Diese Arbeit wurde von der California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) und dem NIH (DK54441) unterstützt.

Stellt fest, bevor Sie beginnen: <ol><li> Menschlichen fetalen Pankreas wurden aus den Geburtsschäden Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), die das Gewebe geerntet wurden. Informierte Einwilligung zur Gewebespende, Lagerung und Verwendung der Proben wurde von den Spendern von der Mitte erhalten. Das Protokoll Zustimmung Aussage wurde schriftlich geregelt und der University of California, Human Research Protections Program San Diego genehmigt die ganze Studie (Protokoll # 081237XT). </li><li> Es ist wesentlich, um sowohl die menschlichen fötalen Pankreas und den Container, der Bauchspeicheldrüse auf Eis während des gesamten Verfahrens aufrechterhalten. Die Spaltung und Verdauung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. </li><li> Senden die Klinik, wo die menschlichen fötalen Pankreas wurde aus dem Puffer für die Lagerung und den Transport von Pankreas erhalten. (RPMI-1640 + 10% normalem Humanserum (NHS), 300 mM Trehalose SG, Penicillin / Streptomycin und Fungizon). </li></ol>1. Dissektion der menschlichen fetalen Pankreas <ol><li> Man löst 5 mg Kollagenase RT XI in HBSS auf eine Endkonzentration von 2,5 mg / ml zu ergeben. Filter sterilisieren die Lösung mit einem 0,22 Mikron-Spritzenfilter in ein steriles (autoklaviert) Szintillationsfläschchen und bei 4 ° C In einer Gewebekultur Kapuze, Set aus 2 sterile Petrischalen, eine sterile kleinen Tiegel (wenn ein Schmelztiegel nicht verfügbar ist, ein kleines Becherglas substituiert sein kann), sterilisierte Schere und Pinzette. 2 ml HBSS auf eine Petrischale, um die Bauchspeicheldrüse zu waschen. Absaugen von Flüssigkeit aus dem Röhrchen, das die fötalen Pankreas, so dass etwa 1 ml. </li><li> Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette in die 60 mm Petrischale ohne HBSS. Für diese Experimente werden fetale ICCs aus frischen Pankreas mit Schwangerschafts Alter von 9 bis 23 Wochen erzeugt. Isolierung von Pankreas bei früheren gestionational Alter ist schwierig, aufgrund der Größe der Bauchspeicheldrüse. Das Protokoll ist wahrscheinlich für Schwangerschaftsalter über 23 Wochen, jedoch Nahme von pancreata nach dieser Zeit ist wegen der Bundes (US) schwierig wäre. Gelegentlich kommt der fötalen Pankreas mit Milz, Fett oder Bindegewebe aus der ursprünglichen Präparation befestigt. Die zusätzliche Gewebe ist leicht mit dem bloßen Auge sichtbar und sollte aus der Bauchspeicheldrüse, bevor das Protokoll entfernt werden. </li><li> Spülen der Bauchspeicheldrüse in einem minimalen Volumen von kaltem HBSS (~ 0,5 ml) in die Petrischale. </li><li> Bewegen Sie die gereinigten Bauchspeicheldrüse zu dem kleinen sterilen Tiegel mit Hilfe einer sterilen Pinzette und in einen Eiskübel. Dann wird der Tiegel in einem Halter für ein 50 ml-Zentrifugenrohr und mit 2 Scheren, kräftig Scheibe der Bauchspeicheldrüse für einige Minuten. (In der Regel 2-5 min, aber die Zeit ist abhängig von der Größe und Festigkeit des Gewebes). Schnitt-Technik ist wichtig. Halten einer Seite der Schere in einer festen Position bewegt nur die gegenüberliegenden Griffen. Die Spitzen der Schere sollte auf dem Boden des Tiegels liegen. Fahren Sie mit schnellen Scherenbewegung auf die Bauchspeicheldrüse in kleine PauseStück. Je kleiner die Gewebestücke, desto besser die Kollagenase wird funktionieren. </li><li> 1,5 ml HBSS + den zerkleinerten Bauchspeicheldrüse, das Fläschchen mit dem Kollagenase und in einem Wasserbad Schüttler bis 37 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute bis zu 10 min. Sie häufiger als einmal während der ersten 5 min nicht zu überprüfen. Aufschlußzeit hängt von der Qualität des Gewebes kann so wenig wie 6 min ausreichend sein. Der Endpunkt ist, wenn die Teilchen