Name: isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
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This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

Die Maus-Studien wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of North Carolina in Chapel Hill und alle genehmigten Tierpflege wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC. 1. Herstellung von Neugeborenen und Erwachsene Thymi <ol><li> Bereiten Sie alle Reagenzien und Geräte vor euthanizing Spendermäusen. </li><li> Sterilisieren chirurgischer Instrumente durch Autoklavierung oder andere geeignete Verfahren. Alle chirurgischen Verfahren müssen unter einer Haube mit laminarer Strömung, um sterile Bedingungen aufrecht zu erhalten und eine Verunreinigung zu vermeiden, durchgeführt werden. Montieren Sie die Werkzeuge für die Gewinnung von Thymi von Spendermäusen benötigt. </li><li> Füllen Sie einen 60-mm-Schale mit steriler 1x PBS (pH 7,4) und auf Eis in der Kapuze. Dies wird zu kurz store Thymi von Spendermäusen vor der Transplantation entnommen werden. </li><li> Nach ethischen Richtlinien, einschläfern Neugeborenen Spendermäusen durch Enthauptung und erwachsene Spendermäusen durch CO 2 Ersticken durch Genickbruch folgte. </li><li> Für removal des Thymus: Legen Sie die Maus in einer dorsalen Rückenlage auf einem sterilen saugfähigen Papiertuch und sprühen mit 70% Ethanol vor der einen Einschnitt. </li><li> Setzen Sie die Bauch- und Brusthöhle, indem Sie einen Mittelschnitt durch die Haut. Falten Sie die Haut über der Brust und Vorderbeine, um die Brusthöhle zu offenbaren. </li><li> Machen Sie zwei seitliche Schnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb, den oberen Mediastinum aussetzen und vorderen Brusthöhle. Der Thymus ist als zwei weißen Lappen unmittelbar über sichtbare und neben dem Herzen sein. </li><li> Necken neben der rund um die Thymusdrüse mit feinen Pinzette Bindegewebe, so dass bestimmte nicht, um die Kapsel zu stören. Während den Brustkorb mit einer Pinzette zurückhalten, verwenden Sie eine zweite Zange, um die zwei Lappen des Thymus durch die Positionierung einer gebogenen Pinzette unter der Orgel und vertikal ziehen zu extrahieren. Dies kann unter Verwendung eines Binokular zur Extraktion Thymi von neugeborenen Mäusen durchgeführt werden. </li><li> Setzen Sie den Thymus in der 60 mm dish, die steriles 1x PBS (pH 7,4) auf Eis und separater Thymus Lappen durch Durchtrennen des Bindelandenge. Entfernen Sie alle Fremdkörper aus dem Thymus Lappen mit dem bestimmte nicht, um die Kapsel beschädigt werden, und schneiden Sie die Thymus in die entsprechende Anzahl von Abschnitten für die Transplantation. </li><li> Manipulieren Sie nicht den von neugeborenen Mäusen erhalten Thymi. HINWEIS: Wird für maximal zwei Empfängermäuse (1 Lappen pro Empfänger). </li><li> Transplantation die aus erwachsenen Mäusen erhalten Thymi in maximal 4-6 Empfängermäuse. Mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig greifen ein Erwachsener Thymus Lappen, wie in Abbildung 1 dargestellt ist, schneiden Sie den Thymus in drei gleiche Abschnitte mit chirurgische Scheren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,4 für jede Spendermaus. Um die Zeit zu begrenzen Thymi ausgesetzt sind, bereiten 1 Spender Thymus zu einem Zeitpunkt. </li></ol> 2. Thymus Implantation unter die Nierenkapsel <ol><li> Montieren Sie den pre-sterilisiert Ausrüstung in Tabelle 1 aufgeführt. AseptischeTechnik sollte im Verlauf des Verfahrens Belichten Transplantatrezipienten kontaminierte Werkzeuge oder Reagenzien zu verhindern, verwendet werden. </li><li> Vor der Transplantation wiegen und etikettieren jeden Empfänger der Maus. </li><li> Einrichten des Binokular und Anästhesie-Schaltung in der Sterilbank. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, rasieren Sie die linke Seite der Empfängermaus und sicherzustellen, dass keine Haare rund um die verwendet werden, um den Schnitt zu machen Bereich bleibt. </li><li> Schalten Sie Isofluoran Verdampfer und betäuben die Maus mit einer Dosis von zwischen 1-2%. Ermitteln ordnungsgemäße Betäubung vor Beginn des chirurgischen Eingriffs durch Prüfen auf die Abwesenheit von reflex folgenden toe Prise. </li><li> Nachdem die Maus ordnungsgemäß betäubt wird, gelten veterinär Salbe auf den Augen der Maus, um Trockenheit zu verhindern und bereiten Sie die Maus für die Transplantation, wie folgt: </li><li> Bewegen Sie die Maus unter dem Binokular in einer rechten Seitenlage, so dass die rasierte Seite nach oben zeigt. Starting in der Mitte der OP-Bereich, verzichten in einer kreisförmigen Bewegung mit einem Einmaltransferpipette 70% Ethanol, gefolgt von PVP-Jod (Betadine). Wiederholen Sie die Ethanol / betadine Behandlung 3 mal vor einen Einschnitt. </li><li> Verwendung Präparierscheren einen 1-2 cm Flankenschnitt direkt über die Niere. </li><li> Verwendung Medium Pinzette fassen Bindegewebe neben der Niere und heben die Nieren, so dass es oben auf der Muskulatur liegt. Um die Niere freigelegt und an Ort und Stelle über die Muskulatur zu halten, legen Sie einen Arm des Mediums Zange unterhalb der Niere, wobei besonderes Augenmerk nicht auf die Nieren ilium stören. </li><li> Um Gewebeaustrocknung zu verhindern, zu bewässern die Niere mit sterilem 1x PBS (pH 7,4) bei jedem Schritt, bis Manipulation der Nieren und Nierenkapsel ist abgeschlossen. </li><li> Verwenden feinen Pinzette kneifen und heben Sie die Kapsel in der Nähe der Kante des Nieren meisten distal zu den Nebennieren, um es von der Niere zu trennen. </li><li> Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um einen Einschnitt groß genug, um das vorbereitete Stück Spender Thymus (2A) einfügen zu machen. Stellen Sie sicher, um die Kapselinzision so klein wie möglich zu Dislokation der Prothese im Laufe der Zeit zu verhindern. </li><li> Während die Kapsel löste sich von der Niere, verwenden Sie ein zweites Paar von feinen Pinzette, um das Transplantat unter der Kapsel einlegen und drücken Sie den Thymus so weit nach vorne aus dem Kapselinzision wie möglich (2B). </li><li> Entfernen Sie die Zange von unterhalb der Niere, und sanft die Niere wieder zurück an seinen Platz durch den Einschnitt. </li><li> Schließen Sie die Muskulatur durch Annähen der Bauchwand und die Anwendung betadine einmal geschlossen. Nach der vollständigen Naht ist, gelten Wundklammern, um die Dermis zu schließen und betadine in die Umgebung. </li><li> Gibt die Maus in einen Käfig mit einer Wärmelampe, die aufgewärmt hat. </li><li> Überwachen sich postoperative Maus, bis es volle Bewusstsein und Mobilität gewinnt und stellen Sie keine Mäuse that wurden nicht nach Betäubung in einen Käfig mit anderen Tieren gewonnen. </li><li> Behandlung von Mäusen mit postoperativen Schmerztherapie Medikamente nach Bedarf. Stellen Mäuse mit postoperativen Schmerzmittel wie Paracetamol im Trinkwasser in einer Konzentration von 1,6 mg / ml. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,9 für jeden Empfänger der Maus. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Mäuse, den normalen Aktivitäten innerhalb 1 Stunde nach der Operation. Überwachen Sie die postoperative Gewicht, Motorik, sowie das Tränken und Futter Aktivität jeder Maus, um Komplikationen, die sich als Folge der Transplantation zu bestimmen. HINWEIS: Post-operative Gewichtsverlust im Vergleich zu präoperativen Gewicht sowie veränderte Mobilität oder Misserfolg zu essen oder trinken können Komplikationen hinweisen. </li><li> Überwachen T Zellrekonstitution im peripheren Blut durch Ausbluten Mäusen über die Schwanzvene nick gefolgt von der Abtrennung der Lymphozyten mit Lympholyte Zelltrennungsmedien nach den Angaben des Herstellers. Erreichen T-Zell-characterization durch Anfärben Lymphozyten mit fluoreszenz konjugierte Antikörper spezifisch für T-Zellen-Marker CD3, CD4, CD8, sowie eine Live toten Diskriminator wie einem fluoreszenz aktivierte Succinimidylester 8. Analyse, wie in Figur 3 gezeigt ist über Gating Singuletts, lebenden Zellen und mit CD3-positiven Zellen erreicht werden. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests to disclose.

