Wir möchten Mathias S. Dick, Roland F. Dreier und Sebastian Rühl zur Diskussion zu bestätigen. Diese Arbeit wurde von einer SNF-Förderungsprofessuren PP00P3_139120 / 1 und einer Universität Basel Projektzuschuss ID2153162 zu PB unterstützt

1. Digitonin Assay mit mCherry-exprimierenden Salmonellen (FACS-basierte Analyse) <ol><li> Vorbereiten von Bakterien Hinweis: Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) exprimieren mCherry aus einem Plasmid (pFPV mCherry unter der RPSM Promoter kodiert) in diesem Test verwendet. Bakterielle Phagocytose und Proliferation in dem nicht durch die konstitutive Expression von mCherry verändert 16 (Daten nicht gezeigt). <ol><li> Inokulieren des Stammes 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) und Ampicillin (100 ug / ml, mCherry exprimierenden Vektor) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt. </li></ol></li><li> Plating-Zellen für eine Infektion. <ol><li> Samen Wildtyp- BMDMs in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml von primären Makrophagenmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand (konditioniertes Medium von Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) Herstellung L929-Zellen). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen. Hinzuzufügen Deck den als Kontrollen (Tabelle 1) verwendet Vertiefungen. </li><li> Die Zellen in einem Inkubator über Nacht inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilisierung </td><td colspan="3"> Färbung </td></tr><tr><td></td><td> Deckglas </td><td> Salmonellen </td><td> Digitonin </td><td> Saponin </td><td> Anti-Salmonella </td><td> Anti-Calnexin </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (ohne Permeabilisierung Steuerung) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (komplette Permeabilisierung Steuerung) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (Buntfür PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (gefärbt für PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (gefärbt für PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plating System für Knochenmark-Makrophagen (BMDMs) in einer 24-Well-Format für die spätere Infektion mit Salmonella, Permeabilisierung und Färbung * Je nachdem, ob Protokoll 1 oder Protokoll 2 ist fertig.. <ol start="3"><li> Vorbereitung der Bakterien für die Infektion. <ol><li> Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der Übernacht-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in der L gemesseninear Bereich des Spektrometers. </li><li> Berechnen der Konzentration von Salmonellen pro ml. Einer OD600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien. </li><li> Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li></ol></li><li> Infektion von Zellen mit Salmonella. <ol><li> Entfernen Sie Medium aus BMDMs. 1 ml Medium, um nichtinfizierten Makrophagenkontrolle Vertiefungen (B1-B3, C1-C3). 1 ml der Suspension in die Vertiefungen Salmon A1 - A5, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamicin. <ol><li> Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium mit 0,1 mg / ml Gentamicinan extrazelluläre Bakterien zu töten. Hinzuzufügen Amicin zu allen Vertiefungen, auch nicht infizierten Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen die gleiche Weise behandelt. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Waschen der Zellen. <ol><li> Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen alle Vertiefungen 2x mit 1 ml Klar DMEM (vorgewärmt auf 37 ° C) und ersetzen sie durch Makrophagen-Medium (auf 37 ° C vorgewärmt), das 10 ug / ml &#160; Gentamycin, um das Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien zu verhindern. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper. <ol><li> Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM verdünnte Puffer auf eine Arbeitskonzentrationvon 50 ug / ml Digitonin. Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen-Antikörper gegen FITC (CSA-1-FITC) bei 1/500, anti-Calnexin in KHM gekoppelt an 1/100 oder anti-PDI bei 1/100 Puffer, ergänzt mit 3% BSA. </li></ol></li><li> Zellpermeabilisierung. <ol><li> Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM-Puffer in Vertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in die Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (nach Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). </li></ol></li><li> Primärantikörperfärbung. <ol><li> Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen -FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1 </strong&gt;, Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen 1x mit 1 ml PBS waschen. </li></ol></li><li> Infizierte Zellen (wells A1 - A5): FACS-Analyse <ol><li> Wash Zellen 3x mit PBS und fügen Sie 0,5 ml eiskaltem PBS, das 0,1% Triton. Übertragung auf eine 5 ml FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe zu brechen Zellaggregate. Halten Sie Proben auf Eis. </li><li> Analysieren Sie die Proben eines FACS. Bei Verwendung des voll durchlässig gemacht Kontrollen, setzen das Tor für insgesamt Bakterien auf der Basis nach vorne und Seitenstreuung (FSC / SSC) erste und die mCherry Signal (610 nm ± 20 nm Filter). </li><li> Als nächstes analysieren die FITC-Signal in der gesamten Bakterienpopulation mit Hilfe der vollständig durchlässig gemacht und nicht permeabilisiert Kontrollen, die Tore für cytosolische Bakterien (FITC +, mCherry +) und vakuoläre Bakterien (FITC-, mCherry +) (Abbildung 3) festgelegt. </li><li> Mit setzen die Tore, die Proben