Die Autoren danken den Spendern die Familien und die Orgel Beschaffung Organisationen in diesem Forschungs-und Maria Martino und Irina Kusmartseva für ihre fachkundige Unterstützung beteiligt. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) zur Unterstützung des Network for Organ Donors mit Pankreas-Diabetes gefördert.

1. Set-up <ol><li> Label-Kassetten für Paraffin-Blöcke manuell mit einem Bleistift, oder automatisch mit einem Kassetten-Drucker. Fügen Sie den Geber-Kennung (CaseID), Probentyp, Aliquot-Nummer, und keine zusätzliche eindeutige Identifikation (Urteil Arbeitsblatt, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> ). </li><li> Label-Oktober Formen wie für Kassetten mit einem wasserfesten Filzstift. Schneiden Sie 5-10 cm Rechtecke aus Aluminiumfolie. </li><li> Drucken oder manuell Etikett mit Edding alle Fläschchen und Tuben. Fügen Sie genug Fläschchen für Hackfleisch Snap gefrorenen Proben und Rohre mit RPMI-Medium für frische Sendungen. Für das Snap gefrorene Röhrchen mit RNAlater, 1 ml RNAlater jedem Kryoröhrchen. </li><li> Set-up Dissektionstische Biosicherheit in Kapuze und Theken mit sterilisierten Dissektion Instrumente (Zangen, Skalpelle, Klingen, Gazekompressen (4x4)) sowie Kassetten und Oktober Formen in der Reihenfolge ihrer Verwendung angeordnet. </li><li> Bereiten Sie eine Gefrierbad indemTrockeneis in einem mittelständischen Styropor-Box (10x10 cm) bis zu einer Tiefe von mindestens 3 cm und fügen Isopentan, bis das Trockeneis vollständig bedeckt ist. </li><li> Optional: Füllen Sie eine kleine Dewar Behälter mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Wenn Bauchspeicheldrüse für Elektronenmikroskopie (EM) benötigt wird, vorzubereiten TAAB Fixativ, indem 1,25 ml 16% Paraformaldehyd, 1,25 ml 8% Glutaraldehyd und 7,5 ml 0,1 M PBS. Bereiten Lowicryl Fixativ durch Zugabe von 2,5 ml 16% Paraformaldehyd und 7,5 mL 0,1 M PBS. </li><li> Planen Lösungen zur Isolierung von Zellen verwendet. Zu 500 ml Flasche DMEF (mit Glutamin), folgen Sie aseptische Techniken beim Hinzufügen der folgenden Schritte aus: <ol><li> Fötalem Rinderserum (FBS): Dazu 50mL, final 10%. </li><li> Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 10.000 U / mL / 10000 ug / ml Stammlösung) - fügt man 5 ml Pen / Strep Lager zu RPMI für Endkonzentration von 100 U / ml / 100ug/mL. Auch mit 5 ml in einen 500 ml Flasche DPBS, wenn für das Halten Lymphknoten oder der Milz Proben verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Personal <ol&gt; <li> Vorgehensweise wird optimal mit drei Mitarbeitern jedoch das Verfahren mit einem gut ausgebildeten einzelnen durchgeführt werden kann bewerkstelligt. Zwei Personen können in der Regel führen Sie das Verfahren in 90 Minuten. Tatsächliche Dauer ist abhängig von Anzahl von Geweben aufgenommen und Auffindbarkeit Lymphknoten an. Beispiele für die Zelle Isolierungen werden bei 4 ° C bis zur Vollendung der Gewebedissektion während Serumproben parallel verarbeitet werden. </li><li> Pathologe, Pathologie-Assistent, oder gleichwertig-ein erfahrener Mitarbeiter führt das Gewebe Handhabung und führt wichtige Dissektionen einschließlich Division (en) der Bauchspeicheldrüse Kopf und Ernte Lymphknoten an. Die ersten Bemühungen sind auf die Bauchspeicheldrüse durch die Prüfung der peri-pankreatische Fett für Lymphknoten gefolgt gerichtet. </li><li> Labor-Techniker oder gleichwertiger-Mitarbeiter im Gewebe ausgebildet Trimmen, deren primäre Aufgaben sind zu Pankreas-und Regionen-und Trimm-Gewebe für feste und gefrorene Blöcke und für Snap gefrorenen v wiegenIALS. Empfängt Duodenum und Milz aus der Pathologie Assistent und verarbeitet diese Organe während der Pathologie Assistent wird die Verarbeitung der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Laborantin-Mitarbeiter, der den anderen hilft einschließlich Block und Fläschchen Etikettierung, Probe Hacken für Kryoröhrchen, und Serum-Verarbeitung. </li></ol> 3. Pankreas Dissection <ol><li> Entfernen Sie den Zwölffingerdarm und der Milz und reinigen Sie das Pankreas von Fremdwasser Fett, Gefäße und Nerven mit stumpfer und scharfer Dissektion </li><li> Setzen Sie den gereinigten Pankreas auf einem Seziertisch Board mit Papiertüchern abgedeckt. Tauchen Sie ein Wattestäbchen in blauer Tinte und Ausbreitung auf der Vorderfläche des Pankreas. Vorsichtiges Abtupfen der Exzess. </li><li> Optional: Tauchen Sie einen neuen Applikator in schwarzer Tinte und Verbreitung auf der hinteren Fläche der Bauchspeicheldrüse. Zurück zum normalen Pankreas Orientierung mit vorderen Oberfläche nach Prosektor. </li><li> Schneiden Sie das Pankreas in drei Regionen: Kopf, Körper und Schwanz (Abbildung 1). Schneiden Sie die Verbindung zwischen HEAd und Körper verteilen dann den restlichen Teil in ~ gleiche Portionen für Körper und Schwanz. </li><li> Wiegen Sie jede Region der Bauchspeicheldrüse und der Rekord Gewichte (Urteil Aufarbeitung Blatt ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> )). </li><li> Abschnitt (~ 0,5 cm) jede Region der Bauchspeicheldrüse in einer quer &quot;Brotlaib&quot; Weise (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie die Abschnitte aus beiden Kreuzungen zwischen den Regionen für Hackfleisch-Proben. Je nach Größe Pankreas, kann eine Probe aus dem Körper-Schwanz Übergangsbereich schwierig sein, zu erhalten, in welchem ​​Fall die Anzahl der Paraffinblöcke verringert werden, um zerkleinerte Proben oder Proben nur aus dem Pankreas Kopf-Körper-Bereich zu erhalten, erhalten werden kann. Label-Kryoröhrchen nach wie Kopf-oder Körper zu proximalen Bereich an der Kreuzung zu bezeichnen. <ol><li> Mince Stücke teilen und gleichmäßig zwischen Kryoröhrchen (≥ 1 g pro Flasche). Schnell einfrieren, ohne RNAlater Fläschchen in flüssigem Stickstoff oder in Trockeneis - Isopentan Gülle übertragen Sie dann tOA -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Halten Fläschchen mit RNAlater bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis zur Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen, Remix und schnell in flüssigem Stickstoff oder in der Trockeneis-Isopentan Gülle frieren dann zu einer -80 ° C Gefrierschrank zu übertragen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie abwechselnden Abschnitten für Paraffin-und Oktober-Blöcke beginnend mit Paraffin (Abbildung 1). </li><li> Lehnen alle Querschnitte nach rechts. </li><li> Ort ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm Abschnitte in den Kassetten. Wenn die Querschnitte zu groß sind, um die Hälfte (Abbildung 2b) zu schneiden. Label-Kassetten für blaue vordere Hälfte als &quot;A&quot; und hinteren Hälfte als &quot;B&quot;. </li><li> Wenn die Stücke immer noch zu groß sind, schneiden sich senkrecht zu dem vorigen Schnitt (Abbildung 2c). Etikettenkassetten AD im Uhrzeigersinn. RANDSTÜCKE weiter wie notwendig, um innerhalb von Kassetten passen. </li><li> Anzahl Blöcke sequentiell innerhalb der Region, beginnend mit dem mittleren Abschnitt. </li><li> Für Paraffin-Blöcke, Position Cassettes mit dem Etikett nach links und die Gewebeschnitte in die Kassette unter Beibehaltung der Orientierung. Schließen Kassettenfachdeckel und Transfer zu einem Behälter mit ~ 500 ml 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Starten Sie die Zeitnehmung Fixierung, wenn die letzte Kassette in Fixativ gelegt wird. </li><li> Für Oktober Blöcke, gießen Sie eine dünne Schicht von Oktober Medium in den prelabeled Schimmel lag dann das Gewebe in der Form sicher zu sein, um Orientierung zu erhalten und decken Gewebe mit Oktober Schnell tauchen die Formen Oktober in einem Trockeneis - Isopentan Gülle für ~ 1 Minute. Entfernen von Schlamm und auf Trockeneis für die temporäre Speicherung oder im Gefrierschrank -80 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Erhalten ~ 0,5 x 0,5 cm dicke Scheiben von der Kopf-Körper-Knotenpunkt für Elektronenmikroskopie (EM). Eine Scheibe in der TAAB Fixativ und die andere Scheibe in der Lowicryl Fixativ. Bewahren Sie beide Arten von Fixativ mit Proben bei 4 ° C für mindestens 48 Stunden und / oder auf unbestimmte Zeit bis zur weiteren Verarbeitung zur EM. </li></ol> 4. Milz, Lymphknoten Zergen und Duodenalschleimhaut Dissektionen <ol><li> Isolieren Lymphknoten (PLN) aus Fett und schneiden