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd...

Der Thymus ist ein Organ, in dem kritische Ereignisse in T-Zell-Entwicklung entstehen 1. Resident Thymozyten auf Umlagerung des T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β-Gene, durchlaufen eine Reihe von Interaktionen mit lymphostromal und Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in der Rinde und Mark Regionen des Thymus 2. Thymus-positive Selektion durch kortikale Thymusepithelzellen (TEC) vermittelte, um Thymozyten, die antigene Peptide im Kontext der Host Major Histocompatibility Complex (MHC) Klasse I und II-Moleküle erkennen 2-3 herzustellen. Nachfolgende Thymus negative Selektion bringt Spülen von autoreaktiven Thymozyten, durch eine Wechselwirkung mit Mark TEC oder dendritischen Zellen (DC), die vorhanden Peptide aus Selbstproteine ​​durch MHC-Klasse-I und II-Moleküle gebunden 3 abgeleitet angetrieben. Das Ergebnis dieser Prozesse ist die Einrichtung eines Pools von reifen CD4 + und CD8 + T-Zellen in der Lage, ein breites Spektrum reagierenFremdgene während sie eine minimale Reaktivität mit Eigenproteine ​​4. Die Effizienz des Thymus Auswahlereignisse durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich Thymus-Reifung, die Häufigkeit der Mark und kortikaler TEC Teilzusammensetzung Thymus DC, und die Source des Thymus Vorstufen 3 beeinflusst. Bemerkenswert ist, können abweichende Thymus-Auswahl bei Autoimmun 5 oder immundefizienten Pathologien, die von eingeschränkter negative oder positive Selektion entstehen beziehungsweise führen. Die molekularen Ereignisse regulieren Thymus Auswahl, sind jedoch kaum verstanden. In vitro-Ansätze wie reaggregieren Thymus-Organkulturen (RTOC) 6, haben sich als nützlich für die Analyse von Basisereignissen mit Thymus Auswahl zugeordnet ist, aber nicht, um die Dynamik der laufenden vollständig rekapitulieren In-vivo-Veranstaltungen. Als Folge wurde dieses Thymus-Transplantation-basierten Ansatz für eine bessere Studien thymocyte Auswahl Veranstaltungen in vivo 7 fest </sup&gt;. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation Thymi von Neugeborenen und erwachsenen Spendermäusen in immundefiziente SCID-Empfängermäuse. Diese Technik erlaubt die Untersuchung der Mechanismen, die positive und negative Selektion Thymus sowie Thymusfunktion verschiedener T-Zell-Teilmengen während der Ontogenese regulieren. In jüngster Zeit wurde dieser Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass die Effizienz des Thymus Auswahl früh nach der Geburt in Mäusen führt zu einer erhöhten Entwicklung von autoreaktiven T-Zellen, und für die Fremdantigene 7 eine reduzierte T-Zell-Repertoire spezifisch.

<table><tbody><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Betadine Solution</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sutures (1.0 metric)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18&quot; (45cm)</td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td><td>Clay Adams&amp;reg; Brand</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterile, disposable</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Clone: 1452C11</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Clone: RM4-5</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Clone: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-well round botton polypropylene plates</td><td>Corning</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1.2 ml polypropylene cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylon Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Puralube Optical Ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, Sterile</td></tr></tbody></table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

Die Mechanismen, die die Wirksamkeit von Thymus Auswahl, zu regeln schlecht definiert. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht in vivo-Analysen von der Entwicklung und Auswahl bestimmter für Selbst- und Fremdantigene T-Zellen. Der Ansatz beinhaltet die Implantation von Thymus-Transplantate aus verschiedenen alten Mäusen in immundefiziente SCID-Empfänger ab. Über einen relativ kurzen Zeitraum die Empfänger sind mit T-Zellen aus dem Thymus implantierten Transplantats abgeleitet rekonstituiert. Nur Thymozyten Impfen der Thymus zum Zeitpunkt der Trennung zu unterziehen Auswahl und entwickeln sich zu reifen T-Zellen. Als solches können Änderungen in der Art und Spezifität der transplantierten T-Zellen als Funktion der altersabhängigen Thymus Ereignisse bewertet werden. Obwohl technische Know-how für erfolgreiche Thymus-Transplantation erforderlich ist, stellt dieses Verfahren eine einzigartige Strategie, um in vivo zu untersuchen eine breite Palette von Krankheiten, die durch oder aufgrund der abweichenden Thymus-Funktion und / oder sind homeostasist.

Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von minimalen chirurgischen Traumas sowie die genaue Positionierung der Prothese unterhalb der Nierenkapsel. Der Thymus Transplantat sollte geschnitten angemessen sicherzustellen bemessen Thymus Abschnitte für eine nachfolgende Transplantation, wie in Abbildung 1 dargestellt. Nach der schematischen Darstellung in Figur 1 kann Thymi aus neugeborenen oder erwachsenen Mäusen für eine erfolgreiche Transplantation subkapsuläre mit eindeutigen und repro...

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Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo. 

Serie: Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

Murine Vollhauttransplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A Novel Mikromodell für Heterotope, En Bloc Brustwand, Thymus und Herz-Transplantation bei Mäusen

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Medizin

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation is an important method for investigating thymic epithelial cell function and T cells maturation in vivo. Here we will describe the experimental methods used within our laboratory to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine (to deplete donor&#8217;s lymphocytes) treated embryonic thymus into the renal capsule of an athymic nude mouse. This method is both simple and efficient and does not require special skills or devices. The results obtained via this simple method showed that transplanted thymus can effectively support the recipient&#8217;s T cells production. Additionally, several key points with regards to the protocol will be further elucidated.

We provide a simple and efficient method to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine treated E18.5 thymus into the renal capsule of a nude mouse. This method should aide in the study of both thymic epithelial cells function and T cells maturation.

Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...

Optimierung der Isolierung von Stromazellen aus Thymus und Knochenmark

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der hämatopoetischen Forschung mit Stromazellisolierung für die Einzelzellsequenzierung

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Isolation und Transplantation von Different Aged Murine Thymic Grafts.

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

Murine Vollhauttransplantation

A Novel Mikromodell für Heterotope, En Bloc Brustwand, Thymus und Herz-Transplantation bei Mäusen

Renale subkapsuläre Transplantation von 2'-Deoxyguanosin-behandeltem murineembryonenden Thymus bei nackten Mäusen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen