Name: high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

Dieses Projekt wurde teilweise durch einen Zuschuss für National Institutes of Health NIAID (für AJB und LGA, R01 AI076246) unterstützt. Die Salmonella-Mutante Sammlung wurde teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 und R01 AI039557-11 AI075093-01), teilweise von der National Institutes of Health Zuschüsse (für HAP, R21 unterstützt AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Wir danken Steffen Prowollik für Replikaplattierung und Bestätigung der Mutanten in der Sammlung.

1. Murine Makrophagen RAW264.7 Zellkultur <ol><li> Wachsen niedrige Durchgang Nummer murine Makrophagen, RAW264.7 (ATCC ® Nummer, TIB-71) in einem T-75 Zellkulturflasche abgelassen Filterkappe in Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) , 0,5% NaHCO 3 und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren 100x (NEAA) bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Sobald Zellen erreichen eine 60-80% Konfluenz in den Kolben, mit einem Zellschaber, um Zellen zu ernten, und zählen Sie die Zellen in einer Hämazytometer und berechnen die Zellkonzentration. </li><li> Die Zellen und die Zellkonzentration verdünnt in 2,5 x 10 5 / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. Mehrkanalpipetten verwenden, um 200 ul DMEM-Zellkulturmedium, enthaltend 5 × 10 4 Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Zellkulturplatten zu plattieren. </li><li> Platte vier Vertiefungen jeder Salmonella Stamm. Drei getrennte Platten für einen Satz gesetztvon Fresszellen Invasion Assay, und markieren Sie diese mit &quot;Verein&quot;, &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; auf. </li><li> Platzieren der Platten in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C auf, damit die Makrophagen-Zellen auf den Boden der Vertiefungen anzubringen. </li></ol> 2. Herstellung von Salmonellen Wildtyp-und Mutanten <ol><li> Am selben Tag der Aufstellung des Makrophagen RAW264.7 Zellen, nehmen einzelne Kolonien von Wildtyp (WT) Salmonella enterica Serotyp Typhimurium 14028s, DinvA Mutante DphoP Mutante und die gewünschten Test-Mutantenstämme, und Kultur sie in Luria Bertani-( LB) Brühe mit Antibiotika und gegebenenfalls ergänzt. Verwenden jedes Satzes der Phagozyten Invasionsassays zu testen bis 10 Mutantenstämme (DinvA mutierten und mutierten DphoP sind Invasion und intrazelluläre Replikation defekt, beziehungsweise). </li><li> Wachsen die Bakterien für 14 Stunden bei 37 ° C mit sHAKING bei 220 rpm in LB-Medium je 5 ml in 14 ml lose verschlossen Polypropylen in einer Röhre mit rundem Boden. LB-Medium enthält geeigneten Antibiotika, in unserem Fall sind die meisten der Mutanten-Stämme resistent gegen Kanamycin, 50 ug / ml </li><li> Am nächsten Tag, Subkultur jeder der EIN-Kulturen von Salmonella-Stämmen in Klar 5 ml LB-Brühe in einem Verhältnis von 1:50 für weitere 4 h unter Schütteln bei 220 UpM. </li><li> Lesen OD 600-Werte jedes Bakterienkultur auf einem Spektrophotometer, und jede Lese sollte 0,6 bis 1,2 reichen, um Salmonellen Pathogenität Insel-1-Typ-III-Sekretionssystem (SPI-1 TTSS) Genexpression für die Invasion zu optimieren. </li><li> Verwenden der Formel von 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml, um die Bakterienkonzentration zu schätzen, dann verdünnte Bakterien in einer Konzentration von 5 x 10 6 KBE / ml in frischem DMEM-Zellkulturmedium. </li></ol> 3. Invasion Assay in 96-Well-Kulturplatte <ol><li> Entfernen Sie die drei 96-Loch-cell Kulturplatten aus dem CO 2-Inkubator und waschen jeweils auch einmal mit 200 ul 1x PBS-Puffer. </li><li> Nach dem Waschen und vollständige Entfernung von PBS, 200 ul Bakterien in DMEM-Medium (siehe oben) in jedes Well. Dies führt zu 1 x 10 6 Salmonella-Zellen in jede Vertiefung und Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1 beträgt. </li><li> Zentrifugieren der Platten bei 1000 × g in einem verschlossenen Träger für 10 min, dann ersetzen Platten (Zeit Null) in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30 min. Für jeden Stamm, richtet mindestens vier zwei Vertiefungen. </li><li> Nach 30 Minuten, entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und dreimal mit 200 ul 1x PBS auf unassociated Bakterien zu entfernen. </li><li> Nach dem Waschen, speichern Sie die Platte mit &quot;Verein&quot; für die weitere Behandlung gekennzeichnet. Fügen Sie 200 ul