Die Autoren danken, die Unterstützung durch die &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; für die Tierhaltung zu bestätigen. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 und ANR-11-JSV2-002-01) zu Michael Schubert, die von der Europäischen Union RP6 grant &quot;Embryomics&quot; und von der ANR grant &quot;ANR- 10-BLAN-121.801 Dev-Process &quot;, um Jean-François Nicolas und Nadine Peyriéras. João Emanuel Carvalho wird von einem FCT Stipendium finanziert (SFRH / BD / 86878/2012). Anträge für die hier beschriebenen Vektoren können direkt an die Autoren angesprochen werden.

1. Vorbereitung der Instrumente und Reagenzien <ol style="margin-left: 40px;"><li> Übertragen Pasteurpipetten <ol><li> Erzeugt eine Reihe von Transferpasteurpipetten mit unterschiedlichen Spitzendurchmesser, indem 230 mm langen Pasteurpipetten über einer Flamme mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Sicherzustellen, dass die Verjüngung so lange wie möglich für glatte und feine Steuerung der Aspiration. </li><li> Mit einem Diamantschreiber, kratzen die Pipette entlang einer Linie senkrecht zu der Länge der Pipette. Mit beiden Händen, ziehen Sie die Pipette parallel zu seiner Länge, um einen stumpfen Schnitt erzeugen. Schnell flammLack die Pipette ohne Abdichtung der Spitze. </li><li> Variieren die Durchmesser der Spitze mit dem Stadium der Eizellen / Embryonen zu pipettierende: 300-400 &amp; mgr; m für die unbefruchteten Eizellen (etwa 150 &amp; mgr; m im Durchmesser), 600 um für die befruchteten Eier (etwa 500 &amp; mgr; m im Durchmesser), 200 bis 400 &amp; mgr; m für schraffierten Neurulae. Pipetten mit einem Mund-überwacht Absaugschlauch Eizellen / Embryonen von einem Gericht überzum anderen. </li></ol></li><li> Injektionsnadeln <ol><li> Bearbeiten Sie die Kapillaren mit Handschuhen an RNase-freien Bedingungen zu gewährleisten. Verwenden Borosilikatglas mit Filament Kapillaren mit Abmessungen von 1,20 mm OD, ID 0,94 mm, Länge 10 mm. </li><li> Wenn Kapillaren von der Art der Heizung Faden Nadelzieher in der Materialliste beschrieben herausgezogen wird, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 600, ziehen 50, Velocity 80, Zeit 60, 200 oder 300 Druck andernfalls sicher, dass die Form, das ist Entscheidend für die erfolgreiche Injektionen, wie in Figur 2 mit den folgenden Eigenschaften gezeigt: 4-8 &amp; mgr; m Außenkopfdurchmesser von 2 cm Verjüngungslänge. HINWEIS: Nadeln kann vor der Laichzeit gezogen und während der Saison verwendet werden. </li></ol></li><li> 5% Phenol Red-Stammlösung (4x) <ol><li> Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit. </li><li> In ein 0,22 um-Filterrohr, wiegen 25 mg Phenol Red Pulver. </li><li> 0,5 ml der DNase- und RNase-freies Wasser aufdas Rohr mit dem Pulver. </li><li> Spin für 3-5 min bei 18.000 × g bei Raumtemperatur an filter Sterilisieren der Lösung und die Kristalle, die die Injektionsnadel verstopfen können. </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder lagern Sie 250 ul Aliquots bei -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg / ml poly-Lysin-Lösung <ol><li> Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit. </li><li> Man löst 5 mg Poly-L-Lysin in 20 ml destilliertem Wasser. Speicher 5 ml Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Verwenden eine aufgetaute Aliquots sofort und nur einmal, um reproduzierbare und stabile Haftung der Oozyten zu dem Poly-Lysin-beschichtete Schale gewährleisten. </li></ol></li><li> mRNA-Synthese <ol><li> Bereiten Sie frisch vor jedem Laichzeit. </li><li> Linearisieren 5 ug DNA von Interesse mit dem angemessenen Enzym (üblicherweise 2 Stunden, bei 37 ° C). Um die Vollständigkeit der Verdauung zu ermitteln, führen 2% des Volumens