Unterstützt durch das Institut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant Lymphopoese &#39;), der REVIVE Zukunftsinvestitionsprogramm und &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Ethics Hinweise: Alle Experimente wurden nach dem Pasteur-Institut Ethik-Charta, von der Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt durchgeführt und an die EU-Richtlinien. Ein Manipulator mit Training am Kleintier-Chirurgie, von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft zertifiziert, führt alle chirurgischen Eingriffen. HINWEIS: Siehe Anhang in Tabelle 1, die das 5-Stufen-Plan Verfahren. 1. Auswahl der Embryonen <ol><li> Verwenden Sie 36 C57BL / 6 CD45.2 Frauen, 12 Frauen CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 Männer und 12 C57BL / 6 CD45.2 Männer. Überschreiten der Weibchen mit entweder männlich Genotyp erzeugen Embryonen CD45.1 / 2 und CD45.1 als Quelle von TSP oder CD45.2 als Quelle des Empfängers Thymus Keulen verwendet. Haus alle Männer einzeln. </li><li> Embryonen für E18 TSP Isolation zu erhalten, setzen Sie 2 Hündinnen in einem Käfig mit einem Männchen CD45.1 um 6 Uhr, 21 Tage vor dem Pfropfen Experiment. Prüfen Sie das Vorhandensein einer vaginalen Stecker am nächsten Tag, vor Mittag. Sepabewerten die eingesteckt Weibchen. </li><li> Um E14 Embryonen zu erhalten, die von TSP besiedelt werden, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern CD45.2, 17 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li><li> Embryonen zu E13 TSP isolieren zu erhalten, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern C57BL / 6 CD45.1, 16 Tage vor dem Pfropfen Experiment. </li></ol> 2. Dissection des Embryos unter einem Horizontal Laminar Flow Hood Anmerkung: Zwei Tage vor der Transplantation Experiments. <ol><li> Opfern, die schwangeren Frauen durch Genickbruch oder durch fortschreitende Verwaltung von CO 2 -Gas während mindestens 5 min, in einem geschlossenen Raum zu sättigen. Achten Sie darauf, den Tod durch endgültige Festnahme von Herz-Kreislauf-Atembewegungen. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Längsschnitt in der Haut an der Mittellinie Bauch und öffnen Sie sie durch Ziehen der Haut auseinander. Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und Schere, ohne den Verdauungstrakt. Ziehen Sie das gespaltene uteruns und trennen es von der Vagina mit der Schere. </li><li> Legen Sie die Gebärmutter in einem 90 x 15 mm Petrischale mit 40-50 ml DPBS und schneiden quer zwischen jedem Embryo decidua. </li><li> Mit dem Paar von feinen Spitze Schere und einer feinen Pinzette entfernen Sie die Muskelmembran der Gebärmutter, nehmen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Plazenta und der Dottersack, und entfernen Sie die amnios, die Beibehaltung ist die Embryonen. </li><li> Zeigen die Embryonen in einer Petrischale 90 x 15 mm enthält HBSS + 1% fötales Kälberserum (FCS). Für Embryonen älter als E15, entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere vor jeder weiteren Präparation. </li></ol> 3. Isolierung des Thymus <ol><li> Unter der binokularen Vergrößerungslinse, setzen Sie den Embryo, liegend in Rückenlage (ventral), auf einem nassen Gaze Betten. </li><li> Legen Sie eine Pinzette in Längsrichtung entlang der Knorpel des Brustbeins, kneifen und öffnen Sie die Brust-Netz. Mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Brustwand zur Seite, um die t visualisierenhymic Nocken an jeder Seite der Luftröhre. </li><li> Sorgfältig halten jeder Lappen von unterhalb Kneifen mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolieren Sie die Lappen und entfernen umgebende Bindegewebe mit zwei 1 ml-Spritzen + 26 G ⅜ &quot;Nadeln, ohne Beschädigung der Kapsel. </li><li> Waschen der Lappen in 3 ml HBSS + 1% FCS, um Blutzellen zu eliminieren. Hinweis: Vor dem E15 sind Thymus Nocken an jeder Seite der Luftröhre und später Sicherung in der Mitte angeordnet, um eine bi-lobar Organ bilden. </li></ol> 4. Zellsuspensionen <ol><li> Necken neben die Lappen unter der binokularen Vergrößerungslinse, mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen montiert, in HBSS + 1% FCS. Filtern der Zellsuspension durch ein Nylonnetz. </li></ol> 5. Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Zellsortierung HINWEIS: Alle Antikörper werden zuvor titriert, um eine optimale Definition der Bevölkerung (die titrat erhaltenIon kann mit dem Antikörper Charge variieren). <ol><li> Thymozyten (E13 oder E18) für 15-30 min Inkubation bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l eines Cocktails von biotinyliertem Antikörper an Linie positive Zellen zu färben (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Abzuwaschen Überschuss an Antikörpern Spin-Down der Röhrchen mit 4 ml HBSS + 1% FCS bei 280 g für 7 min, Beseitigung des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in frischem HBSS + 1% FCS. Wiederholen Sie die Zentrifugation. </li><li> E18 Biotin-markierten Zellen mit Streptavidin-Microbeads inkubiere 15 Minuten bei 4 ° C und wäscht die Zellen zweimal in HBSS 1% FCS. Wieder die Zellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. Esten E13 Thymozyten Linie negativ und daher nicht MACS Anreicherung vor der Zellsortierung benötigen. </li><li> Leiten die Zellen auf dem LS-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn alle die Zellsuspension eingegeben die Säule 2 ml HBSS + 1% FCS. Wiederherstellen der4 ml der Säule durchfließen und Zentrifuge die Zellen für 7 min bei 280 x g. </li><li> Re-suspendieren des Pellets entweder abgereichertes E18 oder E13 gesamten Thymozyten in 50 ul TSP Antikörper mix (anti-CD117 APC, Anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24-FITC, anti-CD44 APCCy7 und Streptavidin Pacific Blue ) und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden mit 4 ml HBSS + 1% FCS und Wieder die Zellen in 1 ml HBSS + 1% FCS mit Propidiumiodid. </li><li> Sortieren Sie die TSPs Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 CD127 niedrigen + Zellen in einem FACS (mit 4-Laser) auf eine 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul Vollmedium + 20% FCS. Tor zunächst die Zellen entsprechend ihrer Größe und Granularität auf der FSC und SSC-Kanäle. Eliminieren abgestorbene Zellen (Färbung mit Propidiumjodid), Gate-out Dubletten und Ergebnis der Fluoreszenz in exponentiellen Skalen. Rund 100 oder 600 FDA kann von einem E13 oder E18 ein Thymus, JEWEILIGEN erhältlichEly. </li></ol> 6. Colonization von E14 Thymic Lobes mit Vorläufern: Hanging-Drop-Technik <ol><li> Bestrahlen (30 Grays = 30 Gy) E14 Thymus Lappen aus CD45.2 Embryonen, 3 Stunden, bevor Kultur. HINWEIS: E14 oder E15 Thymus Lappen wurden erfolgreich als Empfänger der T-Zell-Vorläuferzellen verwendet. Verwendung Empfänger Thymus Lappen später Schwangerschaftstagen führt zu vorzeitigem Nekrose aufgrund der größeren Größe der Orgel während Thymus-Lappen in früheren Schwangerschafts Tagen entwickeln schlecht, wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung der Epithelzellen. </li><li> Zentrifuge nach FDA und wieder die Zellen in Kulturmedium (OPTI-MEM komplettes Medium mit 10% FCS, Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und 2β-Mercaptoethanol (50 uM)), so daß 35 ul enthalten 500 TSP. </li><li> Legen Sie eine 35 ul Tropfen Zellsuspension jedes zweite Well einer 60 gut Terasaki Platte. HINWEIS: 35 ul Tropfen können fusionieren, wenn sie in zusammenhängende Vertiefungen gegeben werden. </li><li> Legen Sie einen Lappen auf der bestrahlten Oberfläche jeder Tropfen. Schließen Sie das Terasaki Platte und drehen Sie die Platte auf den Kopf die Zellen des apikalen Pol der Tropfen durch die Schwerkraft erreichen zu lassen. </li><li> Schlagen Sie vorsichtig die Oberseite der umgedrehten Platte die Lappen zu zwingen, sich an der apikalen Rand des Drop verschieben. Inkubieren des invertierten Terasaki Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2. Nach