Wir danken Prof. A. Vinogradov und Dr. Vera Grivennikova für die Einführung der Autoren auf dem Gebiet der mitochondrialen Biologie und viele nützliche Einsichten und Ratschläge in diesem Verfahren. Die Autoren bedanken sich bei Frau Amanda McKintock von der Queens University Medien Büro für die Hilfe bei der Video-Vorbereitung.

Einführung Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels. Sie können schnell und zuverlässig in großen Mengen gewonnen werden aus Wildtyp-oder Knock-out-Tiere. Das allgemeine Verfahren besteht aus Gewebe durch Trypsin, Fraktionierung und differentielle Zentrifugation. Es gibt verschiedene Bedingungen, die bei der Isolierung von Mitochondrien aus verschiedenen Geweben gehalten werden, einschließlich des Herzens (Abb. 1). <ul><li> Das Gewebe muss gründlich zerkleinert werden, da sie direkten Einfluss auf die Ausbeute der erhaltenen Mitochondrien. Herzgewebe ist am besten mit kleinen gebogenen Schere Hackfleisch und kann durch einen Latapie Gewebe Mühle verfolgt werden oder, wenn ein Gewebe Mahlwerk nicht verfügbar ist, eine Knoblauchpresse mit Austrittslöchern Durchmesser von etwa 1,0 mm Durchmesser. </li><li> Es ist notwendig, um die Temperatur der Lösungen bei jedem Schritt zu halten. Deshalb ist die gesamte Verfahren muss in einem kalten Raum und alle Instrumente durchgeführt werden und Lösungen bereit und gekühlt werden im Voraus. Wenn die Temperaturen nicht stabil gehalten werden mehrere Eigenschaften der Zubereitung verloren gehen kann. Mitochondriale Struktur ist sehr frostempfindlich so overfreezing der Suspension (zum Beispiel während der Zentrifugation) ist nicht zulässig, vor allem, wenn das Studium der aktiven Transport wichtig sind. </li><li> Ein wichtiger Parameter ist die Zeit-Dauer des Verfahrens, die Trennung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden und das erhaltene Präparat muss sofort verwendet werden. Deshalb haben chirurgische Instrumente, Lösungen und Appliances im Voraus vorbereitet werden. </li></ul> Materialien und Instrumente Instruments <ol><li> Gerade Betriebssystem Schere, scharfe Spitze </li><li> Gebogene Schere </li><li> Zange </li><li> Petrischale </li><li> Kleine Trichter + Stück Nylon-Filter (vorgewaschen) </li><li> 6 Bechergläser 50 ml </li><li> Zwei Magnetrührer und zwei Eisbäder </li><li> Ein großer Eisbad </li><li> 2 kleine magnetische Stäbe </li><li> Spatel für Pellet Schaben </li><li> Zentrifugenröhrchen </li><li> Latapie Gewebe drücken (mit Knoblauchpresse ersetzt werden) </li><li> Teflon-Glas-Homogenisatoren 20ml und 1-2ml </li><li> Waste Becher </li><li> Eppendorf-Röhrchen für die endgültige mitochondrialen Federung und Proben für die Proteinbestimmung </li><li> Ice Bäder </li></ol> Solutions (berechnet pro 2 Ratten): <ol><li> Waschpuffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Isolation Puffer: 0,3 M Sucrose, 10 mM HEPES (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml BSA (Sigma a6003) (100ml hergestellt aus den Waschpuffer). Rinderserumalbumin durch weniger teure Fettsäure-freien Analoga ersetzt werden. Die gleichen Puffer oder seine isotonische Varianten können als Resuspendieren Puffer verwendet werden. </li><li> Trypsin (Sigma T8003) Lösung: 2.5mg/ml in 1mM HCl (0,5 ml) </li><li> Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml Isolation Puffer </li></ol> Protokoll Das allgemeine Schema des Verfahrens ist in Abb. dargestellt. 1. Herz sollte gekühlt und gewaschen werden in Waschpuffer, ventrikuläre Gewebe herausgeschnitten, zerkleinert und homogenisiert während photolytische Behandlung mit Trypsin. Die Suspension wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und der erhaltene Überstand wird erneut mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert, um zu sammeln Mitochondrien. Abhängig von der geplanten Experimente der Resuspendieren Puffer kann von keinem anderen isotonischen Lösung ersetzt werden. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den britischen beendet &quot;Animals (Scientific Procedures) Act.&quot; durch Genickbruch durch Enthauptung folgten. Es ist notwendig, das Herz sofort nach der Enthauptung des Tieres zu extrahieren, so dass es keine Verzögerung zwischen Tier Kündigung und Herz-Extraktion. Wenn die parallele Isolierung von Mitochondrien wird erwartet, dass die Ratten sollte über Nacht vor dem Experiment gefastet werden. <ol><li> Drei Becher vorbereiten mit 40 ml Waschpuffer. Coole sie in das Eis-Salz-Bad für 3 bis 5 min, bevor Sie den nächsten Schritt. Achten Sie darauf, nicht zu ihnen overfreeze und sofort verwenden kurz nach Wolken aus Eiskristallen zu erscheinen beginnen. </li><li> Öffnen Sie den Brustkorb des enthaupteten Ratte und extrahieren Sie die Herzen. Machen Sie kleine Schnitte und dann sofort in die Herzen der eiskalten Lösung in den ersten Becher. Squeeze des Herzens, Blut zu entfernen und steckte es in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Herz. </li><li> Trocknen Sie die Herzen auf dem Filterpapier. Entfernen Sie alle Fett, geronnenes Blut, Ohrmuscheln und Faszien und Pool der ventrikulären Gewebe. </li><li> Mince der gepoolten Gewebe mit kleinen gebogenen Schere auf der Petrischale auf Eis für etwa 5 min bis die Größe der Partikel ist ca. 1-2 mm. </li><li> Legen Sie die zerkleinerten Gewebes in das Gewebe drücken und passes durch. Seien Sie sich bewusst, dass eine erhebliche Menge des Materials kann in der Presse bleiben so sammeln alle Herzgewebe von den Wänden und Boden der Presse. </li><li> Übertragung des Materials in das Becherglas mit 50 ml Waschpuffer und umrühren. Dann filtern Sie die Suspension durch einen Nylon-Filter. Waschen Sie die zerkleinerten Gewebes auf dem Filter 3 mal mit Waschpuffer und entsorgen das Filtrat. </li><li> Übertragen Sie die gewaschenen Gewebe in 20 ml Waschpuffer und legen Sie sie in das Eisbad auf den Magnetrührer. 0,5 ml Trypsin-Lösung unter ständigem Rühren und den Timer zu starten. Bereiten Sie eine andere Magnetrührer, Eisbad und einem zweiten 50-ml-Becher. </li><li> Am 4. Minute kurz homogenisieren die Aussetzung portionsweise mit einem kleinen locker montiert Glas-Teflon-Homogenisator (10-15ml) mit mehreren und Abschlagen der Suspension zu verteilen. Nach der Homogenisierung Transfer der Suspension in das zweite Becherglas. Wiederholen Sie den Vorgang am 9. Minute, so dass Sie die Homogenisierung der Suspension zweimal durchführen insgesamt. Nach 15 min Inkubation mit 10 ml isolieren Puffer mit Trypsin-Inhibitor und inkubieren für 1 min. </li><li> Filtern Sie die Suspension wieder durch einen Nylon-Filter, und speichern Sie das Filtrat. Sammeln Sie die Partikel-Fraktion auf einem Filter und homogenisieren für 1 min in 15-20 ml Waschpuffer links. </li><li> Kombinieren Sie das Homogenat mit dem Filtrat und Zentrifuge für 15 min bei 600g. </li><li> Sorgfältig Filter der resultierende Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie die Kontamination durch die Pellet-und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G. </li><li> Nach Hochgeschwindigkeitszentrifugation den Überstand verwerfen und spülen Sie das Pellet 2-3 mal mit 1 ml des Puffers Verwerfen der flauschigen weißen Außenrand Schicht. Break up das Pellet mit dem Spatel, sondern um die roten Fleck der Erythrozyten an der Unterseite. Wenn die Blutzellen hat Loos, entfernen Sie die rote Bits aus der Suspension vor der Homogenisierung. </li><li> Das Pellet mit einem kleinen Homogenisator oder alternativ durch vorsichtiges Pipettieren. Die Suspension mit mehr Isolationbuffer und Zentrifuge wieder für 15 min bei 8500G. </li><li> Überstand verwerfen, das Pellet in Resuspendieren Buffer (einem isotonischen Puffer der Wahl) und Zentrifuge wieder. </li><li> Die resultierende braune Pellet enthält gewaschen intakten Mitochondrien. Das Pellet in einem sehr kleinen Volumen von isotonischen Puffer Ihrer Wahl. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Schritt für Schritt Verfahren der Isolierung von Ratten-Herzen Mitochondrien. Top Teil, Stages 1-9: Gewebeaufschluss, Trypsin-Behandlung und Homogenisierung; Unterteil, Stufen 10-15: differentielle Zentrifugation.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

Detaillierte schnelle Protokoll zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung beschrieben. Erhalten Vorbereitung für eine funktionale oder strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Proteom-Studien oder Analysen der mitochondrialen DNA und Lipid-Gehalt verwendet werden. Biophysikalische Untersuchungen von aktiven Transport von Ionen und Stoffwechsel-Zwischenprodukte können auch durchgeführt werden. Es ist möglich, weitere Prozess der mitochondrialen Vorbereitung, um submitochondrialen Partikeln, äußere Membran oder Reinigung einzelnen Komponenten der oxidativen Phosphorylierung zu isolieren. Das beschriebene Verfahren ist eine Modifikation des Standard-Protokoll der Isolation von Jacobus und Saks 1. Die erwartete Rendite des präparierten Mitochondrien beträgt ca. 10-15 mg der mitochondrialen Protein pro Herzens und der Atmung kontrollieren Verhältnis auf Malat / Glutamat für diese Zubereitung variiert zwischen 8 bis 12 mit der staatlichen IV Atmung von rund 0,12 mmol O 2 xmin -1 XMG Protein -1 bei 23 ° C in das Medium mit 0,25 M Saccharose, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM Kaliumphosphat (pH 8,0) mit 150 uM ADP für die Einleitung Staat III Atmung (für die genauen experimentellen Bedingungen und Ergänzungen, siehe Lit. . 2). Besonderes Augenmerk sollte auf einige technische Details vor Beginn der Isolierung Verfahren gegeben werden. Es ist wichtig zu reinigen Polycarbonat oder Polypropylen-Zentrifugenröhrchen verwenden, also Röhren sollten gründlich mit einem sauberen Bürste und heißem Wasser, aber das Waschmittel sollte die Behandlung mit dem Minimum gehalten werden gewaschen werden. Außerdem ist es besser, alle notwendigen Glaswaren und Instrumente in den kalten Raum zu sammeln einen Tag vor der Isolation. Während der Isolation bei der Übertragung von Puffern aus Flaschen zu Bechern, sollte а besonderes Augenmerk auf die Tropfen Eiswasser in die Lösungen zu verhindern. Beim Umgang mit Geweben es sollte betont werden, dass Herz-Extraktion sollte so bald wie möglich, da selbst kurze Zeitverzögerung zwischen Enthauptung des Tieres und Kühlung des Gewebes würde in teilweise abgekoppelt Mitochondrien Ergebnis durchgeführt werden. Schnelle Kühlung und gründliches Waschen der entfernt Herz ist von wesentlicher Bedeutung, um Standard-Vorbereitung, frei von Hämoglobin und Erythrozyten NADase erhalten. Trypsin ist für Binde-Proteine ​​Abbau verwendet werden, um die Anfälligkeit des Gewebes auf Scherkraft Anstieg während der Homogenisierung. Längere Exposition des Gewebes Protease sollte vermieden werden, da es in den Mitochondrien von minderer Qualität führt werden. Nach High-Speed-Zentrifugationen den Wänden der Röhrchen sollten mit Seidenpapier abgewischt werden, um Ablagerungen von Fett Material an den Wänden angesammelt entfernen. Für die endgültige Resuspension ist es besser, ein geringes Volumen des fertigen Puffer zu nutzen, um Verluste zu minimieren der mitochondrialen Funktionen während der Lagerung (150 bis 200 ul des Puffers pro Herz). Für Untersuchungen der Transport von zweiwertigen Kationen keine Chelatbildner vorhanden sein muss in den letzten Vorbereitungen so Mitochondrien sollte mehrmals mit EGTA-freiem Medium gewaschen und verwendet werden, innerhalb der ersten Stunden nach der Trennung.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

