberflächen Metastasierung <ol><li> Legen Sie die Petrischale mit den Lungen unter dem Präpariermikroskop. Konzentrieren Sie eine klare Sicht auf die Lungenoberfläche zu erhalten. </li><li> ein Präpariermikroskop Mit der Lungenoberfläche beobachten. Graf Metastasen auf den vorderen und hinteren Seiten der beiden Lungen. HINWEIS: Die normale Lunge ist weißlich oder rosa und porös und weist eine schwammartige Struktur. 4T1 Metastasen sind solide und nicht porösen, manchmal scheinen zu einem Tropfen Flüssigkeit (2A) ähnlich zu sein. </li></ol></li><li> Lungenbildgebung <ol><li> Legen Sie die Petrischale mit Lungen auf der beweglichen Bühne im Inneren des Abbildungsinstruments. </li><li> Schalten Sie das Gerät und dieBioLite Multispektraldaten Quelle. Öffnen Sie die Software. Unter der Registerkarte &quot;Erwerb&quot;, gehen Sie zu &quot;Beleuchtung&quot;, und wechseln Sie in leere Position (kein Filter) für weißes Licht. Light Engine -&gt; ON, Lichttisch -&gt; Epi. Unter dem Reiter &quot;Mikroskop&quot; Wählen Sie &quot;Löschen&quot; Emissionsfilter und Vergrößerung 1.66X. In der &quot;Kamera&quot; Registerkarte, stellen Sie sicher, dass für die Aufnahme Binning &quot;1 x 1 &#39;und Vorschau&quot; 4 x 4&#39;. </li><li> Klicken Sie auf Vorschau und konzentrieren sich ein klares Bild von der Lunge in weißes Licht zu erhalten und Capture. </li><li> Gehen Sie (für GFP-Filter gemäß Herstelleranweisung) an den Filter 1 auf &quot;Acquisition&quot; Registerkarte und ändern. Im &quot;Mikroskop&quot; Registerkarte ändern Emissionsfilter auf &quot;530/20 GF&quot;. Vorschau und Aufnahme-Bild in einem grünen Kanal. Passen Sie die Belichtungszeit die entsprechende Helligkeit zu erhalten. </li><li> Bewerben Pseudo auf das Bild, und in entsprechenden Ordner speichern. </li><li> Flip die Lungen Bild der anderen Seite in ähnlicher Weise zu erhalten. Diese procEDURE erzeugt Bilder von GFP-positiven Metastasen , die weitere geeignete Software (2B) quantifiziert werden kann unter Verwendung von 14. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenz - Mikroskopie <ol><li> Fixieren die Lungen in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 4 Stunden in Dunkelheit. </li><li> Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 10 ml PBS für 5 Minuten, um vollständig das Fixiermittel zu entfernen. Übertragen auf 18% Saccharose in PBS und O / N bei 4 ° C inkubiert. </li><li> Entfernen Sie das Gewebe aus der Saccharose und abtupfen überschüssige. </li><li> Nehmen Sie einen cryomold, decken Sie die untere Schicht mit Oktober Medium. Legen Sie das Gewebe auf Oktober Medium. Füllen Sie die Form mit Oktober Medium vollständig in das Gewebe und auf Trockeneis zu decken. </li><li> Speicher-Block bei -80 ° C bis zum Schneiden. </li><li> Bereiten Sie 5 um dicke Abschnitte mit einem Kryostaten und auf geladene Objektträger. </li><li> Nicht gebrauchte Folien in -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Luft trocknen die Folien für 7 min. und waschen mit PBS Oktober zu entfernen. Wipe der Schieber mit Handtuch Gewebe oder Papier über Wasser zu entfernen, montieren Deckgläser mit Medium mit GFP-Filter unter dem Mikroskop enthält DAPI Montage und zu visualisieren. </li><li> Quantifizierung GFP Metastasen (3A) mit der Verwendung von geeigneter Software 14. </li></ol></li><li> Histologie und die digitale Pathologie <ol><li> Klicken Sie auf die manuelle Last Taste unter der Registerkarte Start und warten auf den Schlitten Rack halten vom Scanner auszuwerfen. </li><li> Nehmen Sie die H &amp; E-gefärbten Gewebeschnitt, reinigen Sie es mit Gewebe Schmutz zu entfernen, und legen Sie sie sicher in der Dia Haltegestell. </li><li> Geben