klein und einheitlich. </li><li> Füllen Sie das Fläschchen (10-15 ml) mit kaltem HBSS die Kollagenase-Aktivität zu stoppen. Zeigen auf Eis und ermöglichen die Klumpen für 10 Minuten absetzen. Oft an dieser Stelle einige Zelltod ist aufgetreten und DNA wird in den Medien veröffentlicht. Dies kann der Medien &quot;strähnig&quot; zu machen; in diesem Fall wird mit 100 ul DNase (10 mg / ml Stamm) zu der Lösung. </li><li> Nachdem das Gewebe in der Szintillationsfläschchen wurde für 10 min, absaugen der oberen Schicht so dass es etwas weniger als halb voll (7-8 ml) angesiedelt. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen5 ml HBSS. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g. </li><li> Saugen Sie den HBSS und die Zellen resuspendieren in 5 ml Medium RPMI-1640, Glutamax, 10% normalem Humanserum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, Penicillin / Streptomycin und Fungizon. Platte auf 60 mm Petrischale. Für die Forscher versuchen, β-Zellen zu erzeugen, fügen HGF (10 ng / ml final) zu den Medien. Zusätzlich kann eine Anzahl von Gruppen haben gezeigt, dass die Ergänzung des Kulturmediums mit der Inkretinhormon GLP-1 erhöht auch β-Zellen 28. Zellen sollten in Suspension für 72 Stunden zu aggregieren und bilden ICCs gelassen werden. </li><li> Nach 72 Stunden in Suspension können die Zellen auf der Matrix der menschlichen Zelllinie HTB9 Matrix, wie zuvor beschrieben 29 plattiert werden. Unabhängig von den Wachstumsbedingungen sollten die Medien alle 48 Stunden gewechselt werden. </li></ol> 2. Immunfluoreszenz der Marker der Zellproliferation und Endokrine Reifung in ICCs in Suspension gezüchtet, Monolayer oder auf Glasdeckgläser <ol><li> Um die Zellproliferation zu messen, wird BrdU-Markierung entweder adhärenten Zellen oder Zellen in Suspension für 12 h vor der PFA-Fixierung durchgeführt. BrdU Reagenz 1:100 verdünnt und Filter in RPMI-1640-sterilisiert, Glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, Penicillin / Streptomycin und Fungizon. </li><li> Für Zellen in Suspension: Zentrifugieren für 5 min bei 300 × g und saugen Kulturmedium. 10 ml PBS, um die Chipkarten für 5 min bei 300 g waschen und saugen, Zentrifuge. Wenn die Chipkarten gehen in Paraffin eingebettet werden, folgen Sie bitte Fakultativprotokoll 3,1-3,17 Für adhärenten Zellen:. Entfernen Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit PBS wie oben beschrieben. Fix-Zellen für 20 min mit 4% PFA bei RT, dann zweimal mit PBS waschen. An diesem Punkt können die Platten mit Parafilm eingewickelt und in PBS bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert werden. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min bei RT. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und gelten Blockierungspuffer (2% tunNTaste Serum, 2% Rinderserumalbumin, 50 mM Glycin in PBS) für 1 h verdünnt. Waschen Sie die Zellen mit Arbeitspuffer (Blockierungspuffer verdünnt 1:10). Verdünnen Sie die Antikörper in Arbeitspuffer. Für Zellen auf Deckgläschen gewachsen, verdünnte den Antikörper in 60 ul Gesamtvolumen. Für Zellen in einer 6-Well-Platte verdünnt man das Antikörper in 600 &amp;mgr; l Gesamtvolumen. Um mehrere Epitope Fleck kann ein Cocktail aus Antikörpern angewendet werden. Als Kontrolle verwendet IgG oder vorgeImmunSerum anstelle des spezifischen Antikörpers. Kontrollproben sind mit Kontroll-IgG von derselben Spezies inkubiert, wie der primäre Antikörper verwendet werden. </li><li> Inkubieren des primären Antikörpers entweder 1,5 h bei RT und O / N bei 4 ° C. Saugen Sie den primären Antikörper und 3x waschen mit Arbeitspuffer bei RT. </li><li> Verdünnen Sie die sekundären Antikörper bei 1:200 für Rhodamin und FITC konjugierte Antikörper, 1:500 - 1:1000 für die Alexa konjugierten Antikörpern. Es ist wichtig zu beachten, dass alle Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Decken