Dieses Protokoll ist nützlich, um Änderungen der NF-kappa-B-Aktivierung in Zellen zu bestimmen, die einen NF-kappa-B-Luziferase-Reporter exemitenden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen Hochdurchsatz von Faktoren oder Bedingungen ermöglicht, die zu Änderungen der NF-kappa-B-Aktivierung führen. NF-kappa-B ist ein Transkriptionsfaktor für eine Vielzahl von zellulären Prozessen.
Eine bekannte Funktion von NF-kappa-B ist die Induktion von Entzündungsreaktionen durch induzieren die Expression von verschiedenen Zytokinen und Chemokinen. Unser Labor interessiert sich besonders für die Induktion von NF-kappa-B, die durch den Erreger Salmonella typhimurium induziert wird. Hier verwenden wir die HeLa-Zelllinie, die mit einem NF-kappa-B-Luziferase-Reporter-Plasmid stabil transfiziert wird.
Andere Bakterien, oder sogar Viren oder chemische Verbindungen, können in dieser Zelllinie verwendet werden, um die Aktivierung von NF-kappa-B zu untersuchen. Andere Zelllinien können auch verwendet werden, wenn Sie ein solches NF-kappa-B Luziferase-Reporter-Plasmid in dieser Zelllinie einführen können. Jemand, der dies zum ersten Mal tut, kann Probleme haben, sterile Technik richtig zu verwenden, die für Zellkultur und bakterielle Arbeit erforderlich ist.
Entfernen Sie einen Tag vor der Zellstimulation die Wachstumsmedien von HeLa 57A-Zellen, die auf etwa 75 % konfluenzgewachsen sind. Waschen Sie Zellen mit einem Milliliter 0,05%Trypsin EDTA. Ersetzen Sie dies durch einen weiteren Milliliter Trypsin EDTA und übertragen Sie den Kolben für fünf Minuten auf einen 37 Grad Celsius Inkubator.
Nachdem die Zellen aus dem Kolben gelöst wurden, setzen Sie sie in 10 Milliliter Wachstumsmedien aus. Kombinieren Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikroliter Trypan blau, Pipette nach oben und unten zu mischen, und übertragen Sie 10 Mikroliter auf eine Zellzähler-Folie. Zählen Sie Zellen in Suspension mit einem Zellzähler, und verwenden Sie Wachstumsmedien, um die Zellen auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 zu den fünf Zellen pro Milliliter in einem 50 Milliliter konischen Rohr zu verdünnen.
Übertragen Sie 250 Mikroliter der Zellsuspension auf jeden Brunnen einer 48-Well-Platte. In regelmäßigen Abständen das konische Rohr kappen und umdrehen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf der Seite, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig in den Brunnen verteilen.
Übertragen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator und lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften und wachsen. Streifen Sie gefrorene Salmonellenbestände auf LB-Agarplatten, um einzelne Kolonien zu produzieren. Übertragen Sie die Platten auf einen Brutkasten, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und ermöglichen Sie das Wachstum über Nacht.
Am nächsten Tag drei Milliliter LB zu sterilen bakteriellen Kulturröhren hinzufügen und den Medien entsprechende Antibiotika hinzufügen. Mit einer sterilen Impfschleife wählen Sie eine einzelne Kolonie aus den gestreiften Bakterienkulturen und berühren Sie die Schleife zu den LB-Medien. Kappen Sie die Rohre nach dem Impfen und entsorgen Sie die Schleife.
Legen Sie die Rohre in einen Schüttel-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 180 U/min eingestellt ist, und lassen Sie die Bakterien dann über Nacht wachsen. Am Morgen, holen Sie über Nacht Bakterienkulturen aus dem Brutkasten. Bereiten Sie Tuben für die Subkultur vor, indem Sie drei Milliliter frischeLB und Antibiotika hinzufügen.
Überträgt 30 Mikroliter der über Nacht bakteriellen Kultur auf die frisch zubereiteten Medien. Legen Sie die Rohre drei Stunden lang in einen schüttelten Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nach der dreistündigen Inkubation einen Milliliter steriler LB-Brühe in eine Plastikküvette geben, um als Rohling zu dienen.
Übertragen Sie 900 Mikroliter LB in die anderen Küvetten, die für die Probenanalyse verwendet werden sollen. Übertragen Sie 100 Mikroliter bakterielle Subkultur in eine Küvette mit 900 MikroliterLB und Pipette mehrmals nach oben und unten zu mischen. Wiederholen Sie dies für jede bakterielle Suspension.
Schalten Sie das Spektralphotometer ein, um die optische Dichte der Bakterienkulturen bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern zu messen. Legen Sie den Rohling in das Spektralphotometer. Beachten Sie die Ausrichtung.
Schließen Sie den Deckel und drücken Sie die leere Taste auf dem Spektralphotometer, um die Hintergrundabsorption zu erhalten. Ersetzen Sie die leere Küvette durch eine Musterküvette in der gleichen Ausrichtung und drücken Sie lesen. Zeichnen Sie die OD600-Werte dieser Beispiele auf.
Multiplizieren Sie den Wert mit 10, um den Verdünnungsfaktor zu berücksichtigen. Verdünnen Sie die Suspension eins bis zehn in einer Küvette und messen Sie die Absorption, die einen Wert von etwa 0,1 ergeben sollte, was in etwa einem Mal 10 der neun KBE pro Milliliter entspricht. In einem neuen Rohr, fügen Sie ein geeignetes Volumen der verdünnten Subkultur zu frischen LB, um eine Suspension von einem mal 10 zu den acht KBE pro Milliliter als Inokulum verwendet werden zu erreichen.