der Verdauung Mischung auf einem 1% Agarose-TBE-Gel in TBE-Puffer bei 150 W für 20 min. </li><li> Entpacken Sie die lineatigte DNA mit 25: 24: 1 Phenol (pH 8,0): Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 Sekunden, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg und sammeln die wässrige (obere) Phase. </li><li> Die wässrige Phase wird nochmals mit 24: 1 Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 sec, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg wird die wäßrige Phase. </li><li> Auszufällen die linearisierte DNA mit 100: 10: 300 linearisierte DNA: 3 M Natriumacetat (pH 5,2): 100% Ethanol über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Spülen in 70% Ethanol. </li><li> Zentrifuge 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Trocknen lassen und resuspendieren in RNase-freiem Wasser mit einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul. </li><li> Transkribieren 1 ug linearisierte DNA unter Verwendung eines mRNA-Synthese-Kits mit der geeigneten Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Entpacken Sie die mRNA mit 5: 1 Phenol (pH 4,7): Chloroform und Ammoniumacetat im Kit enthalten Stop-Lösung. </li><li> Vortex für 20 Sekunden, CEntrifuge 10 min bei 18.000 xg und sammeln Sie die wässrige Phase. </li><li> Die wässrige Phase wird nochmals mit 24: 1 Chloroform: Isoamylalkohol. Vortex für 20 sec, Zentrifuge 10 min bei 18.000 xg wird die wäßrige Phase. </li><li> Fällt die mRNA mit 100% Isopropanol über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Spülen in 80% Ethanol. </li><li> Zentrifuge 10 min bei 18.000 × g bei 4 ° C. Lassen Sie das Pellet trocken bei Raumtemperatur nicht länger als 5-10 Minuten, da es dann schwierig, wieder zu suspendieren können. Resuspendieren in DNase- und RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von mindestens 2 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l, um ein ordentliches endgültigen mRNA-Konzentration in der Injektionsmischung sicherzustellen. </li><li> Um die Qualität und Größe des Transkriptionsprodukts zu überprüfen, führen 0,5 ul der mRNA auf einer RNase-freie 1% Agarose-TBE-Gel in TBE-Puffer bei 150 W für 20 min. Shop 2 ul Aliquots bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-Lysin-beschichteten Schalen HINWEIS: Poly-Lysin CoAted Gerichte werden verwendet, um die Eizellen während der Injektion zu immobilisieren. <ol><li> Für jede 35 mm Zellkulturpetrischale (insgesamt 5), bedecken den Boden der Petrischale mit 1 ml der aufgetauten 0,25 mg / ml poly-Lysin-Lösung. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Für jede 35 mm Zellkulturpetrischale (insgesamt 5), übertragen Sie die 0,25 mg / ml Poly-Lysin-Lösung in einen anderen 35-mm-Zellkultur-Petrischale. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Entsorgen Sie die 0,25 mg / ml Poly-Lysin-Lösung. </li><li> Lassen Sie die Petrischalen trocken, kopfüber bei Raumtemperatur für 2 Std. </li><li> Bewahren Sie die Poly-Lysin-beschichtete Gerichte in Plastikfolie eingewickelt bei 4 ° C, um eine Verunreinigung für maximal eine Woche zu vermeiden. </li></ol></li><li> Agarose-beschichteten Schalen Hinweis: Sie werden an Kultur injizierten Embryonen verwendet. Die Agarose ein Kissen für die injizierten Embryonen und verhindert, dass sie das Festhalten an dem Boden der Schale. <ol><li> Stellen künstlichem Meerwasser (ASW) mit 37 bis 38 g / l commercial Salze + 0,25 mM NaHCO3 in Umkehrosmosewasser. </li><li> Löse Agarose zu einer Konzentration von 1% in 0,22 &amp; mgr; m-filtriert ASW durch Erwärmen der Lösung in einer Mikrowelle. </li><li> Rasch gießen warmen Agarose-Lösung aus einer 35 mm Petrischale in eine andere, um eine sehr dünne Agarose Beschichtung der Schale zu