Sie die ProbenAluminiumfolie, um den Verlust des Signals zu verhindern. Inkubation für 1 h bei RT. Optional: Um die Kerne zu visualisieren, DAPI können 1:500 während der zweiten Inkubation hinzugefügt werden. Dies ist nützlich zur Quantifizierung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation. </li><li> Saugen Sie den sekundären Antikörper und waschen 3x mit Arbeitspuffer bei RT. Für Zellen, die auf einem Deckglas aufgewachsen, heben das Deckglas mit einer Pinzette, während im Puffer eingetaucht; waschen Sie es durch das Eintauchen in PBS. Für Zellen in einer 6-Well-Platte gewachsen, fügen PBS zu waschen und absaugen. An diesem Punkt sind sie bereit, unter einem inversen Mikroskop zu untersuchen. </li><li> Berühren Sie den Rand des Deckglases vorsichtig auf einer Kimwipe von überschüssigem PBS loszuwerden. Fügen Sie einen Tropfen Montage Gel auf einem Glasobjektträger und Deckglas invertieren die auf die Folie. Überschüssiges Montage Gel durch Aspiration. Tippen Sie auf das Deckglas vorsichtig mit der Rückseite einer 200 ul Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen. </li><li> Trocken bei Raumtemperatur für etwa 20 Minuten oder O / N bei 4 ° C und untersuchen unter einem fluorescent oder konfokalen Mikroskop. </li></ol> 3. (Optional) Immunfluoreszenzfärbung von Proteinen aus Paraffin eingebettet ICCs <ol><li> Bereiten Sie einen 3% igen Lösung und abkühlen lassen auf 55-60 ° C </li><li> Übertragung der ICCs in Suspension zu einer 15 ml konischen Röhrchen inkubiert und zentrifugiert bei 1500 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Zellen und fixieren mit 500 ul 4% PFA für 10 min bei RT. Verwenden Sie nicht das Pellet, es sei denn, das Pellet ist sehr groß. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 750 ul PBS. Wie die 4% PFA, werden diese Abfälle als gefährlich einzustufen und sollten gemäß den gefährlichen Abfällen Spezifikationen Ihrer Einrichtung entsorgt werden. </li><li> Flick vorsichtig das Zellpellet nach unten die Wand der 15 ml konischen Röhrchen lösen und fügen 150-200 ul der Agarose. </li><li> Mischen Sie durch leichtes Schwenken der Röhre, aber keine Blasen bilden. </li><li> Lassen bei 4 ° C für 5-10 min verfestigt. </li><li> Verwenden Sie eine 21 G Nadel zu verdrängenund das Pellet in ein frisches 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Paraffineinbettung und die Vorbereitung der Abschnitte auf Objektträger können vor Ort mit Hilfe eines Mikrotoms oder durch Ihre Kern Mikroskopie Einrichtungen durchgeführt werden. </li><li> Entparaffinieren Gewebe, Hydrat und mit Wasser schnell. </li><li> Mit 0,2 M Glycin für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um das restliche Aldehydgruppen zu quenchen. </li><li> Zweimal Waschen Sie die Objektträger mit PBS für 2 min je. </li><li> Für Antigen-Retrieval, bringen 10 mM Citratpuffer (pH 6,0) über Kochplatte zum Kochen bringen. Tauchen Sie die Folien in der Puffer, warten, bis es wieder zum Kochen zu kommen, und warten Sie 15 min. </li><li> Das Becherglas von der Heizplatte. Wartezeit von ca. 40 min für die Folien, die im Puffer zu kühlen. </li><li> Waschen Sie die Folien mit H 2 O für jeweils 5 Minuten, waschen Sie die Folien zweimal mit PBS für jeweils 5 min, blockieren mit 2% n Esel-Serum in PBS für 1 Stunde. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper, um die korrekte Konzentration im Arbeitspuffer, enthaltend 0,2% Triton X-100 verdünnt.Im allgemeinen wird der primäre Antikörper über Nacht inkubiert wenn Anfärben für Transkriptionsfaktoren und für 1,5 h bei Anfärbung für Hormone, Marker der Proliferation und / oder Differenzierung. </li><li> Folgen Sie den Schritten 2,3-2,9 oben beschrieben. </li></ol>

