Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zellen schnell von Screening-Schnittstellen für die genomische Charakterisierung zu isolieren, und diese Fähigkeit ist von Bedeutung, da es makroskopisch beobachtbare Zellmerkmale mit genomischen Informationen kombinieren kann. Die anvisierten Bakterienzellen aus den Screening-Grenzflächen können mit dieser Technik auf operationell einfache Weise mit hoher räumlicher Position isoliert werden. Die Hydrogele können in anderen Siebschnittstellen implementiert werden.
Das Hydrogel-Material kann leicht in mikrofluidische Kanäle eingebaut werden, um Auf-Abruf von Zellen aus mikrofluidischen Geräten auf Abruf zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Impfung des Vernetzungspuffers mit der gewünschten Zelldichte. Bereiten Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung in einem 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 12,5 Mikroliter des Vernetzungspuffers und 5,6 Mikroliter PEG ONB-Diacrylatlösung hinzufügen.
Und schließlich fügen Sie 6,9 Mikroliter Unterarm-PEG-Thiollösung zu der Mischung hinzu. Für die Zellverkapselung in der Hydrogel-Vorläuferlösung legen Sie die thiolierten Basis-Deckgläser auf eine saubere Petrischale und positionieren zwei Abstandshalter auf den beiden gegenüberliegenden Seiten des Deckglases. Befestigen Sie die Abstandshalter auf dem Bodendeckglas, indem Sie die Abstandshalter an die Petrischale kleben.
Nach Zugabe des gewünschten Volumens der Vorläuferlösung auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger den Objektträger auf den Bodendeckglas legen und die Hydrogelbildung bei Raumtemperatur 25 Minuten abschließen lassen. Sobald die Gelierung abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den perfluoralkylierten Glasobjektträger. Legen Sie das Substrat in die 60 mal 15 Millimeter große Petrischale mit ATGN-Medien, die mit einem Antibiotikum ergänzt werden.
Säen Sie 700 Mikroliter bakterielle Zellsuspensionen mit OD 600 von 0,1 über das Microwell-Array-Substrat und stellen Sie die Hydrogel-Vorläuferlösung her, wie zuvor unter Verwendung von 12,5 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung ATGN von pH acht gezeigt. 12,5 Mikroliter der Vorläuferlösung werden auf einem nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert und zwei 38 Mikrometer große Stahlabstandhalter auf zwei gegenüberliegenden Seiten des mit Zellen innokulierten Mikrotiterfeld-Array-Substrats platziert. Dann den perfluoralkylierten Glasobjektträger mit dem Vorläuferlösungströpfchen invertieren und ein Tröpfchen in die Mitte des Mikrotitergutsubstrats legen.
Wenn das Hydrogel nach einer Inkubation von 25 Minuten bei Raumtemperatur gebildet wird, entfernen Sie den Glasobjektträger vorsichtig vom Mikrotitergutsubstrat und legen Sie das Substrat in eine Petrischale mit ATGN-Medien, die mit Antibiotika ergänzt sind. Legen Sie die Probe in einen PDMS-Halter und fügen Sie das definierte Medium auf die Probe auf, um eine Austrocknung der Probe zu verhindern und eine Trägerlösung für freigesetzte Zellen bereitzustellen. Nachdem Sie den Kalibrierspiegel in Position gebracht haben, stellen Sie den Mikroskopfokus ein, um ein scharfes Bild der Kolonien innerhalb des Hydrogel- oder Mikrotiterrohrarrays zu erhalten, und inspizieren Sie, um Kolonien oder Vertiefungen von Interesse zu identifizieren.
Entwerfen Sie hier die Lichtmuster, während die Kameraansicht die Kolonien in der Probe zeigt, um verschiedene Muster für die Zellextraktion zu testen und das definierte Muster zu speichern. Wählen Sie dann den Abschnitt Sitzungssteuerung aus und fügen Sie die gespeicherte Sequenz unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs hinzu. Wählen Sie die Option zum Stimulieren des Musters, um die gewünschte Belichtungsposition anzuzeigen und anzupassen.
