Dieses Projekt wurde vom Land Baden-Württemberg sowie von der Europäischen Union, Europäischer Fonds finanziert für sterben Regionale entwicklung. Die Autoren danken Rainer Wittig (ILM Ulm) für die Bereitstellung der U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Zelllinie und Claudia Hintze für geschickte technische Hilfe.

1. Zell Sphäroid wächst und Inkubation <ol><li> Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert <ol><li> Bereiten Agarose 1,5% im Kulturmedium durch Zugabe von 0,45 g Agarose auf 30 ml Kulturmedium (ausreichend für 6 Platten). </li><li> Das Gemisch aus Schritt 1.1.1 auf mindestens 80 ° C unter Rühren von Zeit zu Zeit. </li><li> Füllen Sie 50 ul der erhitzten Mischung aus Schritt 1.1.2 in jedes Well einer 96-Well-Platte und lassen Sie es in 1-2 Stunden fest werden. Lagern Sie die Platten geschlossen und abgedeckt im Kühlschrank bei 5 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Samen etwa 150 MCF-7-Brustkrebszellen in jeder Vertiefung der hergestellten Platte mit 96 Vertiefungen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit Ham F-12-Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin / Streptomycin . </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 3776, c. </li><li> Die Zell Sphäroide mit der Anthracyclin-Antibiotikum Doxorubicin-Hydrochlorid für 6 Stunden Inkubation bei einer Konzentration im Bereich zwischen 2 um und 8 um (in Kulturmedium) in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Die Zell Sphäroiden mit Kulturmedium oder Earle-Balanced Salt Solution (EBSS) vor der Mikroskopie zu waschen. </li></ol></li><li> Versuch 2: Oxidationsprozess in Sphäroiden eine Redox-Sensor zum Ausdruck <ol><li> Samen etwa 400 U251-MG-L106 Glioblastomzellen permanent mit der Glutathion-empfindliche grün fluoreszierenden Redoxsensor Grx1-roGFP2 in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) transfiziert einer 96-Well-Platte in DMEM Kulturmedium mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 ug / ml) ergänzt. </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Fügen Sie 10 &amp; #181; l Wasserstoffperoxid-Lösung (purum pa, ≥ 30%) auf 990 ul bi-destilliertem Wasser zu einer 100 mM Stammlösung zu schaffen, um innerhalb von 12 Stunden verwendet werden. </li><li> Von der Stammlösung aus Schritt 1.2.3 bis 50 um in EBSS direkt vor dem Experiment. </li><li> Während der Messung mit Wasserstoffperoxid 50 um EBSS zur Oxidation des Redox-Sensor die Zellkügelchen über das mikrofluidische System zu inkubieren. </li></ol></li><li> Versuch 3: Initiation und Kennzeichnung von zellulären Nekrose innerhalb Sphäroiden <ol><li> Samen etwa 400 Zellen (zB U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 Glioblastomzellen) in Agarose-Gel-beschichtete Vertiefungen (in Schritten beschriebenen Verfahren 1.1.1-1.1.3) einer Platte mit 96 Vertiefungen in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Hygromycin B (150 mg / ml). </li><li> Wachsen Sphäroide für 5-7 Tage bis zu einem Durchmesser von etwa 200-300 um in einem Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C liegt. </li><li> Inkubieren Sie die ZelleSphäroide mit der mitochondrialen Elektronentransportinhibitor Rotenon für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 uM in einem Kulturmedium, um zelluläre Nekrose induzieren. Die gleichzeitige Inkubation mit einem grünen Farbstoff Zytotoxizität für 3 Stunden bei einer Konzentration von 1 ul in 1 ml Kulturmedium zu nekrotischen Zellen zu markieren. </li><li> Mit Kulturmedium oder EBSS vor Mikroskopie Waschen Sie die Zell Sphäroiden. </li></ol></li></ol> 2. Lichtblatt Anpassung Hinweis: Zur Erzielung bester Ergebnisse ist darauf zu achten, dass die Strahltaille des Lichtblattes ist in der Fokusebene der Objektivlinse ist. Die Position der Strahltaille kann nur durch Beobachten der Lichtblatt in vertikaler Position in bezug auf die Kapillare ausgerichtet werden (siehe Schritte 2,5-2,8). <ol><li> Verwenden Sie ein inverses Mikroskop und montieren Sie die SPIM Anregung Modul, wie in Lit. beschrieben. 