alle Bindegewebe an den Knoten Kapsel. Platz in sterilen Zellkulturschale enthaltend DMEF. Je nach Gesamtzahl isoliert, teilen PLN in Aliquots für frische Lieferungen, kryokonservierten Zellen Isolationen, Paraffin und / oder Oktober Blöcke, und Vials. Hackfleisch großen Knoten in Stücke nicht größer als 0,5 cm. </li><li> Hackfleisch nicht Lymphknoten und Milz in kleine (ca. 0,5 cm) Würfel. Place in Fixativ, Oktober Medien und DMEM oder für frische Probe Sendungen oder kryokonservierten Zellen Isolierungen nach Mengen an Ausgangsmaterialien. </li><li> Öffnen Sie den Zwölffingerdarm und sanft über das Duodenalschleimhaut sauber von Schleim mit einem befeuchteten Gaze-Pad. Schneiden Sie Abschnitte der Schleimhaut für Paraffin und / oder gefrorene Blöcke Oktober und Hackfleisch-Proben für Vials, mit und ohne RNAlater. Frieren wie für die anderen Proben. </li></ol> 5. Wrap Oktober Blöcke in vorher beschriftete Aluminiumfolie und Oktober statt und Blöcke<html> Vials in Schachteln für die langfristige Lagerung bei -80 ° C 6. Submit fixierten Proben für Paraffin-Verarbeitung <ol><li> Fix Gewebe für 16 Stunden (zwischen 20 ± 4 Stunden) mit Hilfe eines automatischen Paraffin-Prozessor oder mit manuellen Timing. Verarbeiten, um Paraffin-Blöcke mit einem automatischen Prozessor ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Anhang 2</a> ). </li><li> Einbetten Abschnitte in der exakten Ausrichtung wie von der Prosektor mit der Kassette Etikett auf der linken Seite platziert. Betten Sie die Duodenalschleimhaut mit der Schnittfläche nach unten um die Prüfung der Schleimhaut senkrecht zur Submukosa zu ermöglichen. </li></ol> 7. Reinigen Sie Dissektion Bereichen und zu desinfizieren. Waschen Sie Dissektionsinstrumente und erneut sterilisieren. Platzieren Sie Überbleibsel menschlichen Geweben in Formalin Fixativ für die Lagerung wie biomedizinischen Abfällen. Entsorgen Sie biomedizinischen Abfällen nach den örtlichen Bestimmungen innerhalb eines Monats. 8. Aktualisieren Sie den Sample Inventory System ve_title &quot;&gt; 9. repräsentative Ergebnisse Dieses Verfahren wird eine intakte menschliche Bauchspeicheldrüse mit repräsentativen Stichproben im gesamten Organ einschließlich Abgrenzung der drei wichtigsten Regionen, nämlich Kopf, Körper und Schwanz innerhalb von 2 Stunden zu verarbeiten. Die hakenförmigen Bereich in der hinteren Kopfbereich gefunden wird, wird in den Kopf Dissektion enthalten. Das mittlere Gewicht der Bauchspeicheldrüse in Organspender ohne Diabetes war 82,4 Gramm (52,7 bis 139,0 Gramm). Pankreas regionalen Gewichte waren annähernd gleich (Abbildung 3). Dieses Verfahren kann auch für die Rekonstruktion des gesamten Pankreas mit gefärbten Schnitten sequentielle Paraffin und Oktober Blöcke ermöglichen. Mehrere Formate sind machbar was eine maximale Auslastung für aktuelle und zukünftige Technologien. Der aktuelle Fall nPOD Arbeitsblatt zur Verfügung gestellt ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> ), die verwendet wird, um wieder Proben und anschließende proc dokumentierenEssing von aliquoten Arten und Mengen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des Verfahrens. Die gesamte Bauchspeicheldrüse verarbeitet wird unter Beibehaltung anatomischen Orientierungen. Der Kopfbereich, geht in der Superior-inferior-Achse aufgrund der Anwesenheit des ventralen Pankreas Keule in der hinteren Region, die die hakenförmigen Region umfasst. Schraffierte Fläche an Kreuzungen bezeichnen Regionen für Hackfleisch-Proben in Kryoröhrchen verwendet. P, Paraffin, O, Oktober <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Abbildung 2. Lettering System für den Pankreas-Abschnitten. Transverse Bauchspeicheldrüse Scheiben lassen sich weiter in Hälften oder Viertel unterteilt und mit Buchstaben im Uhrzeigersinn. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bauchspeicheldrüse von Organspendern Gewichte ohne Diabetes. Dieintakten Bauchspeicheldrüse von erwachsenen Spendern (&gt; 17 Jahre) wurde dann aufgeteilt in Regionen und der regionalen Gewichte erhalten gewogen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 15).