analysieren und bestimmen den Anteil der cytosolischen vs.vakuolären Bakterien mittels FlowJo Software gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Nicht infizierte Permeabilisierung Kontrollen (wells B1 - B3, C1 - C3): Mikroskopie <ol><li> Fixierung <ol><li> Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Sekundärantikörperfärbung. <ol><li> Flecken Permeabilisierung Steuerungen für 1 Stunde bei RT mit einem geeigneten sekundären Antikörper an Fluorophoren in PBS gekoppelt ergänzt mit 0,1% Saponin und 3% BSA vollständig permeabilisieren Zellen. </li><li> Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Mikroskopie-Analyse. <ol><li> Analysieren Sie die Deckgläser mit den Kontrollen in einem 40X oder 63X Vergrößerung mit einem konfokalen fluoFluoreszenz Mikroskop. Wenn die Permeabilisierung gearbeitet hat, sollte es keine Färbung für nicht permeabilisierten Zellen Calnexin Färbung sowohl digitonin- und Saponin-permeabilisierten Zellen und PDI Anfärben nur für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4) ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonin Assay mit unbeschriftet Salmonellen (Mikroskopie-basierte Analyse) <ol><li> Vorbereiten von Bakterien, die für O / N Kulturen. <ol><li> Impfen unmarkierten Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt. </li><li> Plating-Zellen für eine Infektion. <ol><li> Samen BMDMs in einer 24 Well-Platte mit sterilen Glasdeckgläschen in einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml Makrophagen-Medium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, de-komplementiert, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen. </li><li> Die Zellen O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Bakterien für die Infektion. <ol><li> Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der O / N-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in dem linearen Bereich des Spektrophotometer gemessen. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration von Salmonellen pro Milliliter. Eine OD 600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien. </li><li> Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li></ol></li><li> Infektion von Zellen mit Salmonella. <ol&gt; <li> Entfernen Sie Medium aus allen Vertiefungen. 1 ml der Klar Makrophagen-Medium nicht infizierten Kontrollvertiefungen (B1 - B3, C1 - C3). 1 ml der Suspension in die Vertiefungen Salmon A1 - A5, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamycin. <ol><li> Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium, das 1 mg / ml Gentamycin auf extrazelluläre Bakterien zu allen Vertiefungen zu töten. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Waschen der Zellen. <ol><li> Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen Sie jedes Well 3x mit 1 ml frischem Makrophagen-Medium, das 10 ug / ml Gentamicin, um zu verhindern,Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper. <ol><li> Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM Puffer verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 50 ug / ml Digitonin. </li><li> Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-Calnexin auf 1/100 oder anti-PDI auf 1/100 in KHM Puffer, ergänzt mit 3% BSA (siehe Materialtabelle für Antikörperkonzentration). </li></ol></li><li> Zellpermeabilisierung. <ol><li> Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM BufferVertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (gemäß Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). </li></ol></li><li> Primärantikörperfärbung. <ol><li> Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen CSA1-FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 2, Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. Waschen 3x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> GesamtSalmonella-Färbung der infizierten Proben. <ol><li> Waschdeckgläser 3x mit PBS mit 0,1% Saponin / 3% BSA und Inkubation der Proben mit einem Anti CSA1-Antikörper (Ziegen-anti-CSA1, 0,1 ug / ml, arbeitet Maus-anti-LPS als auch 0,1 ug / ml) 1 h bei RT in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA. </li><li> Waschen 3x in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA. Ihre Proben inkubieren mit einem sekundären anti-Ziege-Antikörper gegen Fluorophor der Wahl in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA für 30 min bei RT im Dunkeln gekoppelt. </li><li> Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Mikroskopie-Analyse. <ol><li> Erwerben Sie Daten mit einem konfokalen Mikroskop durch Zählen cytosolische Salmonellen (Salmonella anti -FITC positiv) und insgesamt Salmonellen (Doppel positive) (Abbildung 5). Permeabilisierung Kontrollen sollten zeigen: keine Färbung für nicht-permeabilisierten Zellen, Calnexin sTaining für Digitonin-permeabilisierten Zellen und PDI Färbung für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4). Wells A4 und A5 werden als interne Kontrollen für die Salmonellen-Färbung zu dienen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Differential Permeabilisierung ist ein einfaches und robustes Verfahren zu analysieren und zu quantifizieren, die subzelluläre Verteilung von bakteriellen Krankheitserregern zwischen vakuolären Fächern und Cytosol. Das gleiche Assay wurde erfolgreich mit Bakterien wie Francis novicida 2,4 und Shigella flexneri 12 verwendet. Da jedoch viele intrazelluläre Pathogen zu verändern oder die Host-endomembrane Strukturen ändern, wird die Robustheit der Digitonin Permeabilisierung ha...