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D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen es, ICCs aus humanen fötalen Pankreas Bild und anschließend für Marker der Zellproliferation und der Bauchspeicheldrüse Endoderm zu erzeugen. Der Prozess der menschlichen fetalen Pankreas Dissoziation benötigt etwa 90 min, gefolgt von einem 72 Stunden Zeitraum ICC Bildung, einem Ansatz, der wesentlich von Protokollen β Zellvorläuferzellen aus der Maus zu isolieren ist. Die hier vorgestellte Protokoll bietet eine reproduzierbare Methode, die die Forscher menschlichen fetalen Pankreas-Entwicklung zu erkunden. Zwei unterschiedliche Typen von Langzeitstudien durchgeführt werden. Erstens kann das Potential an funktionellen Pankreaszelltypen (Gangzellen exokrine Zellen und Hormon-positive Zellen) aus verschiedenen Schwangerschaftsstadien erzeugen nach der Transplantation geprüft. Zweitens kann ICCs aus einer Schwangerschaftsdauer in Kultur gezüchtet werden, mit ausgewählten pharmakologischen Mitteln behandelt und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Kultur ICC transplantiert, um Unterschiede zu erforschenin Zellschicksal. Mit den enormen Anstrengungen derzeit auf hESC Differenzierung in Insulin produzierenden Zellen gerichtet sind, sind die Probleme mit der Insulin-Sekretion in Reaktion auf physiologische Reize assoziiert wieder neu belebt. Menschen ICCs bieten eine einzigartige Modellsystem, um diesen kritischen Aspekt der fetalen Pankreas-Zellproliferation und β-Zell-Entwicklung zu untersuchen. Wie bei jedem Protokoll, um Zellen aus Geweben isolieren, Details sind entscheidend für den Erfolg. Eine Anzahl von Parametern sind leider nicht der Kontrolle des Laborpersonals Durchführung des Experiments. Zwei Probleme von diesem Labor gestoßen sind schlechte Qualität des Ausgangsmaterials und der Lieferung nicht Pankreasgewebe. Gesunde fetale Pankreasgewebe ist fest an einen Scherenschnitt. Wenn die Gewebeschnitte zu leicht, es ist ein Zeichen, dass die Enzyme der Bauchspeicheldrüse haben begonnen, die Bauchspeicheldrüse selbst verdauen. Von diesem gibt es leider keine Erholung und der Vorbereitung ist am besten aufgehoben. Selten wird ein inerfahrenen Techniker Entfernen der Bauchspeicheldrüse Abschnitte des Darms für die Bauchspeicheldrüse zu verwirren. Diese Proben werden viel mehr Elastizität als ein Bauchspeicheldrüse haben und eine bemerkenswerte Lumen wird anwesend sein. Auch hier sollten diese Proben verworfen werden. Wenn das Protokoll oben wie beschrieben gefolgt, gibt es nur selten alle Probleme, die die Isolation aus der Bahn werfen entstehen. Ein paar Punkte zu beachten, um einen reibungslosen Isolation zu gewährleisten sind, um scharfe Schere für präzisen Schneid Bauchspeicheldrüse zu verwenden und sicherzustellen, dass jede Gewebeprobe zu groß, um zu verdauen nicht verlassen. Wenn die Schnitte sind nicht klein genug ist, dann ist die Kollagenase nicht effizient arbeitet, und nur wenige ICCs gebildet werden. Umgekehrt, wenn Sie eine neue Charge von Kollagenase, mit einem ähnlichen Niveau zu starten, wenn IE (Internationale Einheiten) für die Verdauung wie zuvor verwendet. Jedoch verringern die Inkubationszeit, um sicherzustellen, dass über die Verdauung nicht auftritt. Diese Fehler Technik stellt sicher, dass die IU-Label nicht signifikant variieren von Charge zu batch. In der Perspektive genommen, ist diese Technik für die Isolierung von humanen fötalen ICCs im Bereich relativ Standard. Die meisten Labors bestätigt unsere Ergebnisse, dass die Zugabe von HGF an die Medien hilft den Zellen überleben und sich vermehren 33. Zusammenfassend haben wir eine Methode, um menschliche fötale ICCs frischen Pankreas mit Schwangerschafts Alter von 9 bis 23 Wochen zu isolieren entwickelt. Die Zellen als Monoschicht oder in Suspension für Experimente zur endokrinen Pankreastranskriptionsfaktoren und Humaninsulin visualisieren gezüchtet werden.