Sie die Dia Beschreibung in knallte-up-Fenster. </li><li> Wählen Sie den Scanbereich auf die Registerkarte SS Imaging-Konsolenfenster und stellen Sie den grünen Quadrat der Region of Interest (ROI) zu definieren, gescannt werden. </li><li> Ziehen Sie den blauen Kalibrierungs Diamant zu einem klaren Teil des Schlittens, in dem Gewebe nicht vorhanden ist, jedoch innerhalb der ROI. </li><li> Als nächstes wählen Sie den Fokus Punkte Registerkarte und klicken Sie auf die Auto-Select-Taste mehrere Fokuspunkte (gelbe Pluszeichen) auf das Gewebe in der ROI zu erzielen. </li><li> Falls erforderlich, legen Sie zusätzliche Schwerpunkte manuell durch einen Doppelklick innerhalb des ROI. </li><li> Fahren Sie mit der Kalibrier-Menü und wählen Sie die Schaltfläche Kalibrieren Dia Kalibrierung an der blauen Kalibrierungsdiamantspitze zu beginnen. Nach der Kalibrierung das Bild von dem Kalibrierungspunkt abgeschlossen ist, wird angezeigt. </li><li> Überprüfen Sie das Bild, um sicherzustellen, dass sie klar und frei von Schmutz oder Artefakte. </li><li> Fahren Sie mit der Registerkarte Scannen und wählen Sie Start Scan Scannen des ROI zu beginnen. Abgetastet histologischen Schnitt wird in ein digitales umgewandelt Schieber (3B und 4A) </li><li> Quantifizierung metastatic Belastung wie zuvor beschrieben (4B) 14. </li></ol></li></ol> 5. Durchflusszytometrie (FACS) Analyse der Alveolarmakrophagen in den Lungen <ol><li> Herstellung von Single Cell Schutzsperreauf <ol><li> Nach der Bebilderung und das Zählen von Metastasen, waschen Sie die Lungen mit sterilem PBS und in die Petrischale legen. Damit 1 - 2 mm Stücke der Lunge mit chirurgische Schere und Pinzette. </li><li> Übertragen die Lungenstücke in die 15 ml konischen Röhrchen mit 3 ml des Verdauungspuffer, enthaltend 1 mg / ml Kollagenase P, 0,04 mg / ml DNase I und 10 ug / ml Trypsininhibitor gelöst RPMI-Medium (steril). </li><li> Inkubieren des konischen Rohr auf einer rotierenden Schüttelmaschine im Inkubator bei 37 ° C für 40 min. </li><li> Entfernen Sie das Rohr konisch aus dem Inkubator und Pipette die Lösung nach oben und unten um das Gewebe zu distanzieren. </li><li> Übergeben Sie die Lösung durch die 40 &amp; mgr; m Sieb zu Klumpen zu vermeiden und eine Einzelzellsuspension erhalten. Falls erforderlich, besser das verdaute Gewebe Pressgewebe gegen die Zellsieb mit Hilfe eines Spritzenkolbens zu zerfallen. </li><li> Wenn eine Einzelzellsuspension erreicht worden ist, sammelt die Zellen durch Zentrifugation und Lyse mit roten Blutkörperchen2 ml ACK-Puffer für 10 min bei RT. Dann waschen ein Pellet zweimal in 8 ml RPMI. </li><li> Die Zellen in 3 ml des kompletten RPMI-Medium und gehen Sie den Anweisungen des Herstellers, die die Lebensfähigkeit der Zellen Analysator zählen zu Zelle. </li></ol></li><li> Die Färbung von Lungenzellen für Oberflächenmarker ANMERKUNG: Führen alle Inkubationen bei 4 ° C. Zentrifugenplatte bei 500 xg und 4 ° C. <ol><li> Pipette 1 x 10 6 Zellen in 100 &amp; mgr; l FACS - Puffer (1% FBS in PBS) in die einzelnen Vertiefungen einer V-Boden 96-Well - Platte. ein V-Boden 96 Well-Platte unter Verwendung erleichtert Gabe von mehreren Proben. </li><li> Pre-Inkubation der Zellsuspension mit 1 ug Maus-Fc-Block gereinigt anti-Maus-CD16 / CD32 in 100 ul FACS-Puffer für 15 min. Zentrifugieren Sie die V-Boden 96-Well-Platte, die Zellen zu pelletieren und den Überstand zu entfernen, indem die Platte Spiegeln und lassen Sie die Lösung abtropfen lassen. </li><li> Für die Oberflächenfärbung, im Voraus, verdünnen die Antikörper gegen Murine - Antigene in einem Rohr (Master - Mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (SM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) bis