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	<li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li><li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas:+the+effects+of+age+and+diabetes.">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li><li>Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+the+ventral+and+dorsal+pancreas:+a+new+insight+into+anatomy+and+embryonic+development.">Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development.</a> J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).</li><li>Wittingen, J., Frey, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+concentration+in+the+head,+body,+tail+and+uncinate+process+of+the+pancreas.">Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas.</a> Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).</li><li>Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+of+the+human+diabetic+pancreas.">Cellular composition of the human diabetic pancreas.</a> Diabetologia. 24, 366-371 (1983).</li><li>Vaught, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+NCI+perspective+on+creating+sustainable+biospecimen+resources.">An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources.</a> J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).</li><li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies.">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li><li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hy&#246;ty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+&#946;-cell+autoimmunity.">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of &#946;-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li><li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors.">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li><li>T&#246;ns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans.">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Standard, der Bauchspeicheldrüse Verarbeitung harmonisiert werden auf mehreren Sammelstellen können definieren und ermöglichen so einen Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Gruppen erhalten. Die Dissektion Methode basiert auf Standard-chirurgischen Pathologie Praxen mit zusätzlichen Schritten zur Annotation von großen Regionen der Bauchspeicheldrüse durch intra-regionalen Unterteilungen gefolgt basiert. Die Standardisierung der Bioprobe Verarbeitungsmethoden ist erfor...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dissektionsinstrumente einschließlich Skalpelle mit 22 Klingen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Kryoröhrchen (1,8 ml) </td><td> VWR Nordamerika </td><td> 89004-300 </td><td> Sterile, Barcodes optional </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Klinische Pathologie Ink </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kassetten </td><td> Mercedes Medical </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% neutral gepuffertem Formalin </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Einfriermedien </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Schimmelpilze </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Verschiedene Größen </td></tr><tr><td> Isopentan </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Oktober chilling Bad </td></tr><tr><td> Trockeneis </td><td></td><td></td><td> Oktober chilling Bad </td></tr><tr><td> Flüssiger Stickstoff im Dewar-Gefäß </td><td></td><td></td><td> Rasten Sie das Einfrieren Kryoröhrchen </td></tr><tr><td> Zellkulturschale (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Steril, kann gekühlt, enthalten Glutamin </td></tr><tr> &lt;td&gt; fötalem Rinderserum </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> Sterile, speichern gefrorenen Aliquots </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin / antimykotische </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Sterile, speichern gefrorenen Aliquots </td></tr><tr><td> Typ 9 Paraffin </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1x D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> EM Sciences </td><td> 15710 </td><td> Machen Sie frisch, gekühlt lagern </td></tr><tr><td> 8% Glutaraldehyd </td><td> EM Sciences </td><td> 16019 </td><td> Machen Sie frisch, gekühlt lagern </td></tr><tr><td> Biosafety Level 2 Haube </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-Low-Gefrierschrank </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura Cassette Drucker </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Automatische Paraffin-Prozessor </td></tr><tr><td> Paraffineinbettung Bahnhof </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifischen Reagenzien und Geräte.