Bereiten Sie serielle Verdünnungen des Inokulums vor, indem Sie 50 Mikroliter bakterielle Suspension in ein Rohr mit 450 Mikroliter sterilen PBS übertragen, bis eine endgültige Verdünnung von ca. 100 KBE pro Milliliter erfolgt. Übertragen Sie 100 Mikroliter der beiden niedrigsten Verdünnungen, 100 und 1000 KBE pro Milliliter, auf zwei LB-Agarplatten und verteilen Sie die Suspension mit einem Zellstreuer, um einzelne Kolonien zu erhalten. Übertragen Sie diese Platten auf einen 37 Grad Celsius Inkubator und inkubieren Sie über Nacht.
Am nächsten Tag zählen Sie die Kolonien und berechnen die bakterielle Konzentration des ursprünglichen Inokulums, um die tatsächliche Inokulumkonzentration zu bestimmen. Am selben Tag, beschriften Sie den Deckel der Platte nach den Infektionsbedingungen, die für jeden Brunnen verwendet werden, mit jeder Bedingung in Dreifacharbeit getan werden. Fügen Sie 10 Mikroliter des Inokulums zu den entsprechenden Brunnen hinzu und fügen Sie 10 Mikroliter steriles LB zu nicht infizierten Kontrollbrunnen hinzu.
Um die Zeit der Infektion zu synchronisieren, legen Sie die Platte in eine Tischzentrifuge und drehen Sie bei 500 mal G für fünf Minuten, um sicherzustellen, dass die Platte ausgeglichen wird. Dann übertragen Sie die infizierten Zellen für eine Stunde in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Legen Sie eine 15 Milliliter konische Röhre mit einem Aliquot von Zellkulturmedien in ein 37 Grad Celsius Wasserbad für den nächsten Schritt.
Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie die 15 Milliliter konische Röhre mit Zellkulturmedien aus dem Wasserbad und wischen Sie das Äußere mit 70% Ethanol ab. Übertragen Sie die Gewebekulturplatten aus dem Inkubator in einen Biosicherheitsschrank. Verwenden Sie sterile Spitzen, um Medien aus den Brunnen zu aspirieren und durch 250 Mikroliter frischer, warmer Zellkulturmedien zu ersetzen.
Bringen Sie die Platten für weitere vier Stunden in den 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius zurück. Danach entfernen Sie die Platten aus dem Kohlendioxid-Inkubator und aspirieren die Medien aus den Brunnen. Für die Luziferase-Analyse, fügen Sie 100 Mikroliter 1X Zelllyse Puffer zu den Brunnen.
Übertragen Sie die Platte in einen negativen 80 Grad Celsius Gefrierschrank und brüten Für mindestens 30 Minuten, um eine effiziente Zelllyse zu gewährleisten. Dann legen Sie die Platte mit gefrorenem Zelllysat auf eine Bank, um aufzutauen, und bereiten Luziferase Substrat Reagenzien nach Herstellerempfehlungen. Lassen Sie luziferase Substratreagenzien auf Raumtemperatur ausdemieren.
Schalten Sie als Nächstes den Plattenleser ein und öffnen Sie das entsprechende Reader-Programm. Stellen Sie die Maschine so ein, dass die Lumineszenz gemessen wird. Übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Zelle lysieren auf einen Brunnen einer opaken 96-Well-Platte.
Mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter des Luziferase-Assay-Reagenzes in jeden Brunnen der opaken Platte geben. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte auf der Seite, um Brunnen zu mischen, und stellen Sie sicher, dass die untere Oberfläche mit Flüssigkeit bedeckt ist. Legen Sie die Platte in einen Plattenleser und initiieren Sie das Lesen.
Kopieren Sie die Lumineszenzwerte in ein Tabellenkalkulationsprogramm und zeichnen Sie die Ergebnisse. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B mit einem NF-kappa-B abhängigen Luziferase-Reporter, der stabil in eine Linie von HeLa-Zellen transfiziert wird. Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment der NF-kappa-B abhängigen Luziferase-Aktivierung und IL6-Genexpression in HeLA 57A-Zellen, die mit den Salmonella typhimurium-Stämmen infiziert sind.
Die Infektion mit dem wilden Stamm SL1344 induzierte ein starkes Luziferasesignal sowohl in der RLU- als auch in der IL6-Expression, das in Zellen, die mit dem sipA sopB sopE2 Triple Mutant infiziert waren, verringert wurde und mit dem sipA sopB sopE2 SopE Vierfachmutant auf Kontrollniveaus reduziert wurde. Achten Sie bei Derserienverdünnungen und Beschichtungen genau darauf. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie ein konsistentes Inokulum über Ihre Stämme haben.
Nach der Identifizierung von Faktoren, die zur NF-kappa-B-Aktivierung und nachgelagerten Veränderungen der mRNA-Expression beitragen, kann die westliche Blot-Technik verwendet werden, um Veränderungen in der Proteinexpression zu identifizieren. Dieses Protokoll hat es unserem Labor ermöglicht, nicht nur die durch Salmonellen induzierte NF-kappa-B-Aktivierung zu bewerten, sondern auch andere Verbindungen und Proteine, die an der NF-kappa-B-Aktivierung beteiligt sind. Salmonella typhimurium ist ein menschlicher Erreger.
Verwenden Sie die richtige PSA bei der Arbeit mit diesen Bakterien.