zu einer Endkonzentration von 2,5 ug / ml in FACS - Puffer , enthaltend 10 ug / ml Fc Block CD16 / CD32 Antikörper. HINWEIS: Dieser Satz von Antikörpern ist nützlich für die Identifizierung und die Bewertung eines funktionellen Status von alveolären Makrophagen und dendritischen Zellen. </li><li> 100 l verdünnte Antikörper (Master-Mix) zu den Vertiefungen der V-Boden 96 Well-Platte und Inkubation bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Überstand wie in 5.2.2. Wasche die Zellen mit 200 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifugation bei 500 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. und resuspendieren Zellen in 200 ul PBS. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und fügen Lebensfähigkeit Farbstoff verdünnt in PBS (1: 1000). Inkubieren für 20 Minuten bei 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Zentrifugieren Sie die Platte Zellen zu pelletieren und entfernen Sie den Überstand wie in 5.2.2. Waschen mit 200 ul PBS und Zentrifuge wieder die Platte. </li><li> Die Zellen in 100 ul 1% Paraformaldehyd und lagern bei 4 ° C bis zum Erwerb durch FACS-Instrument. Vor der Akquisition Transfer Zellsuspensionen auf die Polypropylen-FACS-Röhrchen. </li></ol></li></ol> 6. Analyse der FACS Daten: Gating-Strategien und die Identifizierung von Zell-Subpopulationen <ol><li> Führen Sie die FACS - Analyse wie zuvor 10 berichtet. Tor erworben Zellen / Ereignisse basierend auf zukunfts- (FSC) und Seitenstreuung (SSC); und dann Tor Live und CD45 + Zellen. Für Alveolarmakrophage Identifizierung, Tor CD11b-negativ und dann CD11c + F4 / 80 + Zellen. (5A). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

The recent insights into cancer biology and causative factors involved in carcinogenesis and tumor progression lead to development of genetically engineered mouse (GEM) models of cancer, in which tumors grow spontaneously, usually over a period of several months15. Although these tumor models appear to reflect better the natural history of human malignancies than xenografts or syngeneic models, much time required for tumor development and various degrees of malignant phenotype penetrance limit the use of these approaches in mechanistic studies. Therefore, the models utilizing immunocompetent mice injected orthotopically with syngeneic cells, although not perfect, are still helpful in addressing mechanistic questions pertaining to the tumor microenvironment and a role of the immune system in cancer. The 4T1 model has been extensively used for these purposes, as it recapitulates stage IV metastatic breast cancer in humans11. 
The use of 4T1 tumor cells expressing fluorescent proteins offers opportunity to monitor tumor growth, changes in the tumor cell viability, and metastasis through animal imaging14. Although this is an elegant approach to track metastasizing cells, some concerns related to the potential immunogenicity of 4T1 cells expressing GFP, and the generation of antibodies specifically recognizing 4T1-GFP cells have been raised16. However, these antibodies were found to be present in mouse plasma three weeks or later after the implantation of tumor cells16. Therefore, considering rapid growth of tumors in this model and the fact that mice are usually sacrificed before a humoral response develops or shortly after, 4T1-GFP model appears to be a useful tool for tracking circulating tumor cells in short term studies. In addition, it has been noted that low GFP expression, which characterize cells that we used for our studies, induces tolerance to GFP peptides instead of causing lymphocyte activation17.