16 an der Grundplatte des Positionierungstisches (siehe Abbildung 1a). </li><li> Rüsten Sie das Mikroskop mit einer 10X / 0,3 oder 20x / 0,5 Mikroskopobjektivlinse und ein geeignetes Tiefpassfilter (beispielsweise λ ≥ 515 nm) in dem Detektionspfad des Mikroskops. </li><li> Halterung eine integrierende Kamera auf den Detektionsanschluss des Mikroskops. </li><li> Eine parallele kollimierten Strahl eines Lasers oder einer Laserdiode mit einer Anregungswellenlänge von vorzugsweise 470 nm und es auf dem SPIM Modul. </li><li> Drehen die Zylinderlinse von 90 Grad, die das Licht Blatt in einer vertikalen Position für eine axiale Einstellung der Strahltaille des Lichtbogenüber. </li><li> Platzieren einer Kapillare eine Flüssigkeit mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der in den Probenhalter enthält. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Kapillare, so dass er zentriert ist und die Strahltaille des Lichtblattes im Fokus ist. </li><li> Einstellen der Strahltaille durch Veränderung der axialen Position der Zylinderlinse sich. Drehen Sie die Linse nach Anzeigenstellung. </li></ol> 3. Zell Sphäroid Anwendung und Mikroskop-Feed Synchronisation <ol><li> Küvette Sphäroide einzeln oder in Gruppen in dem rechteckigen Borosilikatglas Kapillaren 16 mit einem Innenquerschnitt von 600 um x 600 um und einer Wanddicke von 120 um. Zwei Verfahren für die Anwendung eines Zell-Sphäroiden haben sich als erfolgreich erwiesen. <ol><li> Nehmen Sie die leeren Kapillare senkrecht mit Daumen und Mittelfinger und dichten die obere Öffnung mit dem Zeigefinger. Bringen Sie die untere Öffnung in der Nähe der Zell-Sphäroiden in seiner Umgebung Flüssigkeit (EBSS oder Kulturmedium). Lassen Sie den Zeigefinger von der oberen Öffnung. Flüssigkeit mit der Zell-Sphäroiden in sie sofort durch Kapillarkräfte eingeweicht werden. Einstellen der Position des Sphäroids innerhalb der gefüllten Kapillare durch Schwerkraft in den jeweiligen aufrechten Position der Kapillare. </li><li> Alternativ gelten die Zelle Sphäroid auf die Kapillare über Pipettieren. Achten Sie darauf, that die Öffnung der Pipettenspitze ist, die einerseits groß genug für das Sphäroid Größe und andererseits kleiner oder gleich groß wie der Innendurchmesser der Kapillare. </li></ol></li><li> Platzieren der Kapillare mit dem Sphäroid in ihm in einem speziellen Probenhalter für die Mikroskopie. </li><li> Befestigen des Probenhalters mit der Kapillare auf den Positionierungstisch des Mikroskops und richten die Position der Zell-Sphäroiden, daß sie zentriert und ausgerichtet. </li><li> Stellen Sie die Anpassung zwischen dem Lichtbogen und der Brennebene des Mikroskopobjektivlinse in dem Detektionspfad durch Einstellen der Position des Reflexionsspiegels und der zylindrischen Linse (siehe Einstellschraube in 1B). </li><li> Einstellen der Mikrometerschraube (siehe Figur 1B) entsprechend den Brechungsindices und der numerischen Apertur der Objektivlinse, um das Aquarium Effekt zu kompensieren. Anmerkung: verschiedene Brechungsindizes der Probe, und die sie umgebenden Medien ter die Objektivlinse zu einer Differenz zwischen der Verschiebung der Objektivlinse und der Verschiebung der Brennebene. Da der Lichtbogen wird durch die Objektivrevolver bewegt wird, wird die Fehlanpassung zwischen der Verschiebung des Lichtbogen (entsprechend der Verschiebung der Objektivlinse) und die Verschiebung der Fokusebene durch einen Hebelarm kompensiert (siehe Abbildung 1b). Die Mikrometerschraube wird verwendet, um den Abstand zwischen den oberen und den unteren Stift anzupassen, um die Verschiebung des Lichtbogens gemäß der numerischen Apertur der Objektivlinse und der Brechungsindizes ändern. </li></ol><img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. (A) Bild von der an der Grundplatte des Stelltisch von einem inversen Mikroskop