sichern. </li><li> Bewahren Sie die Agarose-beschichteten Schalen in Saran Wrap verpackt bei 4 ° C, um eine Verunreinigung für maximal eine Woche zu vermeiden. </li></ol></li><li> Einspritzmischung und Beladung der Injektionsnadeln <ol><li> Über 2 Stunden vor Beginn der Injektionen, einen 2 ul Injektion Mischung in RNase- und DNase-freiem Wasser mit einer Endkonzentration von 1 bis 1,8 ug / ul von mRNA, 15% Glycerin, 1,25% Phenolrot. HINWEIS: Die Phenolrot färbt die Lösung, die die Injektionseffizienz und die Identifizierung erfolgreich injizierten Embryonen ermöglicht. Glycerol begünstigt mRNA Diffusion innerhalb der Eizelle. </li><li> Zentrifuge 4 min bei 18.000 xg zuPellet-Kristallen. Halten Sie auf dem Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Mit einer 10 ul-Pipette gesammelt 0,5 ul der Injektionsmischung, die Vermeidung der Boden des Röhrchens, wo die Kristalle wurden pelletiert. </li><li> Verfüllen mindestens zwei Einspritznadeln (im Falle einer bricht während der Injektion) durch Pipettieren der 0,5 ul Tropfen der Einspritzmischung in der großen Öffnung der Nadel. </li><li> Installieren Sie die Nadeln in einem Vorratsglas mit Flüssigkeit am Boden bei 4 ° C, um Verdunstung der Injektionsmischung zu verhindern. Lassen die Injektionsmischung langsam zu der Spitze der Injektionsnadel Dauer von mindestens 1 Stunde, um die Erzeugung von Blasen zu minimieren. </li><li> Speicher zusätzliche Einspritzung Mischung bei -80 ° C für maximal drei weitere Verwendungen, wonach der mRNA Qualität verschlechtert sich (Daten nicht gezeigt). </li></ol></li></ol> 2. Sammlung von biologischem Material, Mikroinjektion und Embryo Kultur <ol style="margin-left: 40px;"><li> Eizelle und Samensammlung HINWEIS: Siehe Theodosiouet al. 12 für ein detailliertes Protokoll zur Induktion von Laich- und zur Keimzelle Sammlung. <ol><li> Shock Männer und Frauen in ASW bei 23 ° C für 24 Stunden. </li><li> Ein bis zwei Stunden vor Sonnenuntergang, übertragen Sie die Erwachsenen in einzelne Tassen in ASW bei 19 ° C, weil die meisten Erwachsenen werden 1-2 Stunden nach Sonnenuntergang zu laichen. </li><li> Spülen Sie 35 mm Petrischalen in gefiltert ASW und trocknen lassen upside-down, um die Eizellen von Festhalten an der Boden der Schale zu verhindern. </li><li> Nach dem Laichen sofort sammeln Spermien und Eizellen mit einem 1000 ul Pipette. <ol><li> Halten Spermien und Eizellen getrennt von Erwachsenen Amphioxus, da der Kontakt ist schädlich für die Gesundheit Gameten (Daten nicht gezeigt). </li><li> Darüber hinaus vermeiden erschreckte die Erwachsenen, die zu Bewegungen, die zerstreuen führt und damit zu verdünnen, sowohl Spermien und Eizellen. Um die Spermien aktiv so lange wie möglich zu halten und zu optimieren Befruchtungsrate, sammeln das Sperma so konzentriert wie möglich ist. </li></ol></li><li> HaltenSperma auf Eis in einem 1,5-ml-Tube. </li><li> Übertragen Oozyten in gefiltert ASW in die vorgespült 35 mm Petrischalen. </li><li> Über 100-500 Oozyten mit einer zuvor gezogen 300-400 um Transfer Pasteur-Pipette in ein anderes 35 mm Petrischale, die Injektionen durchzuführen. </li><li> Befruchten der Rest der Kupplung als Kontrolle für Spermien und Eizelle Qualität oder für andere Experimente. </li></ol></li><li> Oocyteninjektion <ol><li> Installieren der Injektionsnadel auf dem Mikromanipulator in einem Winkel von 50 ° relativ zu der horizontalen Ebene. HINWEIS: Winkel von weniger als 50 ° werden die Oozyten herum auf der Schale zu drücken, während die Winkel von mehr als 50 ° wird eine angemessene Kontrolle der Nadelposition relativ zu der Eizelle nicht zulassen. </li><li> Unter einem Fluoreszenz-Binokular mit 25X Okulare, übertragen 30 Oozyten mit der 300 bis 400 &amp; mgr; m