The potential problem associated with the low level of GFP expression is long exposure time required to image organs, which are target for metastases, or tissue sections, to detect endogenous GFP expression. For immunofluorescent microscopy this problem can be, however, overcome by staining sections with appropriate GFP antibodies 
The critical aspect of these studies is also an appropriate technique of the orthotopic cell injection, as any leakage of the solution containing tumor cells reduces the number of cells injected and, consequently, affects the pace of tumor growth and metastatic potential. By adjusting the number of injected cells, one can modify speed of tumor growth and time interval between injection of tumor cells and metastatic progression of disease. In addition, it is important to consider high variability of results obtained through the majority of in vivo approaches including those discussed here. Therefore, a sufficient number of mice, individually determined through a power analysis, needs to be used. In our laboratory, we typically use ten mice per cohort. 
The use of clodronate liposomes to deplete different macrophage populations has been extensively explored18. However, several concerns related to specificity of this approach are repeatedly raised. Although intravenous injections of clodronate-liposomes depletes several different type of phagocytes in different organs, intratracheal or intranasal administration affects mainly lung macrophages18. Furthermore, our recent study has demonstrated that intranasal instillation of clodronate-liposomes, according to the protocol established in our laboratory, leads only to the depletion of alveolar macrophages, typically located in the lumen of lung alveoli, but does not affect myeloid-derived suppressor cells and interstitial macrophages10.

The premetastatic niche is an important process in cancer metastasis defined as a set of alterations that occur in the organs that are targets for metastases prior to arrival of tumor cells1,2. Therefore, therapeutic targeting of this step of cancer progression may prevent metastases to the vital organs that cause approximately 90% of cancer-associated deaths. Although the concept of the premetastatic niche, also known as the "seed and soil" theory, was introduced more than a century ago, no experimental proof has been provided until recently, when the bone marrow-derived cells were demonstrated to contribute to the premetastatic soil1,3-7. Despite these developments, the premetastatic niche remains a largely understudied aspect of cancer pathophysiology and further research to identify cellular players and mechanisms involved is needed. 
Here we report the in vivo approaches to study the role of alveolar macrophages in breast cancer metastases and the lung premetastatic niche. The alveolar macrophages arrive to the lungs early during the embryonic development and self-renew there during adulthood8. They also have important immunomodulatory and homeostatic functions including the protection of this organ from undesired inflammatory responses to the environmental innocuous antigens9. Therefore, we hypothesize that tumors exploit this physiological immunosuppression, imposed by alveolar macrophages, and, consequently, alveolar macrophages contribute to the lung premetastatic niche by suppressing antitumor immunity. This hypothesis is supported by our recent report demonstrating that the specific depletion of these cells reduces lung metastases and enhances antitumor T cell responses10. 
For these studies we apply a well-established syngeneic model of breast cancer (4T1), which mimics stage IV metastatic breast cancer11; and has been previously reported in studies of the premetastatic niche6. To track metastasizing tumor cells in vivo we use 4T1 cells expressing GFP (4T1-GFP) in conjunction with animal imaging and confocal microscopy. We focus on the lung premetastatic niche, since this organ is one of the most common targets of hematogenous metastases of human malignancies12. To investigate functions of alveolar macrophages in the premetastatic niche, we use clodronate liposomes to deplete these cells13; and evaluate impact of this depletion on lung metastases. Of note, this method specifically depletes alveolar macrophages but no other phagocytic cells in the lungs or in circulation10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">4T1 cell line&#160;</td>
			<td style="width:417px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td>
			<td style="width:139px;">CRL 2539</td>
			<td style="width:287px;">Tumor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4T1-GFP cell line</td>
			<td>Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>BW128090</td>
			<td>Tumor cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>10-040-CM</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heat inactivated FBS</td>
			<td>Gibco (Thermo Scientific), USA</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>MT-300-02-CI</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>Dilute with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 0.25% with EDTA</td>
			<td>Hyclone, Logan, Utah, USA</td>
			<td>SH30042.02</td>
			<td>Tissue culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T75 cm2 flask</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>12-565-32</td>
			<td>Tissue culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15ml conical tube</td>
			<td>BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352096</td>
			<td>Tissue culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml conical tube</td>
			<td>BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>352098</td>
			<td>Tissue culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm2 Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>AS4052</td>
			<td>For lung imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane (Isothesia)</td>
			<td>Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clodronate liposomes</td>
			<td>Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA</td>
			<td>F70101C-N</td>
			<td>Macrophages depletion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Control liposomes</td>
			<td>Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA</td>
			<td>F70101-N</td>
			<td>Control PBS-liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On</td>
			<td>Walmart, Bentonville, AR, USA</td>
			<td></td>
			<td>For tumor cell injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair removal cream (Nair)</td>
			<td>Walmart, Bentonville, AR, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde solution (4%)</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>19943-I Lt</td>
			<td>Dilute to 4% or 1% using 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>230-730-571</td>
			<td>For freezing tissue in cryomolds</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluoro-Gel-II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td>
			<td>17985-51</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>S-9378</td>
			<td style="width:287px;">Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche, Basel, Switzerland</td>
			<td>11249002001</td>
			<td>Components of tissue digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dnase I</td>
			<td>Roche, Basel, Switzerland</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Components of tissue digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T9253</td>
			<td>Components of tissue digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 micron cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Used in tissue digestion to remove clumps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32)</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>101320</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BV605 CD45</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>103139</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE CD11b</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>101207</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Cy7 F4/80&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>123113</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC/Cy7 CD11c</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>117323</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>107625</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE CD80</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>104707</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AF647 CD86</td>
			<td>Biolegend, San Diego, CA, USA</td>
			<td>105019</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixable viability Dye eflour 506</td>
			<td>eBioscience, San Diego, CA,USA</td>
			<td>65-0866</td>
			<td style="width:287px;">Antibodies for flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UVP iBox Explorer</td>
			<td>UVP Inc, Upland, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mouse and lung fluorescent imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aperio Scanscope CS</td>
			<td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>Digital pathology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD LSRFortessa&#160;</td>
			<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry/data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Nikon A1 confocal TE2000 microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.</td>
			<td></td>
			<td style="width:287px;">Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38)</td>
			<td style="width:417px;">UVP Inc, Upland, CA, USA</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td>Imaging software for iBOX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)&#160;</td>
			<td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td style="width:287px;">Imaging software for analysis of digital slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow JO software (version 9.8.1)</td>
			<td>Flow JO LLC, Ashland, OR, USA</td>
			<td></td>
			<td>Analysis of flow cytometric data</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A.</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:287px;">Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the role of alveolar macrophages in breast cancer metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Die Injektion von 4T1-GFP Tumorzellen in das Brustfettpolster führt zur Bildung von Mäuse - Tumoren (1A), die die Metastasierung von menschlichen Brustkrebs rekapitulieren, wie Metastasen in der Lunge (2), Leber, Knochen schnell gebildet und das Gehirn von Mäusen 11. Die stabile Transfektion von 4T1 - Zellen mit GFP erleichtert die Überwachung des Tumorwachstums (1B), metastasierende Tumorzellen verfolgt und Quantifizieren der metastatischen Belastung (2B, 3B). Zusätzlich Abbildung von Tumoren bietet die zusätzliche Information bezüglich verschiedener pathologischer Funktionen wie Tumorzelltod und Tumorvaskulatur. Die helle grüne Fluoreszenz (Abbildung 1B-die mittleren Platten) zeigen die hohe GFP - Expression, die in der Regel mit dem lebensfähigen Tumorparenchym verbunden ist. Während der Mangel an GFP in einigen Tumorbereichen kann Tumor Zelltod zeigen ( <strOng&gt; 1B-die rechte Tafel). GFP ist auch abwesend aus den gewundenen anomale Tumorblutgefäße (Abbildung 1B-die rechte Tafel). Da die Mehrzahl von Lungenmetastasen auf der Lungenoberfläche befinden, können sie sich unter dem regulären Präpariermikroskop beobachtet werden. Die Metastasen sind in der Regel deutlich von dem umgebenden Parenchym (2A). Um grobe Beobachtungen überprüfen und zu bewerten Metastasen , die tiefer im Lungenparenchym sind, können Fluoreszenz - Bildgebung der Lunge durchgeführt (2B), wenn GFP - exprimierenden Zellen wurden für die Injektion verwendet. Obwohl Lungenautofluoreszenz in den Bildern, helle GFP-Fluoreszenz abgeleitet erleichtert Scheidungs ​​Metastasen von umgebenden Lungenparenchym deutlich sichtbar ist. Alternativ Routine - Histologie (3A und 4A) in Verbindung mit digitalen Pathologie Algorithmen ( <strong&gt; 4B) bieten gute Werkzeuge , um zu überprüfen und Metastasen zu quantifizieren. Mehrfarben-FACS bietet Gelegenheit, sogar seltene Zellpopulationen durch die Verwendung von Multipol-Zelloberfläche und / oder zytoplasmatischen Marker gleichzeitig zu charakterisieren. Alveolarmakrophagen werden durch den Mangel an CD11b - Expression und die Expression von F4 / 80 und CD11c (Abbildung 5) charakterisiert. Der typische Ansatz , um diese Zellen zu identifizieren , mittels Durchflusszytometrie umfasst: (i) die Auswahl der Zellpopulation auf Basis von Morphologie durch Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften dargestellt, (ii) Auswahl der lebenden CD45 + Zellen , gefolgt von (iii) Gating von CD11b - negativen Zellen, und (iv) Gating von Zellen Koexpression F4 / 80 und CD11c (5A, B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54306/54306fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überwachung des Tumorwachstums Through Tier Imaging. (A) Weißlichtbildern der injizierten Maus mit GFP Zellen in das Brustfettpolster zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tumorzellinjektion. (B) Die entsprechenden Fluoreszenzbilder erhalten durch die Verwendung von GFP exprimierenden Filters. Eine gestrichelte Linien markieren Tumorbereich. Beachten Sie das Fehlen von leuchtend grünen Fluoreszenz in einigen Tumorbereichen am Tag 26, die aus Gewebe Nekrose oder die Entwicklung von neovasculature führen kann. Maßstabsleiste, 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54306/54306fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bewertung der Lunge Metastasen Burden. (A) Bilder von den Lungen von Mäusen , die mit 4T1 Zellen in das Brustfettpolster mit den Oberflächen Metastasen injiziert (Pfeile).(B) Bilder von GFP + Lungenmetastasen (helle grüne Fluoreszenz) erhalten durch den Einsatz von Imaging - Mikroskop. Maßstabsleiste, 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54306/54306fig3.jpg" /> Abbildung 3. Digitale Histopathologie und konfokale Mikroskopie in Imaging von Lungenmetastasen. (A) Die Scan des Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) gefärbt Lunge Abschnitt von Mäusen , die mit 4T1 Zellen in das Brustfettpolster (dunkelblau Gewebe-Metastasen) injiziert. Maßstabsbalken, 4 mm. (B) Die konfokale Mikroskopie von GFP + Lungenmetastasen (helle grüne Fluoreszenz). Maßstabsbalken, 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig3large.jpg" target="_blank">eine größere versio zu sehen</a>n dieser Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54306/54306fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quantifizierung der Lunge Metastasen Burden von Digital Histopathologie. (A) Die Scan von Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) gefärbt Lunge Abschnitt (dunkelblau Gewebe-Metastasen). (B) Das Bild der Lunge in (A) gezeigt ist, erzeugt durch ein trainierbar Histomorphologie Bildanalyse-Tool (software- &quot;Genie&quot;). Rote Farbe zeigt die Lungenbereiche von &quot;Genie&quot;, wie Metastasen identifiziert. Maßstabsbalken, 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54306/54306fig5.jpg" /> Abbildung 5. Flow Cytometry AppKakerlaken zur Identifizierung von Alveolarmakrophagen in der Lunge. (A) Die representativeflow cytometrydot die Gating - Strategie plotsillustrating CD45 + CD11b negativen F4 / 80 + CD11c + Alveolarmakrophagen zu identifizieren. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie plotsillustrating Wirkung der Kontrolle oder Clodronat-Liposomen auf die Lungen Alveolarmakrophagen dot. Die Zahlen in Parzellen Prozente von gated Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54306/54306fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

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Serie: Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Forschung

Medizin

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Models von Knochenmetastasen

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...