collection protocol for human pancreas

Diese Zergliederung und Probenahmeverfahren wurde für das Netzwerk für Pankreas-Organ Donors mit Diabetes (nPOD) Programm zur Vorbereitung der Bauchspeicheldrüse von Organspendern gewonnen Leichen zu standardisieren entwickelt. Die Bauchspeicheldrüse ist in 3 Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) von seriellen Querschnitten der ganzen medial nach lateral Achse gefolgt aufgeteilt. Abwechselnd Abschnitte sind für Paraffin und frisch gefrorenen Blöcken und Überrest Proben verwendet werden, für Snap gefrorene Probe Präparate zerkleinert, entweder mit oder ohne RNAse-Inhibitoren für DNA, RNA oder Protein isoliert. Das übergeordnete Ziel der Bauchspeicheldrüse Dissektion Verfahrens ist es, die gesamte Bauchspeicheldrüse zu probieren und gleichzeitig anatomische Orientierung. Endokrine Zelle Heterogenität in Bezug auf die Inselzellen Zusammensetzung, Größe und Zahlen ist für den menschlichen Inseln im Vergleich zum Nagetier Inselchen 1 angegeben. Die Mehrheit der menschlichen Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse Kopf, Körper und Schwanz Regionen der Insulin-containin komponiertg β-Zellen durch geringere Anteile an gefolgt Glukagon-haltige α-Zellen und Somatostatin-haltigen δ-Zellen. Pankreaspolypeptid PP-haltige Zellen und Ghrelin-haltigen Epsilon Zellen sind auch vorhanden, aber in geringer Anzahl. Im Gegensatz dazu enthält das uncinatus Region Inseln, die vor allem von Pankreas-Polypeptid enthaltende PP-Zellen 2 zusammengesetzt sind. Diese regionalen Unterschiede ergeben sich aus Inselchen entwicklungsbedingte Unterschiede. Die Bauchspeicheldrüse entwickelt sich aus den ventralen und dorsalen Pankreas Knospen im Vorderdarm und nach der Drehung des Magens und des Duodenums, die Bauchlappen bewegt und verschmilzt mit der dorsalen 3. Die Bauchlappen bildet den hinteren Teil des Kopfes einschließlich der hakenförmigen durch, während der dorsalen Lappen führt zu dem Rest des Organs. Regionale Pankreas Variation ist auch mit der Heckbereich mit einer höheren Dichte Inselchen im Vergleich zu anderen Regionen und die dorsalen Lappen-abgeleiteten Komponenten durchlaufen selektive Atrophie bei Typ 1-Diabetes berichtet <sbis&gt; 4,5. Zusätzliche Organe und Gewebe werden oft von den Organspendern gewonnen und zählen Lymphknoten, Milz und nicht-Lymphknoten an. Diese Proben werden mit ähnlichen Formaten wie der Bauchspeicheldrüse unter Zusatz von Isolierung von kryokonservierten Zellen gewonnen. Wenn der proximalen Duodenum mit der Bauchspeicheldrüse ist im Preis inbegriffen, kann Duodenalschleimhaut für Paraffin und gefrorenen Blöcken und Hackfleisch Snap gefrorener Zubereitungen gesammelt werden.

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Collection Protocol for Human Pancreas

Dieses Video zeigt eine Dissektion Verfahren zur Bearbeitung der menschlichen Bauchspeicheldrüse in mehrere Speicherformate. Anatomische Orientierung wird im Laufe der Bauchspeicheldrüse Regionen aufrechterhalten, um Definition von Regional-Inselchen Zusammensetzung und Dichte zu ermöglichen.

Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

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14.7K Aufrufe.  University of Florida. Dieses Video zeigt eine Dissektion Verfahren zur Bearbeitung der menschlichen Bauchspeicheldrüse in mehrere Speicherformate. Anatomische Orientierung wird im Laufe der Bauchspeicheldrüse Regionen aufrechterhalten, um Definition von Regional-Inselchen Zusammensetzung und Dichte zu ermöglichen.

Serie: Collection Protocol for Human Pancreas

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Forschung

Medizin

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

Sammlung, Isolierung, und Durchflusszytometrische Analyse der Menschen Endozervikale Proben

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

A Detailed Protocol for Perspiration Monitoring Using a Novel, Small, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the patients are unaware of such disorders or are having difficulty expressing their symptoms. Until now, several devices for perspiration monitoring have been developed; however, such devices tend to have a relatively large exterior, considerable power consumption, and/or less sensitivity.
Recently, we developed a small, wireless device for perspiration monitoring. The device consists of a temperature/relative humidity (T/RH) sensor, battery-driven small data logger, and silica gel as a desiccant in a small cylindrical exterior. The T/RH sensor is placed between the detection windows (through which the water vapor from the skin enters) and the silica gel. The underlying principle of the perspiration monitoring device is based on Fick&#39;s law of diffusion, which means that water vapor flux from the skin to the silica gel (i.e.&#160;transepidermal water loss and perspiration) can be captured by change in humidity at the T/RH sensor. In addition, a baseline subtraction method was adopted to distinguish perspiration and transepidermal water loss.
As shown in the previous report, the developed device can monitor the perspiration at any sites of the body in an easy, wireless manner. However, detailed methods of how to use the device have not been disclosed yet. In this article, therefore, we would like to show the point-by-point tutorials of how to use the device for perspiration monitoring, by showing the sympathetic activity test with the sympathetic skin response monitoring as an example.

Recently, we developed a small wireless device for perspiration monitoring. In this article, we present detailed protocols on how to use the device for perspiration monitoring with an example of the sympathetic activity test.

Ein detailliertes Protokoll für Transpiration Überwachung eines neuartigen Verwendung, Klein, Wireless Device

Perspiration monitoring can be utilized for the detection of certain diseases, such as thermoregulation and mental disorders, particularly when the ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Maus-Modell für die Bauchspeicheldrüse Transplantation mit einer modifizierten Manschette-Technik

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

Dissektion der Maus Bauchspeicheldrüse für histologische Analyse und Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Robotic Lateral Pancreaticojejunostomy for Chronic Pancreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The recent rise of robotic and laparoscopic pancreatic surgery has found benefits such as reduced time to functional recovery. Few studies have reported on the feasibility, technique and outcome of robotic LPJ, especially including transection of the gastroduodenal artery. The present study describes the main steps for robotic LPJ in a patient with painful chronic pancreatitis with a dilated main pancreatic duct. The patient underwent robotic LPJ. The LPJ anastomosis is performed using a running suture technique in a longitudinal side-to-side manner. Routinely, the gastroduodenal artery is transected to drain the entire length of the main pancreatic duct. The patient is in French position; 7 trocars are placed (4 robotic, 2 laparoscopic assistants, 1 liver-retractor). After docking of the robot system, the omental bursa is opened, and the right gastroepiploic artery and vein are ligated at their base at the lower border of the pancreas. Intraoperative ultrasonography is performed in order to determine trajectory of the dilated main pancreatic duct which is opened for its entire length after the gastroduodenal artery has been suture ligated both cranially and caudally from the main pancreatic duct. A Roux limb is created, and a latero-lateral PJ is fashioned using several 3-0 barbed sutures. A stapled jejuno-jejunostomy is created at sufficient distance from the pancreatic anastomosis, aided by a 50 cm suture. The described technique for robotic LPJ is a complex but feasible operation for patients with treatment refractory CP and a dilated main pancreatic duct. Due to its complexity, implementation in high volume centers with extensive experience with CP surgery may improve outcomes.

Robotic lateral pancreaticojejunostomy (RLPJ) may be used in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis and a dilated main pancreatic duct. We describe a standardized and reproducible technique for RLPJ, which includes transection of the gastroduodenal artery.

Roboter Lateral Pancreaticojejunostomie für chronische Pankreatitis

Lateral pancreaticojejunostomy (LPJ) has shown good postoperative outcomes in patients with painful, morphine dependent, chronic pancreatitis (CP). The ...