montiert einzigen Ebene Beleuchtungsmodul, (B) Aufbau der einzelnen Ebene BeleuchtungModul und das Mikroskop Feed Synchronisation auf die Hebe-Mismatch (Aquarium-Effekt) zwischen Brennebene und Beleuchtungsebene auszugleichen. Az o zeigt die Verschiebung der Objektivlinse und Az f die Verschiebung der Brennebene und der Lichtbogen. Die Einlage zeigt Querschnitte von Sphäroiden enthält Kapillaren. Links: rechteckige Kapillare mit Innendurchmesser von 600 um (Wand 120 um). Rechts: Setup für die Rotation eingesetzt. Einen inneren runden Kapillare (Innendurchmesser 400 um, Außendurchmesser 550 um) in dem äußeren rechteckigen Kapillare gedreht. Der Raum zwischen den beiden Kapillaren mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist. 4. Messung in dynamischen flüssigen Umgebung HINWEIS: Die bisherige Protokoll wird für die statische Inkubation vor einer Messung, bei der die Zelle Sphäroid zuvor in der Kapillare durch einfache Gravitation inkubiert und dann an Ort und Stelle gehalten wurde verwendet. Es besteht keine Notwendigkeit für eine weitere Befestigungsauf. Für Messungen in strömenden Medien, in denen eine dynamische Inkubation und daher ist eine dynamische Umgebung wünschenswert Aufnahmekinetik messen, kann diese Unterprotokoll auszuführen. Schritte 4,5-4,9 sind entscheidend, um Luftblasen Erreichen der Probe zu vermeiden. <ol><li> Füllen der Kapillare mit FCS für 30 min später zelluläre Adhäsion einer Zelle Sphäroid mit dem inneren Glasoberfläche zu unterstützen. </li><li> Lassen die restlichen FCS Beschichtung im abgereicherten Kapillare austrocknen mindestens 12 Stunden. </li><li> Einführung der Zell-Sphäroiden in die FCS beschichtet Kapillare, wie in Schritt 3.2 beschrieben. </li><li> Verlassen die Kapillare im Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 2-4 h auf zelluläre Adhäsion des Sphäroids verursachen. </li><li> Den Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems (siehe Abbildung 2). Verwenden eine peristaltische Pumpe, um die Zuströmung des Schlauchs zu füllen (Innendurchmesser: 0,89 mm) mit Kulturmedium, das den Fluoreszenzfarbstoff, Arzneimittel oder Mittel. </li><li> Connect der Zustrom Teil des mikrofluidischen Systems zu einer Blasenfalle (siehe Abbildung 2). </li><li> Erste Klemme der Kapillare blasenfrei an den Zulauf Rohr und klemmen dann die andere Seite der Kapillare an der Ablaufschlauch. </li><li> Abstimmung der Temperatur der Flüssigkeit von dem Wasserbad zu dem gewünschten Wert (zB 37 ° C). </li><li> Einstellen der Schlauchpumpe auf die gewünschte Pumpengeschwindigkeit (zB Flußrate: 9 ml / min, Pumpengeschwindigkeit in der Kapillare: 25 mm / min). </li><li> Sammeln Sie die gepumpte Flüssigkeit entweder in einem Empfänger (Open-Loop-Setup), führen Sie es zurück zu seiner Quelle (Closed-Loop-Setup) oder führen Sie es direkt in den Schlauch der Schlauchpumpe (tight Closed-Loop-Setup). </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Mikrofluidik-Setup (Open-Loop-und Closed-Loop fest); Inlay: Beleuchtung eines spheroid innerhalb einer Mikro-Kapillare mittels Lichtbogen auf der Basis der Fluoreszenzmikroskopie zu einem inversen Mikroskop gekoppelt. 5. Datenerfassung und Auswertung <ol><li> Eingestellt, die Laserleistung und die Integrationszeit für die Bildaufnahme. </li><li> Achten Sie darauf, dass die in Schritt 5.1 festgelegten Parameter nicht Licht Dosiswerte etwa 50-100 J / cm 2 für native Zellen oder 10-20 J / cm 2 für Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff inkubiert oder mit einem fluoreszierenden Protein kodierenden Plasmid transfiziert nicht überschreiten Phototoxizität zu vermeiden (Details siehe Ref. 12). </li><li> Stellen Sie die Schrittweite für die Z-Stapel, um Az = 5-10 um was bevorzugt für 3-dimensionale Datenanalyse ist als das Licht Blechdicke etwa 10 um. </li><li> Führen Messungen von Einzelbildern oder Z-Stapel durch Variation der Brennebene innerhalb des Zell-Sphäroiden. </li></ol>