Eine primäre Beschränkung auf Zellbasis Insulin-Ersatz-Therapien bei Typ-1-Diabetes ist der Mangel an menschlichen Inselzellen für die Transplantation zur Verfügung. Die Fähigkeit, die Proliferation und Differenzierung von humanen Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin-produzierende Zellen, die die Stoffwechselanforderungen eines Insulin-Mangelzustand zu erfüllen regulieren bleibt ein wichtiger Baustein für eine zellbasierte Therapie zur Behandlung von Typ-1-Diabetes. Bis zum Aufkommen der HES abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen, menschliche fötale endokrinen Pankreaszellen oder deren Vorstufen, wurden als potentielle Quellen von Zellen zur klinischen Transplantation angesehen. Obwohl die wissenschaftlichen und regulatorischen Landschaft hat sich in den letzten Jahren verändert, es bleibt eine lebenswichtige Notwendigkeit zu verstehen, wie der menschliche fetale Bauchspeicheldrüse entwickelt. Viele sehen jetzt therapeutische Verwendung von menschlichen fetalen Zellen als unwahrscheinlich, aber wenn wirksame und sichere Methoden, um die Zellen zu erweitern wurden gegründet, therapeutische Anwendung dieser Zellen könnte again erkundet werden. Eine große Hürde, die bleibt, ist, dass in vitro-Transformation von menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse Aggregate (ICC) in Glukose reagieren, ist Insulin sezerniere endokrinen Zellen derzeit ein ineffizienter Prozess. Obwohl viel Arbeit in fast 30 Jahren hat sich aufgeklärt, und skizziert das Expressionsprofil von Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung des endokrinen Pankreas erforderlich, gibt es weiterhin Lücken in unserem Wissen über die zeitliche Expression von Transkriptionsfaktoren reguliert wird und die Zellfunktion zusammen. Bis zum Aufkommen der HES abgeleiteten Insulin-produzierenden Zellen, menschliche fötale endokrinen Pankreaszellen oder deren Vorstufen, wurden als potentielle Quellen von Zellen zur klinischen Transplantation angesehen. Obwohl die wissenschaftlichen und regulatorischen Landschaft hat sich in den letzten Jahren verändert, es bleibt eine lebenswichtige Notwendigkeit zu verstehen, wie der menschliche fetale Bauchspeicheldrüse entwickelt. Viele sehen jetzt therapeutische Verwendung von menschlichen fetalen Zellen als unwahrscheinlich, aber wenn effektiveund sichere Methoden erweitern die Zellen wurden gegründet, konnte die therapeutische Verwendung dieser Zellen wieder erkundet werden. Eine große Hürde, die bleibt, ist, dass in vitro-Transformation von menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse Aggregate (ICC) in Glukose reagieren, ist Insulin sezerniere endokrinen Zellen derzeit ein ineffizienter Prozess. Obwohl viel Arbeit in fast 30 Jahren hat sich aufgeklärt, und skizziert das Expressionsprofil von Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung des endokrinen Pankreas erforderlich, gibt es weiterhin Lücken in unserem Wissen über die zeitliche Expression von Transkriptionsfaktoren reguliert wird und die Zellfunktion zusammen. Vor kurzem hat die Stammzellfeld das angesammelte Wissen über zeitliche Transkriptionsfaktor-Expression während der Insel Entwicklung eingesetzt, um die Produktion von Zellen, die die Marker der reifen endokrinen Zellen exprimieren zu fahren. Obwohl Entstehung der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Zellen (iPS) hat erhebliche gemacht undbedeutende Fortschritte in den letzten Jahren sind die wirksamsten Protokolle erfordern zwei verschiedene Differenzierungsphasen: 1) ein früher in vitro Differenzierung zu Zellen, Pankreas-Vorläufertranskriptionsfaktoren, gefolgt