Mit diesem Sporozoit-Reinigungs- und Mikroinjektionsverfahren kann im Wesentlichen jede Wirtsmikrobe in jedem gewebeabgeleiteten Organsystem untersucht werden. Mit dieser Technik können wir die Menge an reinen Sporozoiten kontrollieren, die in das organoide Lumen oder die apikale Seite des Organoids injiziert werden. Um C.parvum sporozoite zu reinigen, übertragen Sie die Oozyste in ein 15-Milliliter-Rohr und suspendieren Sie die Zellen um ein mal 10 bis zur siebten Oozyste pro Milliliter-Excystation mittlere Konzentration.
Nach 60 bis 90 Minuten bei 37 Grad Celsius 14 Milliliter einer geeigneten Waschlösung mit den Oozysten mischen und die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig, um zu vermeiden, Oozysten zu verlieren und setzen Sie das sporozoische Pellet dreimal 10 bis zur siebten Oozyste pro ein bis zwei Milliliter DMEM-Konzentration wieder aus. Um alle verbleibenden Oozysten und Schalen zu entfernen, legen Sie einen 10-Milliliter-Spritzenlauf mit einem 47-Milliliter-Filterhaltergerät, das mit einem Drei-Mikrometer-Porenfilter in Porengröße ausgestattet ist, in ein 15-Milliliter-Rohr bei vier Grad Celsius.
7,5 Milliliter der Sporozoitsuspension in die Filterbaugruppe geben. Wenn das gesamte Volumen durch die Schwerkraft durch das Sieb gegangen ist, waschen Sie alle verbleibenden Zellen durch das Sieb mit weiteren 7,5 Milliliter DMEM. Wenn die gesamte Wäsche durch das Sieb gegangen ist, sammeln Sie die gefilterte Sporozoitsuspension durch Zentrifugation für 10 Minuten und beschriften Sie das Pellet in 50 bis 100 Mikroliter eines geeigneten organoiden Kulturmediums, ergänzt mit 0,05% schnellem grünen Farbstoff, und L-Glutathion, Betain, L-Cystein, Linolsäure und Taurin, die den reduzierenden Puffer enthalten.
Um die Parasiten in die apikale Seite eines 3D-Organoids zu mikroinjizieren, verwenden Sie zunächst einen Mikropipette-Puller, um Glasinjektionskapillaren vorzubereiten. Verwenden Sie Zangen, um die Spitze der Kapillare auf einen Durchmesser von neun bis 12 Mikrometern zu schneiden, um einen einfachen Fluss von Sporozoiten oder Oozysten zu ermöglichen, wenn Sie Oozysten direkt injizieren möchten, und verwenden Sie Mikroladerspitzen, um jede Kapillare mit einem schnellen grünen Farbstoff zu füllen, der als Oozyste oder Sporozoitsuspension gekennzeichnet ist. Dann laden Sie die erste sporozoitgefüllte Kapillare in einen Mikroinjektor und verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop mit einer 5-fachen Vergrößerung und einem konstanten Druck, um 100 bis 200 Nanoliter der Suspension in jedes Organoid zu mikroinjizieren.
Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von etwa 70 bis 80% der Oozysten. Daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozystenschalen durch eine Drei-Mikrometer-Filtration herauszufiltern. Entfernen Sie fast 100% der nicht exzysierten Oozysten.
Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen Farbstoffs zur Injektion aller Organoide bei und ermöglicht die Visualisierung der injizierten Organoide für mindestens 24 Stunden nach der Injektion. Obwohl es sich um eine gut praktizierte Methode handelt, kann die Rasterelektronenmikroskopie verwendet werden, um sicherzustellen, dass der Excystationsprozess die Sporozoiten oder die Oozysten nicht beschädigt hat. Die Injektion gleicher Mengen von Oozysten in das organoide Lumen kann durch einfache mikroskopische Bildgebung visuell bestätigt werden.
Immunfluoreszenz-Assays können auch verwendet werden, um die Arten von Zellen zu erforschen, die mit Cryptosporidium infiziert sind. Nachdem die differenzierten Organoide fünf Tage lang infiziert wurden, kann das Vorhandensein von Sporozoiten in den Oozysten bestätigt werden, indem ein Teil der Oozysten auf einen Klebeschlitten ausgetrocknet, die Oozysten mit Methanol fixiert und DAPI-Färbung mit einem geeigneten oozystenspezifischen Antikörper kombiniert wird. Für maximale Ergebnisse, verwenden Sie frische Oozysten, verwenden Sie die gleiche Kapillare für alle Injektionen, und ändern Sie die Medien jeden Tag nach der Injektion.
Mit dieser Technik beginnen verschiedene Labore nun, Organoide zu verwenden, um Wirts-Mikroben-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir untersuchen Kommensale sowie andere Krankheitserreger in ähnlichen organoiden Mikrokulturen. Da Cryptosporidium ein menschlicher Parasit ist, ist es wichtig, diese Experimente gemäß den Sicherheitsvorschriften der Stufe 2 durchzuführen.