DMEM-Medium mit 100 ug / ml Gentamicin in jede Vertiefung der mit &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; markiert Platten, um to töten die extrazelluläre Salmonellen. Bringen Sie die Platten bis 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche Stunde. </li><li> Zu retten und von jedem infizierten Belastung für die Aufzeichnung von Makrophagen-Zellzahl, behandeln den Rest der Brunnen auf dem &quot;Verein&quot; Platte mit 200 ul 1x PBS mit 1% Triton X-100 für 10 min. Die Triton-Lösung Makrophagenzellen lysieren und damit verbundenen Salmonellen. </li><li> Ernte Salmonellen aus jeder Vertiefung und legen Sie sie in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie drei 10-fach serielle Verdünnungen mit 900μl 1x PBS auf den geernteten Proben aus jeder Vertiefung wird Wirbel zwischen jeder Verdünnung durchgeführt. </li><li> Platte der dritten Verdünnung, 10 -3, entweder auf LB (WT) oder LB-Kan (Mutanten)-Platten. Beschriften Sie die Platten mit entsprechenden Salmonella Stamm Name, Verdünnungszahl, Zeitpunkt und Datum. </li><li> Nach Vortexen des dritten Verdünnungsröhrchen, verzichten 10 ul Probe auf der Oberfläche des Agars und Wiederholen funserer Zeit für insgesamt 5 Tropfen. Achten Sie darauf, den Raum der fünf 10 ul Tropfen gleichmäßig auf die Petrischale Platten 7. </li><li> Nach den Tropfen in den Agar einweichen, drehen die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Gönnen Brunnen für die Zählung von Makrophagen mit 150 ul 1xPBS mit 0,25% Trypsin-EDTA für 10 min gespeichert. </li><li> Nach Trypsinierung, Ort Makrophagen in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und behandeln sie mit 50 ul FBS zu Trypsin / EDTA-Lösung zu neutralisieren, färben die Zellen mit 0,4% Trypanblau und Gäste sie unter Anwendung Hämazytometer. </li><li> Wenn die eine Stunde Inkubation abgelaufen ist, entfernen Sie die &quot;Invasion&quot; und &quot;Replikation&quot; Platten aus dem CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot;. </li><li> Speichern Sie die &quot;Invasion&quot; Platte für die weitere Behandlung als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Gib 200 ul DMEM-Medium mit 10 ug / ml Gentamicindie &quot;Replikation&quot; Platte Abstand von extrazellulären Salmonellen in dem Medium zu erhalten. Bringen Sie die Platte auf 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator für eine zusätzliche 22,5 Stunden. </li><li> Am nächsten Tag nehmen Sie die &quot;Replikation&quot; Platte von 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, und waschen jedes sowie &quot;Step 3.4&quot; und behandeln sie als &quot;Schritt 3,6-3,12&quot;. </li><li> Schließlich entfernen Sie die Agar-Platten nach der Inkubation über Nacht im 37 ° C Inkubator und Gäste die Anzahl der Bakterienkolonien. </li><li> Eine gute Verteilung Kolonie sollte zwischen 10 und 100 Kolonien, enthält jede Stelle etwa 2 bis 20 Kolonien, wäre es schwer zu punkten, wenn es mehr als 20 Kolonien auf einem Fleck. Wenn die Zählung zu niedrig oder zu hoch ist, Ausstrich der Probe mit 10-fach höhere oder niedrigere Verdünnungen nach Bedarf. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Berechnen Sie die KBE (Koloniebildung Einheiten pro ml) jeder Platte auf der Basis der BeschichtungVolumen und Verdünnungsfaktor. </li><li> Ermitteln Sie die Anzahl der Salmonellen pro Makrophagen durch die Makrophagen aufgenommen Zellzahl von jedem Stamm. </li><li> Berechnen Sie die geometrischen Mittel der KBE pro Makrophagen aus mindestens drei unabhängigen Experimenten für die Zellverband, Invasion oder Replikation bzw. normalisieren und weiter nach WT für den relativen Wert. </li><li> Analysieren Sie die Daten für die Assoziation, Invasion und Replikation von Student-t-test bzw. indem jeder Stamm WT, und bestimmen Sie die statistische Signifikanz von p-Wert. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

Die Gentamicin-Schutztest wird häufig eingesetzt, um das Eindringen und die Vermehrung von intrazellulären bakteriellen Krankheitserregern im Wirtszelle zu untersuchen, und es ist insbesondere ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung biologischer Pathogene wie Salmonellen, deren Einfall ist die Voraussetzung für die Festlegung Schritt 1 Infektion. Die Standard-Gentamicin-Schutztest bei Salmonella-Forschung wird in 24-Well-Kulturschale 5 implementiert. Obwohl die Verwendung ...