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Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. 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O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams.">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li><li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy.">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).</li><li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. 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Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vorliegende Manuskript beschreibt ein Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) Gerät, das für 3-dimensionale Zellsysteme optimiert ist, zB, mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). Drei beispielhafte Anwendungen umfassen (1) die Aufnahme eines Zytostatikums und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt (deren Beitrag zur chemotherapeutischen Wirksamkeit bleibt ausgewertet werden), (2) Messung des Redox-Zustand durch Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor auf Zugabe e...

Neben den gut etablierten Methoden (oder konfokalen Multi-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie 1-4, Structured Illumination Microscopy 5,6) Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) hat sich als eine wertvolle Methode der 3D-Bildgebung 7,8 sein, 9. Von besonderem Interesse ist die Anwendung eines 3-dimensionalen Zellkulturen, beispielsweise multizellulären Tumor-Sphäroide (MCT), die zunehmend für die Wirkstoffforschung 10,11 verwendet werden. Darüber hinaus ist eine bevorzugte Methode SPIM, wenn auch bei langfristiger Exposition oder sich wiederholende Messungen schlechten Licht Dosen sind erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Probe zu erhalten, da für die Messung von jeder Ebene der Probe nur diese Ebene dem Licht ausgesetzt wird. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mikroskopietechniken, wobei zur Detektion der jeweiligen Brennebene die gesamte Probe beleuchtet wird, so daß bei der Aufzeichnung einer Vielzahl von Ebenen, die die Lichtdosis summiert und kann die Probe 12 zu beschädigen. </p&gt; Lichtschnittmikroskopie oder SPIM auf Beleuchtung der Probe in Richtung senkrecht zur Beobachtungspfad entweder durch die Verwendung einer Zylinderlinse oder durch Abtasten des anregenden Laserstrahls (für eine Übersicht siehe Ref. 8) basiert. Dies erfordert oft spezielle Probenkammern 13,14 oder Matrizen, zB Agarose 7,15, in speziellen High-Cost-Mikroskopen implementiert. Als Alternative zu diesen Systemen eine vergleichsweise einfache Beleuchtungseinrichtung für SPIM wurde entwickelt und mit einem herkömmlichen inversen Mikroskop 16 (siehe Figur 1) angepaßt ist. Es besteht aus einem Laserstrahl auf einen Durchmesser von 8 mm durch eine Zylinderlinse (Fokuslänge: 50 mm, numerische Apertur: 0,08) erweitert und fokussiert, um einen Lichtschnitt von 6-10 um Dicke über eine Schärfentiefe von etwa 100 um . Proben werden in einer rechteckigen Kapillare mit 600-900 um Innendurchmesser vor dem Mikroskopobjektiv angeordnet len ​​befindets für die Fluoreszenzdetektion. Diese Hauptmerkmale werden gegenwärtig abgeschlossen und durch die Verwendung von fortschrittlichen Mikrokapillare Ansätze zum Halten und zum Drehen der Proben, die synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtblatt (in axialer Richtung) und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion (identischen optischen Pfad eingesetzt optimiert Längen Verschiebung erfordern eine Korrektur der mechanischen Vorschub) und die Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, pharmazeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln, damit die erforderliche Menge und Kosten zu minimieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Ein Modul für Lichtbogen oder einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einem umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert, zB mehrzelligen Tumorsphäroide (MCTS). SPIM Anregungsmodul Formen und lenkt das Licht, so dass die Probe durch einen Lichtschnitt senkrecht zur Detektion Gang des Mikroskops beleuchtet. Das System wird durch Verwendung einer rechteckigen Kapillare zur Aufnahme (und in einer erweiterten Version auch durch eine Mikrokapillare Ansatz zum Drehen) der Proben, durch synchrone Verstellung der Beleuchtungslichtbogen und der Objektivlinse für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird, sowie dadurch gekennzeichnet, durch Anpassung eines mikrofluidischen Systems zur Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen. Ein Protokoll für die Arbeit mit diesem System gegeben wird, und einige technische Details berichtet. Repräsentative Ergebnisse umfassen (1) Messungen der bisnehmen eines Zytostatikums (Doxorubicin) und dessen teilweise Umwandlung in ein Abbauprodukt, (2) Redox-Messungen unter Verwendung einer genetisch codierten Glutathion Sensor bei Zugabe eines Oxidationsmittels, und (3) die Einleitung und Kennzeichnung Zellnekrose auf Hemmung der mitochondrialen Atmungskette. Unterschiede und Vorteile der vorliegenden SPIM Modul im Vergleich mit bestehenden Systemen diskutiert.