Intrazelluläre bakterielle Pathogene replizieren entweder direkt in der Wirtszelle Zytosol oder in spezialisierten Vakuolen-Kammer 1. Während der Anfangsphase der Infektion am meisten Pathogene erhalten entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Zellen (Makrophagen) oder aktiv für ihre eigene Aufnahme in nicht-phagozytische Zellen internalisiert. In Phagozyten, Sicherungen Phagosom normalerweise mit Lysosomen, um einen Abbauraum, in dem die phagozytierten Partikel verdaut werden zu bilden. Fach cytosolischen Bakterien wie Francis novicida oder Shigella flexneri, Flucht phagosomalen Abbau durch Induktion der Bruch der Phagosomen und anschließend in das Cytosol 2,3 entkommen. Dies erfordert virulenzassoziierten Mechanismus wie dem Francis Pathogenitätsinsel (FPI) oder der Shigella flexneri T3SS, die Effektor-Proteine, die Vakuole Bruch 2-4 fördern injiziert. Die Wirtszelle Cytosol Funktioneneine Anzahl von konservierten pattern recognition receptors, die normalerweise erkennen das Vorhandensein von Krankheitserregern und induzieren angeborenen Immunsignal 5. Zusätzlich xenophagy, ein antimikrobielles Form autophagy können Bakterien, die in das Cytosol eintreten verschlechtern. Cytosolische Bakterien sind in der Regel gut geeignet, um stumpf oder Umgehung Antworten mit unterschiedlichen Strategien. Zum Beispiel Francis modifiziert seine LPS zu Hosterkennung zu vermeiden und Shigella verhindert Autophagie Rekrutierung mit sezerniert Effektorproteinen 6,7. Eine weitere Strategie, um den lysosomalen Abbau entweichen durch den Modell vakuolären Pathogen Salmonella enterica Serovar Typhimurium eingesetzt, danach wie Salmonella typhimurium bezeichnet. Salmonellen benutzt eine T3SS Effektoren, die die anfängliche phagosome in seine intrazelluläre Nische umzu einzuspritzen, Salmonella -enthaltende Vakuole (SCV) 8,9. Kontinuierliche Manipulation von Host Wege istnotwendig, diese Vakuole durch Rekrutierung Lipide und andere Nährstoffe zur Vakuole zu halten. In der Tat, eine Sifa Mutante von Salmonella nicht an vakuolären Stabilität zu gewährleisten, und tritt in das Cytosol der Wirtszellen innerhalb von Stunden nach der Infektion, die Aktivierung der angeborenen Immunwege und Autophagie Rekrutierung 8 Ergebnisse. Vakuolären Entweichen von Salmon hängt vom Zelltyp abhängig, dass Studien ist, und mehrere Berichte haben gezeigt, dass in den Epithelzellen auch WT Salmon die SCV und hyperreplicate im Cytosol 10 entkommen. Jüngste Berichte zeigen, dass die angeborene Immun Nachweis von Vakuolen Erreger hängt auch von der Fähigkeit der Aufnahme zu erkennen und zu destabilisieren erregerhaltigen Vakuolen (PCV) 11-14. Da sowohl der Host oder Bakterien Genotyp kann die Verteilung der intrazellulären Bakterien zwischen vakuolären und Cytosol zu beeinflussen, ist es notwendig, die Anzahl der vakuolären vs. quantifizierencytosolischen Bakterien. Da in den meisten Versuchsaufbauten Wirtszellen werden mit mehr als einem Bakterium infiziert, und anschließend kann einige Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Hafen wird eine Technik benötigt, die Quantifizierung auf der Ebene der einzelnen Bakterien ermöglicht. Differential Permeabilisierung (auch als phagosomalen-Schutz-Assay bekannt) bietet diese Entschließung 2,4,10,12. Der Test basiert auf selektive Permeabilisierung der Plasmamembran Wirtszelle mit dem Detergens Digitonin, die vakuoläre Membranen intakt lässt und ermöglicht somit die selektive Anfärbung von zytosolischen Bakterien mit Antikörpern. Im Folgenden sollen zwei Protokolle für die Quantifizierung von cytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium durch Differential Permeabilisierung. Das Prinzip dieses Verfahrens ist in Figur 1 beschrieben: Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) mit stationärer Phase mCherry exprimierenden Salmonellen infiziert. Stationäre Phase Salmonellen brauchen to verwendet werden, weil sie die Expression des SPI-1 T3SS, deren Aktivität die ansonsten von der NLRC4 Inflammasoms erkannt und veran schnellen Zelltod (pyroptosis) des BMDMs 15 herunterregulieren. Nach