Stellen Sie als Nächstes die Lichtintensität auf 60% und die Belichtungszeit auf 40 Sekunden unter der LED-Steuerregisterkarte ein und starten Sie den Belichtungsprozess. Überwachen Sie den Hydrogelabbau in Echtzeit und im Brightfield-Modus, um die Zellfreisetzung sicherzustellen. Um die freigesetzte Zelle zu sammeln, ändern Sie den Mikroskopfilter von Brightfield auf TRITC, um den exponierten Bereich der Probe mit bloßem Auge sichtbar zu machen.
Sobald der exponierte Bereich lokalisiert ist, platzieren Sie das Ende des Schlauches auf der bestrahlten Stelle und ändern Sie dann den Mikroskopfilter zurück in Brightfield, um den Zellabruf in Echtzeit zu überwachen. Verwenden Sie die Spritze, die am anderen Ende des Schlauches befestigt ist, um vorsichtig 200 Mikroliter Lösung mit den freigesetzten Zellen zu entnehmen und die Lösung zur DNA-Analyse oder Beschichtung in ein 1,5-Millimeter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Für die Zellextraktion aus Bulk-Hydrogelen wurden unterschiedliche UV-Licht-Mikromuster verwendet, die die Morphologie der freigesetzten Zellen beeinflussten.
Die UV-Exposition in einem Ringmuster führte zur Freisetzung der gesamten Kolonie, die in einem schützenden PEG-Hydrogel eingekapselt war. Im Gegensatz dazu könnten Zellen durch die Exposition eines Teils oder der gesamten Kolonie gegenüber UV-Licht entweder als aggregierte Zellcluster oder als freie Einzelzellen extrahiert werden. Die Zellaussaatdichte und -dicke des Hydrogels sind wichtig für die Zellverkapselung.
Die dünneren Hydrogele führten zu Mikrokolonien mit minimaler Kolonieüberlappung, während die Hydrogele mit erhöhter Dicke zu überlappenden Kolonien führten, was zur Extraktion mehrerer Kolonien führen könnte. Überlappende Kolonien können während der Extraktion aufgrund der zweidimensionalen Natur des Lichtmusters zu einer Kreuzkontamination führen. Wenn eine Top-Kolonie ins Visier genommen wurde, wurde auch die darunter liegende Kolonie mit ihr extrahiert.
Die Wirkung unterschiedlicher UV-Licht-Mikromuster auf die Zelllebensfähigkeit wurde ebenfalls bewertet. Wenn Mikrokolonien kontrollierten Dosen von UV-Licht entweder in einem kreisförmigen oder kreuzförmigen Muster ausgesetzt wurden, wurden die Zellwiederherstellung und die DNA-Reinheit nicht beeinflusst. Die Zellen wurden mit diesem Ansatz erfolgreich aus Mikrotiterplatten-Arrays gewonnen, was aus den repräsentativen konfokalen Mikroskopiebildern hervorging, wobei bei Bestrahlung im Kreis- und Ringmuster die Zellen im jeweiligen Muster entfernt wurden.
Nach der Extraktion aus Microwell-Arrays wurden die Zelllebensfähigkeit und die DNA-Menge bewertet. Die Expositionsmuster beeinflussten weder die Anzahl der lebensfähigen Zellen noch die DNA-Qualität, was darauf hindeutet, dass lebensfähige Bakterienzellen selektiv aus Mikrobohrungen mit minimalem Schaden entnommen werden konnten und ihre DNA mit hoher Reinheit für die nachgeschaltete genomische Analyse isoliert werden konnte. Überprüfen Sie immer, ob sich das Hydrogel gebildet hat, bevor Sie den perfluoralkylierten Deckglas entfernen.
Präzision und Sorgfalt sind erforderlich, um die Abstandhalter für die Hydrogelabscheidung zu platzieren und die Schläuche für die Extraktion von Zellen zu verwenden.