Die Funktion der Mitochondrien bei der Erzeugung von zellulären ATP in den Prozess der oxidativen Phosphorylierung wird allgemein anerkannt. In den vergangenen Jahrzehnten gab es bedeutende Fortschritte in unserem Verständnis der Funktionen der Mitochondrien anderes als die Erzeugung von Energie worden. Dazu gehören ihre Rolle bei der Apoptose, als Signalisierung Organellen, Säugetieren und des Alterns sowie deren Beitrag zur Koordination zwischen den Zellstoffwechsel und die Zellproliferation. Unser Verständnis von biologischen Prozessen moduliert durch Mitochondrien ist auf robuste Methoden zur Isolierung und Behandlung von intakten Mitochondrien aus dem Gewebe der Versuchstiere auf. Mitochondrien aus Ratten-Herz ist eine der häufigsten Vorbereitungen für vergangene und aktuelle Studien des Zellstoffwechsels, einschließlich Studien zur Knock-out-Tiere. Hier beschreiben wir eine detaillierte schnelle Methode zur Isolierung von intakten Mitochondrien mit einem hohen Grad der Kopplung. Eine solche Vorbereitung von Ratten-Mitochondrien ist ein hervorragendes Objekt für funktionelle und strukturelle Forschung über zelluläre Bioenergetik, Transport von Biomolekülen, Proteom-Studien und Analysen der mitochondrialen DNA, Proteine ​​und Lipide.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Aufrufe.  University of Manchester. Wir beschreiben а Protokoll für die Isolierung von reinen, stark gekoppelte Ratte-Mitochondrien für funktionelle oder strukturelle Untersuchungen der zellulären Bioenergetik, biophysikalische Messungen, Proteomik oder mitochondriale DNA und Lipiden Analyse.

Serie: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

Die Implantation von Engineered Tissue in der Ratte Herz

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Forschung

Biologie

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Vorbereitung der Rattenschwanzsehnen für Biomechanik und Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Herstellung von Ratten Serum Geeignet für Säugetier Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...