Robot-Assisted Kidney Transplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed in the supine Trendelenburg position. Kidney allografts are provided by a living donor. Before vascular anastomosis, the kidney allograft is prepared by inserting a double-J stent in the ureter, and the temperature for the anastomosis is lowered by wrapping it in an ice-packed gauze. A 12 mm or 8 mm port for the robotic camera and three 8 mm ports for robotic arms are placed. A peritoneal pouch is created for the kidney allograft by raising the peritoneal flaps on both sides over the psoas muscle before dissecting the iliac vessels and bladder. A 6 cm Pfannenstiel incision is made to insert the kidney into the peritoneal pouch, lateral to the right iliac vessels. 
After clamping the external iliac vein with Bulldogs clamps, a venotomy is performed, and the graft renal vein is anastomosed to the external iliac vein in an end-to-side continuous manner with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture. After clamping the graft renal vein, the iliac vein is declamped. This is followed by clamping of the external iliac artery, arteriotomy, arterial anastomosis with a 6/0 polytetrafluoroethylene suture, clamping of the graft renal artery, and declamping of the external iliac artery. Reperfusion is then carried out, and ureteroneocystostomy is performed using the Lich-Gregoir technique. The peritoneum is closed at a few locations with polymer locking clips, and a closed-suction drain is placed through one of the working ports. After deflating the pneumoperitoneum, all incisions are closed.

This paper provides technical details for robot-assisted kidney transplantation from a living donor.

Robotergestützte Nierentransplantation

This paper describes robot-assisted kidney transplantation (RAKT) from a living donor. The robot is docked between the parted legs of the patient, placed ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Sammlung, Expansion und Differenzierung primärer humaner Nasensepithelzellmodelle zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ shortages and increasing numbers of patients being listed for PTx, new strategies are needed to increase the number of available grafts for transplantation. 
Static cold storage (SCS) is considered the gold standard for standard criteria organs. However, standard criteria donors (SCD) are becoming scarce and new strategies that can increase the rate of organ acceptance from extended criteria donors (ECD) are urgently needed. 
Normothermic ex vivo perfusion (NEVP) is one of the strategies that has become increasingly popular over the past couple of decades. This preservation method has already been used successfully in other organs (liver, kidneys, and lungs) but has been minimally explored in pancreas transplantation. The few papers that describe the method for pancreas show little success, edema being one of the major issues. The following manuscript describes the successful NEVP method and setup developed by our group to perfuse swine pancreas.

Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusion for the Preservation of Pancreas Allografts before Transplantation

Normothermic ex vivo machine perfusion (NEVP) has scarcely been explored for the preservation of pancreas allografts. We present an innovative preservation technique for pancreas allografts before transplantation.

Normotherme ex vivo Pankreasperfusion zur Konservierung von Pankreas-Allotransplantaten vor der Transplantation

Pancreas transplantation (PTx) is a curative treatment for people who live with the burden of a diagnosis of diabetes mellitus (DM). However, due to organ ...

Surgical Tips and Tricks for Performing Porcine Pancreas Transplantation

Despite the promising results of pancreas transplantation in type 1 diabetes mellitus and metabolic syndrome, the biggest concern around this state-of-the-art technique remains the paucity of organs deemed fit for transplantation. High intravascular resistance, delicate intraparenchymal capillary framework, and complex lobular anatomy around the mesenteric vasculature are what make this organ more susceptible to injury and less tolerant to trivial trauma compared to organs such as the liver and kidney. Meticulous surgical dissection and judicious tissue handling form the cornerstone of the entire exercise of pancreas transplantation. Owing to morphological similarity between the anatomy of the porcine pancreas to the surrounding mesenteric vessels and the organs when compared to the human anatomy, demonstration of the technique in the porcine model could help to most accurately extrapolate this to a human setting. The present article aims to outline the essential surgical tips and tricks that need to be followed, in order to ensure a higher success rate of transplantation of this highly susceptible organ in a porcine 3-day survival model.

The video article summarizes the technique of pancreatectomy and pancreas allotransplantation in a porcine 3-day survival model with a step-by-step description of the method and emphasis on the surgical tips and tricks to deal with the precarious and delicate porcine visceral anatomy.