Nontyphoidal Salmonellen sind wichtige Ursachen von Darmerkrankungen in allen Wirbeltieren. Salmonellose beim Menschen ist unter den Top bakterielle lebensmittelbedingten Erkrankungen ein. Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen von Salmonella mit ihrer tierischen Wirte unterstützen wird hauptsächlich durch die Untersuchung von Salmonella enterica-Serotyp typhimurium (STM) in der Gewebekultur und Tiermodellen der Infektion erreicht. Einblicke in STM-Wirt-Interaktionen wird uns helfen, zu verstehen, wie Salmonellen überleben und wachsen in Wirtszellen. Die erste Herausforderung bei der Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist, so viele teilnehmende Faktoren wie möglich von beiden Wirt und Pathogen zu identifizieren, aber diese Bemühungen sind weitgehend durch den erheblichen Schwierigkeiten im Umgang mit zwei unabhängigen komplexen biologischen Systemen gleichzeitig, dh, Host-und Salmonella behindert, unter physiologischen Bedingungen. Zusätzlich ist die große repertOire von Salmonella und Wirtsgene möglicherweise Faktoren in Wirt-Interaktionen beteiligt Codierung erfordern Hochdurchsatz-biologische Plattform, um diese Herausforderung zu bewältigen. Eine modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzkapazität Phänotyp wurde entwickelt, um eine große Gruppe von Genen wahrscheinlich Beteiligung an Salmonellen -host Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Gentamicin-Schutz-Assay wurde im Jahr 1973 2 entwickelt, wurde aber zunächst gründlich von Elsinghorst 1994 3,4 beschrieben. Es wurde nun ein Standard-Werkzeug für die Untersuchung viele intrazelluläre bakterielle Erreger ex vivo, einschließlich Salmonellen 5,6 geworden. Verinnerlicht Bakterien zu vermeiden, die von einigen Antibiotika, wie Gentamicin, die nicht eukaryotischen Zellen eindringen kann 3 getötet. Durch Ausnutzung dieses Phänomens, misst die Gentamicin-Schutz-Assay, das Überleben und das Wachstum von intrazellulären bacterial Krankheitserreger. Drei Ereignisse, die während der Infektion, das heißt zusammen mit eukaryotischen Zellen, Invasion und Replikation können für die intrazelluläre bakterielle Pathogene auf der Basis des Zeitintervalls zwischen der Infektion, Gentamicin-Behandlung und eine weitere Inkubation (1) ausgewertet werden. Eukaryotische Zelllinien eine physiologische Umgebung, die weniger komplex als relevanten Tiermodellen für Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien ist. Die Gentamicin-Schutz-Assay ist eine geeignete Plattform, um STM-Wirt-Interaktionen zu studieren, aber die Standard-Assay in einer 24-Well-Kulturschale hat eine geringe Durchsatzkapazität. Computergestützte Analyse in vivo Datensätze identifiziert 149 Salmonella-Genprodukte, die voraussichtlich mit rund 300 Gast Genprodukte (unveröffentlichte Daten) zu interagieren. Die Standard-Gentamicin-Schutztest hat nicht die Fähigkeit, diese Anzahl von Mutanten effizient Phänotyp. In additIonen, die Gentamicin-Schutz-Assay kann theoretisch die Invasion auch nur eines einzigen Bakterium erkennen. Wegen dieser inhärenten Empfindlichkeit sind die Rohdaten anfällig für technische Abweichungen, wenn zu verschiedenen Zeitpunkten wiederholt. Die internen Kontrollen und die relative Darstellung der Daten nach der Normalisierung sind für sinnvolle Interpretation der Ergebnisse. Angesichts dieser Überlegungen wurde eine modifizierte, standardisierte Gentamicin Protection Assay entwickelt, um Testkapazität erhöhen und die Präzision. Das folgende Protokoll ist eine detaillierte und illustrierte, um die geänderte Gentamicin-Schutz-Assay unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen und die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 durchzuführen. Im Vergleich zur Standard-Protokoll in 24-Well-Kulturschalen hat die modifizierte Protokoll die folgenden Vorteile: 1) unter Verwendung von 96-Well-Kulturschalen können bis zu 10 verschiedene Mutantenstämme phänotypisiert werden einschließlich der internen positiven und negativen Kontrollen mit ausreichender statistischer Power;2) Die Varianz der Ergebnisse wird deutlich reduziert, da die Mutantenstämme sind in der gleichen Kulturschale und zur gleichen Zeit getestet; 3) Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und reduziert Ermüdungserscheinungen. Schließlich Vergleich zu 24-Well-Kulturschalen wurden Bedenken von weniger Wirtszellen pro Well in 96-Well-Kulturschale durch Protokolloptimierung und Standardisierung gerichtet. Zusammenfassend ist die modifizierte, standardisierte Test zur in-vitro-Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen erhöht die Präzision und erreicht Hochdurchsatzleistung bei gleichzeitiger Reduzierung Ermüdung des Bedieners.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Cell culture flask vented filter cap</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-well Cell culture plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solution</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

