Dieses Protokoll ermöglicht es dem Forscher, die Aktivität und Reaktion einzelner sensorischer Neuronen auf eine kontrollierte Stimulation in intakten sich verhaltenden Wirbeln zu überwachen. Diese Patch-Elektrophysiologie ist eine schnelle und direkte Möglichkeit, die Spiking-Aktivität einzelner Neuronen in Echtzeit aufzuzeichnen. Und das bietet eine bessere Zeitauflösung und Empfindlichkeit zu geringeren Kosten als die meisten optischen Bildgebungstechniken.
Die seitlichen Haarzellen sind homolog zu denen des menschlichen Innenohrs. Diese Technik ist also bereit, die Eigenschaften von Haarzellkreisläufen aufzudecken, die für menschliche Taubheit und Hörstörungen gelten. Elektrophysiologie ist ein Handwerk mit Feinmotorik, das gesehen und physisch nachgeahmt werden muss.
Nur Textanweisungen lassen zu viel Raum für Fehlinterpretationen. Geben Sie zunächst eine dünne Schicht aus selbstmischendem Silikonelastomer wie Sylgard in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, um eine Silikonelastomer-Bodenaufnahmeschale herzustellen. Um Sezierstifte herzustellen, stellen Sie einem 100-Milliliter-Becherglas von Etchant mit einem DC-Netzteil eine negative Ladung von fünf Volt zur Verfügung und befestigen Sie einen Wolframdraht an den positiv geladenen Ausgang.
Tauchen Sie die Spitze des Drahtes wiederholt in das Etchant-Bad, bis sich die Spitze zu einem scharfen Punkt verengt. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den Draht etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt mit einer rasiermesserscharfen Klinge mit gerader Kante. Wiederholen Sie dies dreimal und stecken Sie dann die Stifte mit einer feinen Pinzette in die ausgehärtete Aufnahmeschale.
Um Aufnahmeelektroden vorzubereiten, ziehen Sie Borosilikatglaskapillarröhren mit einem Mikropipettenzieher mit Boxfilament. Die Elektrode sollte eine Spitze mit einem Durchmesser von 30 Mikrometern und einer Verjüngung haben, mit der affelinete Neuronen aus der hinteren Seitenlinie aufgezeichnet werden. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern von einem bis fünf Mikrometern.
Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um die Spitzen zu brechen. Polieren Sie die abgeschränkte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist. Der endgültige Spitzendurchmesser sollte zwischen 30 und 50 Mikrometern liegen.
Immobilisieren Sie Zebrafischlarven und übertragen Sie sie mit einer großen Spitze in eine 35-Millimeter-Petrischale, um die Pipette zu übertragen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der umgebenden Lösung. Tauchen Sie larven Sie für etwa fünf Minuten in 10 Mikroliter 0,1% alpha-Bungarotoxin.
Waschen Sie die gelähmte Larve mit extrazellulärer Lösung für 10 Minuten. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die Larve aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Aufzeichnungsschale mit Silikonboden zu bewegen. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinspitzigen Zette über der Mitte dieser Silikonmatte, seitlich mit den vorderen und hinteren Enden des Körpers, die von links nach rechts verlaufen.
Mit einer feinspitzigen Pinzette den Kantenstift orthogonal durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus einführen. Führen Sie den zweiten Stift durch das Notochord in der Nähe des Schwanzendes ein und führen Sie den dritten Stift durch den Notochord dorsal der Gasblase ein. Setzen Sie den vierten Stift durch das Otikvesikel ein, während Sie eine leichte Drehung bereitstellen, wenn der Stift in die Kapselung einführt.
Wenn eine leichte Rotation angewendet wird, achten Sie auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um die Ansammlung von afferenten Somata freizulegen. Legen Sie die Stiftlarve unter das 10-fache Objektiv auf eine feste Stufe des DIC-Mikroskops und richten Sie die miozepalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Kopfstadiumvektor aus. Legen Sie den Erdungsdraht in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass er mit der linken Kopfstufe verbunden ist.
Füllen Sie die VR-Aufnahmeelektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung unter Verwendung einer flexiblen Gel-Loading-Pipettenspitze und führen Sie sie in den linken Kopftischpipettenhalter ein. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und senken Sie die Aufzeichnungspipette in die Schalenlösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird. Bringen Sie die Elektrodenspitze über ein Myoseptum zwischen den beiden Myomeren ventral zur Seitenlinie, bis die Spalte in der VR-Elektrodenspitzenöffnung zentriert ist Senken Sie die Pipette, bis die verzögerte Kante der Spitzenöffnung das Epithel sanft berührt.