Versuch 1: Zell Sphäroiden mit einem Chemotherapeutikum inkubiert Ein Z-Stapel-Scan eines zuvor inkubiert MCF-7-Zell-Sphäroiden (8 uM Doxorubicin, 6 h) wird in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt ausführliche Informationen über die zelluläre Aufnahme und Verteilung von Doxorubicin 17 und seinem Abbauprodukt 18,19. In der äußeren Zellschicht der Sphäroid roten Fluoreszenz Doxorubicin wird hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, wäh...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Research

JoVE Journal

Engineering

9.6K Aufrufe.  Aalen University.  Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden. 

Serie: Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

Bau einer Hohe Auflösung Mikroskop mit Konventionelle und Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

Forschung

Ingenieurwesen

Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

Die Analyse der Kontaktschnittstellen für Einzel GaN-Nanodraht-Geräte

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

Messwerkstoffgefüge unter Verwendung von Fluss 1-2 Flugzeug Flussneutronenkleinwinkelstreuung

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

In Situ Zeitabhängige Dielectric Breakdown im Transmissionselektronenmikroskop: eine Möglichkeit, die Fehlermechanismus in mikroelektronischen Bauelementen Verstehen

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Compact-Objektiv lose digitale holografische Mikroskop für MEMS-Inspektion und Charakterisierung

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

Hand kontrollierte Manipulation einzelner Moleküle über ein Rastersondenmikroskop mit einer 3D-Virtual-Reality-Schnittstelle

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Demonstration eines Hyperlens integriert Mikroskop und super-Resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

Vollelektronische Nanosekunde gelöst Scanning Tunneling Microscopy: Erleichterung der Untersuchung der einzelnen Dotierstoff kostenlos Dynamik

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Einstelligen Nanometer Elektronenstrahl Lithographie mit einem Aberration korrigiert Scan Transmissions-Elektronenmikroskop

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...