der Kolonisierung entweder Kultur E14 Thymi in FTOC 7 oder Transplantat unter die Nierenkapsel eines Empfänger erwachsenen Maus 8. </li></ol> 7. Fetal Thymic Organ Culture <ol><li> Zeigen 3 ml Vollmedium auf einer 35 mm Petrischale. Ein isoporösen Membranfilter schwimmend auf dem Medium. Platzieren Sie die rekonstituierte Lappen am Rand der Membran mit einer Pinzette (nicht mehr als 8 Keulen auf einer Membran). </li><li> Legen Sie die Petrischalen mit den Thymus-Lappen in einem 90 mm-Petrischale, zusammen mit einem 35-mm-Schale, ohne Deckel, mit 2 ml water, um eine optimale Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Inkubiere 12 Tage bei 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. Grafts unter die Nierenkapsel unter sterilen Bedingungen HINWEIS: Die Nierenparenchyms durch Ausbilden einer Kapsel Bindegewebe umgeben. Der Teilkapsel Region ist besonders reich an Blut- und Lymphgefäße, wodurch ein geeignetes Umfeld für die Entwicklung von Transplantaten (zB Thymus Lappen, Langerhans-Inseln oder Neugeborenen Herzen). Transplantate werden normalerweise auf der linken Niere gemacht, weil sie leichter zugänglich als die rechte Niere ist. CD3 - / - männliche Mäuse wurden als Empfänger wodurch Transplantat-Wirt-Reaktion aufgrund Nebenhistokompatibilitätsantigene auf dem Y-Chromosom verbunden, weil die Geschlechtsbestimmung vor E15 ist nicht leicht getan verwendet. <ol><li> Sterilisieren der Instrumente und tragen sterile Handschuhe an der Operation. Betäuben der Maus durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml in PBS verdünnt (50 bis 100 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht), unter Verwendung einer 1 ml-Spritze. Stellen Sie sicher, Anästhesie, indem fehlende Inter Reflexe. Geben Sie einen Tropfen Hydro Optimune Gel auf jedes Auge bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Die Lösung sollte aus dem Stegreif vorbereitet und erwärmt bei Raumtemperatur vor der Injektion werden. Die Betäubung Dauer von mindestens 20 min. Der Grad der Anästhesie sollte entlang der Operation kontrolliert werden. Die Anästhesie kann durch intraperitoneale Injektion von halbe Dosis alle 20 Minuten verlängert werden. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, unter einer horizontalen Lamina-Flow-Haube. Sterilisation des Operationsfeldes mit 70% Ethanol und 10% Iodid dermic Lösung. Mit einem Zangenteil die Maus Haare entlang eines 2 cm Länge direkt über dem Gelenk der Hinterhand. Rasieren Sie die OP-Bereich. </li><li> Mit einem Skalpell, einen Einschnitt 1,5 cm Länge der ersten, der Hautgewebe, dann mit einer Schere das Muskelgewebe. Anwenden eines leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, Die die Niere aus der Bauchhöhle zwingen wird. </li><li> Bewerben Kochsalzlösung mit einem Baumwollknospe, die Nieren feucht zu halten. Wenn Sie Schwierigkeiten bei der Freilegung der Orgel haben, verwenden Sie eine Flachzange, um die umliegende Gewebe Adipozyten, auf die die Niere angeschlossen ziehen. Pflegen Sie die Nieren aus dem retroperitonealen Hohlraum von einem Wattestäbchen unter der Orgel platziert. </li><li> Mit zwei feinen Pinzette, machen Sie eine 2-3 mm Loch in der Kapsel (berühren Sie nicht die Parenchym um Blutungen zu verhindern). Während des gesamten chirurgischen Eingriffs halten die freiliegenden Nierenkapsel kontinuierlich befeuchtet. </li><li> Setzen Sie sorgfältig die Lappen unter die Nierenkapsel, durch die Aufrechterhaltung der Wand der Kapsel geöffnet und schieben Sie das Transplantat unter der Kapsel zum Rand Pol. Platzieren Sie bis zu 6 Keulen pro Niere. </li><li> Ersetzen Sie die Niere in der retro-Bauchhöhle. Naht der Muskel Aponeurosen, dann die Haut mit einzelnen Chirurgen Knoten. Befeuchten Sie die Wunde mit 10% Iodid Povidonlösung. Platzieren Sie die Maus auf einer beheizten pad bei 37 ° C. </li><li> Umfrage der transplantierten Maus bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie durch Kontrolle der Herz-, Atemwegs- und Whisker-Bewegungen, Schleimhaut-Farben bis zur vollständigen Rückgewinnung von Selbst gesehen enthaltenen Bewegungen. HINWEIS: Wir empfehlen Injektion von schmerzstillende Lösung (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra Muskel direkt nach der Operation und die 2 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu verhindern. </li><li> Halten Sie das betrieben Tier isoliert, bis vollständig erholt. Untersuchen Sie jeden zweiten Tag die Stiche der Wunde zu überprüfen und zu verhindern Infektion. Nie beobachtet Wundinfektion nach diesem Verfahren. HINWEIS: wöchentliche Analyse von peripheren Blutzellen aus dem CD3 - / - Mäuse aufgepfropft uns erlauben, die Thymus-abgeleiteten Populationen entweder E13 oder E18-Vorläufern unter Verwendung der CD45 allotypische Marker und T-Zelllinie spezifische Antikörper (Abbildung 3) entstand detektieren. </li></ol> 9. Analyse des TSP Nachkommen mittels Durchflusszytometrie <ol><li&gt; Tease die FTOCs individuell auf Einzelzellsuspensionen (siehe Protokoll Abschnitt 4) zu erhalten. </li><li> Stain Zellsuspensionen aus einzelnen Lappen mit einem Antikörper Mischung, die Antikörper, die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 und inkubieren, wie in Abschnitt 5 beschrieben. </li><li> Wieder die Zellen in HBSS + 1% FCS + Propidiumiodid und in einem Strömungs analysieren Zytometer (siehe Ergebnisse in Figur 2). </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors.">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+thymus+organ+culture.">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. 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P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T/NK+progenitor+in+murine+fetal+liver.">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li><li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene.">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC 13, die beide eine ...

T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) 1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen 3 umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung 4 erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) 5. Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 - CD8 - doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) und DN4 (CD25 - CD44 -) - DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 + CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 + oder CD8 + T-Zellen zu reifen Fach. Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential 6 verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin -), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) 7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1. Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert 8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung 9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung 10 hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR + T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des &quot;hängenden Tropfen&quot; Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 + Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 - / - Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.

Um ein Verfahren zum Thymus Keulen endogener Thymozyten ermöglicht die beste Entwicklung der Kolonisierung Vorläufern führen zu wählen, verglichen wir das Niveau von T-Zell-Rekonstitution in Thymus Keulen nach Bestrahlung kolonisiert oder eine 5-Tage-desoxy-guanosin (d-Gua) Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keinen Unterschied am Tag 9 der Kultur enthaltenen bestrahlt Lappen mehr T-Zellen als jene mit d-Gua behandelt, am Tag 12. Somit ist die Bestrahlung geeigneter als d-Gua-Behandlung an T-Zell-Entw...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K Aufrufe.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

Serie: Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.