von 2) in vivo Reifung nach der Transplantation zu erzeugen - eine sogenannte &quot;Black Box &quot;Zeit. Um voranzukommen, Fortschritte im Verständnis der Biologie zugrunde liegenden Insel Reifung in vivo, unabhängig von der Zellquelle, muss in einem biochemischen Ebene verstanden werden. Die Ähnlichkeit zwischen den mit ICCs und HES erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine Reihe von kritischen biochemischen Prozesse, die den Übergang von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen in reife, Glucose reagiert, Insulin sekretierenden Zellen in vitro zu regulieren unbekannt. Ein zentraler Teil dieses Verständnisses wird es sein, neue Methoden zu entwickeln, um funktionelle endokrine Zellpopulationen aus Pankreas-Vorläuferzellen ableiten und hESC wird nicht nur biochemische ca. erfordernoaches, die die Reifung Ereignisse, sondern Methoden, um die Änderungen zu analysieren aufzuklären. Warum glauben wir, dass die Abbildung menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse ist ein kritischer Aspekt der Identifizierung Veränderungen im Insel Reifung? Die Antwort liegt zum Teil in der historischen Aufgabe, Insulin produzierende Zellen zu erzeugen. Beide Modell-und Gewebekultursystemen für Pankreas-Vorläufern und Inselchen haben Forschern erlaubt, die wesentlichen Unterschiede, die zwischen Reifung von Tier-und Menschen Inselchen Inseln in vitro vorhanden erkunden. Eine Beschränkung auf die Erforschung des menschlichen fetalen Pankreas Entwicklung ist, dass die Schwangerschaftsalter, die legal eingesetzt werden können, nur die zu heterogenen Zellaggregate. Obwohl die isolierten fötalen menschlichen Zellen ähneln Inselchen, Färbung nach in vitro-Kultur von Schwangerschaftsalter 9-23 Wochen zeigt weniger als 15% enthalten Marker für endokrine Zellen, wobei die meisten Zellen nicht-Färbung für die Inselhormone. Jedoch nach der Transplantation undvivo Reifung, eine große Mehrheit der endokrinen Zellen exprimieren Marker 6,25. Die Ergebnisse aus diesen Studien werden heute mit hES Differenzierungsprotokolle, die nur in der Lage, bescheidene Populationen von Einzel Hormon positiven endokrinen Zellen generieren hallte nach in vitro Differenzierung. In-vitro-Methoden, um Populationen von Hormon-positiven Zellen verbessern wird wahrscheinlich einen Einblick in in-vivo-Insel Reifung. Darüber hinaus, das Verständnis der molekularen Ereignisse, die menschlichen fetalen Pankreas-Entwicklung treiben wird wahrscheinlich Bemühungen um Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen ableiten und weiter abzugrenzen, die Mechanismen, die Zellregeneration und β Pankreaszelle Transdifferenzierung regulieren zu verbessern. Die Ähnlichkeiten zwischen menschlichen fetalen Pankreas-Zellreifung und hES-Zell-Funktion kann verlängert werden. Wie murine Zellen, sowohl menschliche fötale Zellen und differenzierte hES Insulin nicht in Reaktion auf Glukose freizugeben sindnach Inselneubildung in vitro 26,27. Jedoch nach Transplantation in Nacktmäusen und Reifung sowohl menschlichen Inseln wie Cluster und Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen zeigen eine endokrinen Phänotyp abgeleitet. Drei Monate nach der Transplantation, fast 90% der transplantierten Zellen entweder Bevölkerung Insulin positiv und normal zu funktionieren, wie durch die Freisetzung von C-Peptid 17,26 bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transplantation bietet Kontext und nicht identifizierte Signale, die Insel Reifung zu fördern. Optimierte Bildgebung Protokolle, wie das hier beschrieben wird, für den menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse wird bei der Suche nach Faktoren, die zu modulieren und zu beschleunigen Reifung identifizieren helfen. Grund biochemischen Erforschung der menschlichen fetalen Zellen der Bauchspeicheldrüse und hESC in Richtung einer endokrinen Linie differenziert in dieser Phase der Entwicklung ist für die Messung der Effizienz der Reifung. Das folgende Protokoll, in Figur skizzierte 1, stellt unsere derzeitigen Verfahren zur Isolierung von humanen fötalen Pankreaszellen, genannt ICCs aus ganzen menschlichen fötalen Pankreas-und Abbildungs ​​dieser Zellen. Dieses Protokoll erfordert eine anfängliche Herstellung von Zellen aus Gewebe, die anschließend als Monoschicht oder in Suspension gezüchtet werden können. Herstellung von Zellen für die Bildgebung von gebräuchlichen Markern von endokrinen Zellproliferation und Reifung beschrieben. Erzeugung und Darstellung von ICCs in Abwesenheit oder Gegenwart einer Vielzahl von chemischen Modifizierungsmitteln stellt ein schnelles Verfahren, verglichen mit Transplantationsmodellen, zur Identifizierung Kulturbedingungen und Verbindungen, die Reifung von humanen fötalen Pankreaszellen in voll funktions exokrinen, duktalen oder beschleunigen Hormon-produzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

Seit fast 30 Jahren haben Forscher gezeigt, dass menschliche fötale ICCs unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen transplantiert gereift in funktionierende endokrine Zellen, wie durch einen signifikanten Anstieg der zirkulierenden menschlichen C-Peptids nach Glucosestimulation 1-9 zeigt. Jedoch in vitro ist Genese der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen fetalen ICCs niedrigen 10; Ergebnisse erinnern an den letzten Experimenten mit humanen embryonalen Stammzellen (hES) durchgeführt, einer erneuerbaren Quelle der Zellen, die großen Versprechen als eine mögliche therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes zu halten. Wie ICCs, Transplantation von teilweise differenziert hESC generieren Glukose reagieren, Insulin produzierende Zellen, aber in vitro Entstehung der Insulin produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen ist viel weniger robust 17.11. Ein vollständiges Verständnis der Faktoren, die das Wachstum und die Differenzierung von endokrinen Vorläuferzellen beeinflussen erfordern wahrscheinlich Daten von beiden ICCs und er erzeugtSC. Während eine Reihe von Protokollen existieren, um Insulin-produzierenden Zellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in vitro 11-22, weit weniger gibt es für ICCs 10,23,24 generieren. Teil dieser Diskrepanz kommt wahrscheinlich aus der Schwierigkeit bei der Arbeit mit menschlichen fötalen Pankreas. Auf dem Weg zu diesem Zweck haben wir weiterhin auf den bestehenden Methoden zu bauen, um fetale Inseln aus menschlichen Bauchspeicheldrüsen mit Schwangerschafts Alter zwischen isolieren 12-23 Wochen wachsen die Zellen als Monoschicht oder in Suspension und Bild für die Zellproliferation, Pankreas-Marker und menschlichen Hormonen einschließlich Glucagon und C-Peptid. ICCs durch die unten Ergebnis in C-Peptid-Freisetzung nach der Transplantation unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen, die ähnlich wie C-Peptid-Werte durch die Transplantation von frischem Gewebe 6 erhalten sind beschriebenen Protokoll erzeugt. Obwohl die hier vorgestellten Beispiele konzentrieren sich auf den Pankreas Endoderm Proliferation und β Zellbildung, kann das Protokoll eingesetzt, um andere Aspekte der Pankreasentwicklung zu studieren, Einschließlich der exokrinen, duktalen und andere Hormon-produzierenden Zellen.