Manövrieren Sie die Pipette nach dem ersten Kontakt diagonal, um sicherzustellen, dass die Vorderkante Kontakt herstellt und eine Dichtung erzeugen kann. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten. Klicken Sie in der Patch-Clamp-Software auf die Schaltfläche Play in der Symbolleiste, um das VR-Signal zu überwachen.
Stellen Sie sicher, dass die VR-Aufzeichnung erreicht wird, sobald die Motoneuronaktivität mit der stereotypen Burst-Signaldynamik von Wells beobachtet wird. Füllen Sie die afferenten Aufzeichnungselektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung und führen Sie sie in den rechten Kopftischpipettenhalter ein. Senken Sie es dann in die Spüllösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Messumformer erzeugt wird.
Suchen Sie die Elektrode und bringen Sie die Elektrodenspitze über die Probe. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferentielle Elektrodenspitze ab, bis sie die Position über dem Cleithrum hält. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache Eintauchen und lokalisieren Sie den Schnittpunkt des hinteren Seitenliniennervs und des Cleithrums.
Bringen Sie die Elektrodenspitze über das afferenten Ganglion und senken Sie die Pipette, bis die Spitze das Epithel kontaktiert. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das affente Ganglion kontaktiert. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.
Nachdem Sie in der Patch-Clamp-Software auf Play geklickt haben, stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle lose Patch-Aufnahme von afferenten Neuronen erreicht wird, wenn Spikes spontan etwa alle 100 bis 200 Millisekunden auftreten. Sobald sowohl die Aktivität unterschiedlicher Neuronen als auch der Motoneuronen erkannt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen auf der Symbolleiste in Peak Clamp 10, um gleichzeitig lückenlose Aufnahmen in beiden Kanälen aufzunehmen. Führen Sie die Datenvorverarbeitung wie im Textmanuskript beschrieben durch.
Mit diesem lückenlosen Aufzeichnungsprotokoll kann die Echtzeitaktivität von afferenten und VR-Neuronen gleichzeitig gemessen werden. Benutzerdefinierte Skripte mit Vorverarbeitung generieren Diagramme, um die Visualisierung der Spike-Erkennung mithilfe von Parametern wie Schwellenwert, Mindestdauer und minimalem Interspike-Intervall zu unterstützen. Isolierte Signale wurden durch Anpassung der Erkennungsvariablen für die Unter- und Obergrenze im Vorverarbeitungsskript erhalten.
Die Erkennung ventraler Wurzelspitzen folgt identischen Parametern mit zusätzlichen Eingängen. Bursts innerhalb eines Motorbefehls werden durch mindestens zwei Spikes innerhalb von 0,1 Millisekunden definiert, die mindestens fünf Millisekunden dauern und durch mindestens drei Bursts mit Interburst-Intervallen von weniger als 200 Millisekunden abgegrenzt werden Vorverarbeitungsskripte überlagern Abschnitte unterschiedlicher Aktivität, die in einem genau definierten Zeitraum von Interesse eingegeben wurden. In diesem Fall zeigt die mittlere spontane Aktivität dramatische Veränderungen als Reaktion auf den Beginn der motorischen Aktivität, die auf der X-Achse als Zeit gleich Null dargestellt wird.
Signifikante Unterschiede wurden in den afferenten Spike-Raten zwischen den Spike-Raten vor dem Schwimmen und den Spike-Raten sowohl der Schwimm- als auch der Post-Swim-Perioden festgestellt. Afferenten Spike-Raten waren negativ mit der Schwimmdauer korreliert. Es wird keine Korrelation zwischen relativer Spitzenrate und Schwimmfrequenz festgestellt.
Tiergesundheit ist das Wichtigste, wenn Sie versuchen, dieses Verfahren zu versuchen. Es ist wichtig, den schnellen Blutfluss zu überwachen, um nicht nur das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten, sondern auch die Wahrscheinlichkeit eines neuronalen Aufzeichnungserfolgs zu erhöhen. Durch die Nutzung genetischer Werkzeuge, die in Zebrafischen verfügbar sind, kann dieses Elektrophysiologie-Protokoll durch transgene Linien ergänzt werden, um die Konnektivität anatomischer und funktioneller Schaltkreise in Haarzellsystemen und darüber hinaus leistungsfähig zu untersuchen.
Diese vereinfachte Modifikation der Patch-Clamp-Technik ermöglicht es uns, zu überwachen, wie sensorische Systeme in vivo funktionieren.