Salmonella-Arten sind Zoonoseerreger und führenden Ursachen von lebensmittelbedingten Krankheiten bei Mensch und Vieh 1. Das Verständnis der Mechanismen Salmonellen -host Interaktionen zugrunde liegen, sind wichtig, um die molekularen Pathogenese der Salmonellen-Infektion aufzuklären. Die Gentamicin-Schutztest auf Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen Phänotyp angepasst, damit Hochdurchsatz-Screening, um die Rollen der Deletionsmutanten von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium in Wirt-Interaktionen mit RAW 264.7 Makrophagen Maus definieren. Unter diesem Protokoll, die Varianz bei Messungen, verglichen mit dem Standardprotokoll erheblich reduziert, da Wildtyp-und Mutantenstämmen mehrere in der gleichen Kulturschale und gleichzeitig getestet werden. Die Verwendung von Mehrkanalpipetten erhöht den Durchsatz und erhöht die Präzision. Darüber hinaus betrifft die Verwendung weniger ho bezogenenST-Zellen pro Well in 96-Well-Kulturschale angesprochen. Hier wurde das Protokoll des modifizierten in vitro-Assay mit Salmonella Invasion Fresszellen erfolgreich eingesetzt, um 38 Einzel Salmonellen Deletionsmutanten für Verein, Invasion und intrazellulären Replikationsphenotyp. Die in vitro-Phänotypen vorgestellt, von denen einige später bestätigt Phänotypen in vivo in einem Tiermodell zu haben. So wird die modifizierte, standardisierte Test mit Salmonellen Verein, Invasion und Replikation in Makrophagen, die mit Hochdurchsatzleistung konnte im weiteren Sinne verwendet, um Bakterien-Wirt-Interaktionen zu untersuchen Phänotyp.

Siehe repräsentative Ergebnisse (Figur 2), nachdem die Daten auf der Basis des modifizierten phagozytischen Zellinvasionstest aufgetragen. Die Daten sind fünf verschiedene Stämme, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutierten A, B und Mutanten Δ InvG bekannt für die Invasion defekt zu sein, und ΔphoP bekannt für die Replikation 8 defekt zu sein, werden als positive Kontrollen verwendet werden, um die experimentelle Gültigkeit zu überprüfen . In der Tat, in der modifiziert...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.6K Aufrufe.  Texas A&M University.  Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten. 

Serie: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

NF-B-abhängige Luziferase-Aktivierung und Quantifizierung der Genexpression in Salmonellen-infizierten Gewebekulturzellen

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

Source: Sarkar, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57486">Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the macrophage and parasite nuclei.

Ein in vitro Assay zur Quantifizierung des intrazellulären Wachstums von Parasiten in Makrophagen

1. Plating BMMs on Coverslips for Infection 

	Prepare 6-well tissue culture plates by placing four (4) sterile 12 mm glass coverslips (autoclaved and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An Assay to Quantify Cytosolic and Vacuolar Salmonella in Infected Primary Macrophages

Source: Meunier, E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52960">Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to quantify cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium inside bone marrow-derived macrophages using differential permeabilization. The macrophages are infected with a fluorescent protein-expressing Salmonella, which is internalized inside a specialized vacuolar structure called Salmonella-containing vacuole or SCV. A subset of bacteria escape the SCV and enter the cytosol. The cholesterol-rich plasma membrane of macrophages is permeabilized using digitonin, leaving the SCV intact. Upon labeling the cytosolic bacteria with a fluorescently tagged antibody, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria is quantified using fluorescence-activated cell sorting (FACS).

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in