der Infektion Zellen werden gewaschen und mit 50 ug / ml Digitonin für 1 Minute behandelt. Zellen werden sofort wieder gewaschen und mit Anti-Salmonella-Antikörper an FITC gekoppelt, um Bakterien, die mit Zugang zum Cytosol zu markieren inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt Zellen lysiert und der Prozentsatz der mCherry + (vakuoläre) und FITC + / mCherry + (cytosolische) Bakterien durch FACS bestimmt. Wir zusätzlich eine Anpassung der Methode, die verwendet werden können, wenn keine fluoreszierende Protein exprimierenden Stämme sind (Abbildung 2). Zusätzliche Schritte werden nach der Markierung mit FITC bei denen Zellen fixiert und permeabilisiert vollständig eingeführt. Danach alle Bakterien mit anti Salmonellen-Antikörpern und entsprechenden Sekundärantikörper gefärbt. DetReflexion wird dann durch Mikroskopie anstelle von FACS-Analyse durchgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger können im Cytosol oder in spezialisierten erregerhaltigen Vakuolen (PCV) zu replizieren. Um das Cytosol zu erreichen, Bakterien wie Shigella flexneri und Francis novicida müssen den Bruch der phagosome induzieren. Im Gegensatz dazu repliziert Salmonella typhimurium in einer Vakuole Fach, wie Salmonellen enthaltenden Vakuolen (SCV) bekannt. Jedoch bestimmte Mutanten von Salmonella nicht zu SCV Integrität zu erhalten und somit in das Cytosol freigesetzt. Der Prozentsatz der cytosolischen vs. vakuolären Bakterien auf der Ebene von einzelnen Bakterien können durch differentielle Permeabilisierung gemessen werden, die auch als Phagosomen-Schutzassay bekannt. Der Ansatz nutzt die Eigenschaft des Waschmittels Digitonin, um selektiv binden Cholesterin. Da die Plasmamembran enthält mehr Cholesterin als andere zelluläre Membranen kann Digitonin zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, während die intrazelluläre Membranen werdenintakt. Kurz gesagt, nach einer Infektion mit dem Pathogen ein fluoreszierendes Markerprotein (zB mCherry unter anderem) exprimieren, wird die Plasmamembran der Wirtszellen mit einer kurzen Inkubation in Digitonin enthaltenden Puffer permeabilisiert. Die Zellen werden dann gewaschen und inkubiert mit einem primären Antikörper (mit einem Fluorophor gewählt gekoppelt) gegen das Bakterium der Wahl gerichtet (zB Antisalmon -FITC) und erneut gewaschen. Wenn unmarkierte Bakterien verwendet werden, kann ein zusätzlicher Schritt durchgeführt, in dem alle Membranen werden permeabilisiert und alle Bakterien, die mit einem entsprechenden Antikörper gefärbt. Nach der Färbung kann der Prozentsatz der Vakuole und cytosolische Bakterien durch FACS oder Mikroskopie durch Zählen einfach oder doppelt positive Ereignisse quantifiziert werden. Hier bieten wir experimentelle Details für den Einsatz dieser Technik mit dem Bakterium Salmonella typhimurium. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, dass im Gegensatz zu anderen Assays, bietet es eine Quantifizierung auf der Ebene einzelner bacteria stellt die genaue Anzahl der cytosolischen und vakuolären Bakterien in einer gegebenen Zelle, und wenn durch Mikroskopie analysiert.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Schaltpläne der Digitonin Assay in Protokoll 1 und Protokoll 2, die die kritische Schritte in dem Protokoll und die erzielten Ergebnisse beschrieben. Abbildung 3 zeigt typische FACS Ergebnisse. Positive und negative Kontrollen werden verwendet, um die Tore für mCherry + / FITC- Bakterien (Salmonellen Vakuolen) und mCherry + / FITC + Bakterien (Salmonellen cytosolische) eingestellt. Basierend auf diesen Toren der Anteil der cytosolis...

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Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K Aufrufe.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Serie: Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Die Messung der cytosolischen Ca 2 + In Isolated Kontraktile Lymphgefäße

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Phänotypische Charakterisierung von Makrophagen aus Rattenniere mittels Durchflusszytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...