Sorgfältige Vorbereitung der fetalen ICCs ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Repräsentative Bilder, wie die Zellen aussehen typischerweise in definierten Zeiträumen nach der Beschichtung sind in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Reinigung werden die frisch vergoldet Zellaggregate erscheinen als kleine, karge klare Cluster, die wenigen Zellen (2A) enthalten. Nach der ersten 24 Stunden (2B), sind viele der Zellhaufen größer, aber zahlreiche kleine Cluster verbleiben. Nach 48 Stunden wurden die Cluster deutlich erweitert, bleiben aber asymmetrisch (Abbildung 2C). Nach 72 Stunden sollten die ICCs klar sein, relativ einheitliche Größe und Form (Abb. 2D). Es ist an dieser Stelle, dass die Zellen entweder auf Matrizen, wie HTB-9, 24 h vor der Immunfluoreszenz oder erlaubt, für weitere 72 h in Abwesenheit oder Gegenwart von Chemikalien oder Medikamente, die die Expression von Genen verändern können, wachsen plattierenden für endokrinen Pankreaszelle g erforderlicheneration. Abbildung 3 zeigt eine Reihe von häufig verwendeten Antikörper entweder ICC Proliferation oder Differenzierung in Richtung Pankreas Endoderm beurteilen. In 3A wurden ICCs an HTB-9 überzogen, für 4 Tage gezüchtet und für PDX1, einer kritischen Marker der Pankreasentwicklung gefärbt. Obwohl in vitro-Färbung von ICCs wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, häufiger menschlichen fötalen ICCs unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen transplantiert und erlaubt, zu proliferieren und zu differenzieren in vivo 6,9,30-32. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Transplantation werden die Mäuse getötet und die Nieren, die die transplantierten ICCs wird entfernt, in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Sequential 5 um Abschnitte werden entweder vor Ort mit Hilfe eines Mikrotoms oder durch einen Kern-Mikroskopie-Anlage erzeugt. Epitop-Demaskierung und Färbung von Proteinen aus Paraffin eingebetteten Gewebe für Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist in Fakultativprotokoll von 3,10 bis 3 beschrieben.. 17. In 3B wurden transplantiert ICCs mit der epithelialen Zellmarker Cytokeratin pan (PanCK, grün) gefärbt und mit Ki67 (rot), die Zellproliferation zu beurteilen. In einem anderen Beispiel wurden sowohl Humaninsulin (grün) und Glucagon (rot) nach der Transplantation und die Reifung unter die Nierenkapsel einer nackten Maus (3C) festgestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Flussdiagramm des menschlichen fetalen ICC Vorbereitung und Färbung für Immunfluoreszenz. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Repräsentative fötalen ICCs Zubereitung 0, 24, 48 oder 72 Stunden nach dem Plattieren. (A) ICCsin Suspension wurden sofort nach der Plattierung abgebildet wird, (B) 24 Stunden nach der Plattierung, (C) 48 Stunden nach dem Ausstreichen oder (D) 72 Stunden nach dem Ausplattieren. Maßstab für AC, 10-facher Vergrößerung = 300 um, Maßstab für D, 20 Vergrößerung = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> .. (; Grün pan-CK) und Proliferation (Ki67, rot), (C) Insulin Abbildung 3 Immunfluoreszenz von plattierten ICCs Routinemäßig werden ICCs für (A) des Pankreas Endoderm PDX1 Marker (grün), (B) endokrinen Zellen abgebildet (grün) und Glukagon (rot). Maßstab für AC, 40-facher Vergrößerung = 20 um.

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Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte.

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

14.0K Aufrufe.  University of California, San Diego.  Ein Protokoll zur Isolierung und Kultur und Bildinselzellclustern (ICC) von humanen fötalen Pankreaszellen abgeleitet wird beschrieben. Die Methode beschreibt die erforderlich sind, um Chipkarten aus Gewebe, Kultur als Monoschichten oder in Suspension als Aggregate und Bild für Marker der Proliferation und Pankreaszellschicksal Entscheidungen erzeugen Schritte. 

Serie: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Forschung

Medizin

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Eine Maus fetalen Hautmodell von Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...