Übertragungspasteurpipette auf einer Poly-Lysin-beschichtete Schale mit ASW gefiltert. </li><li> Zahlen Sie die Eizellen entlang einer Linie durchout-Injektionen in einer geordneten Art und Weise und von nicht-injizierten Oozyten injiziert unterscheiden. Injizieren kleine Zahlen (30 Oozyten), um die Belichtungszeit der Oozyten zu Poly-Lysin, die sich entwickelnden Embryonen zu deformieren neigt minimieren (Daten nicht gezeigt). </li><li> Verwenden Sie die Dunkelfeldbeleuchtung, um die Eizellen machen, wie durchlässig wie möglich. </li><li> Mit der Grobbewegungsknopf des Mikromanipulators, bringen die Injektionsnadel in der Nähe einer Eizelle. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, aufgeschnitten die Nadel auf der Ebene, wo die Spitze beginnt, gekrümmt sein. Durch Pulsen mit dem Injektor, überprüfen Sie, ob Rot Injektion Mischung ist eigentlich aus der Nadel fließen. </li><li> Bei 200-facher Vergrößerung und mit der Feinbewegungsknopf des Mikromanipulator, sanft bewegen die Injektionsnadel in den Kern der Eizelle. HINWEIS: Wenn zu oberflächlich eingesetzt, wird der injizierten Lösung nicht im Inneren der Eizelle bleiben. Wenn sie zu weit eingeführt wird, wird die Eizelle zerstört werden. </li><li> Spritzen Sie mit 1-3 Impulsen von 120 msec duratIon und 1-10 psi Druck. Wenn die Nadel fein genug ist, zu injizieren mit kontinuierlichen Fluss bei konstantem Druck. Sicherstellen, dass das Injektionsvolumen entspricht 1/5 bis 1/3 des Volumens einer einzelnen Eizelle. </li><li> Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel heraus schnell, um ein Auslaufen der Eizelle zu vermeiden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die eingespritzte Lösung innerhalb der Eizelle bleibt und nach ein paar Sekunden, breitet sich das eingespritzte Lösung in der gesamten Eizelle. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Eizelle in der Schlange. </li><li> Halten Sie ein paar nicht injizierten Embryos auf jede Serie als Negativkontrolle, um die Hintergrundfluoreszenz schätzen bei der Suche nach injiziert Embryonen. </li></ol></li><li> Düngung, Auswahl der injizierten Embryonen und Embryokultur <ol><li> Befruchten die Oozyten, sobald eine Reihe eingespritzt wurde. Wie Oozytenqualität nimmt mit der Zeit zu injizieren und befruchten Eizellen innerhalb 1 Stunde nach dem Laichen 12. </li><li> In Abhängigkeit von der Spermienkonzentration, fügen Sie 1-5 Tropfen Sperma zu den Eizellen undschwenken Sie die Schüssel. HINWEIS: Die Befruchtung Umschlag ist auf den zu Embryonen werden nach ca. 1 min. </li><li> Ermöglichen die Embryos aus dem Poly-Lysin-beschichtete Schale zu trennen, während der Injektion eine weitere Reihe von Oozyten. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen mit dem 600 um Übertragungs Pasteur-Pipette in ein Agarose-beschichteten Petrischale. Entfernen Sie die Embryos aus dem Poly-Lysin-beschichtete Schale so bald wie möglich, wenn überhaupt, vor dem 2-Zellstadium möglich. HINWEIS: Bei längerer Einwirkung von Poly-Lysin, neigen die Embryonen zu dicht gepackten blastulae, an der Seite berühren den Boden der Schale abgeflacht werden. </li><li> An der 2-Zelle, um 4-Zell-Stadium, wählen mit einem fluoreszierenden Binokular mit DSR Filter die erfolgreich-injizierten Embryonen, dh solche mit einer normalen Morphologie, die ein Phenol Red abgeleiteten roten Fluoreszenzsignal aufweisen. </li><li> Halten Sie die Embryonen in Kultur gefiltert ASW in Agarose-beschichteten Petrischalen bei 19 ° C, bis die gewünschte Stufe fürin vivo Bildgebung. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Artikel zeigen wir, zum ersten Mal, eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für die Injektion von B. lanceolatum Oozyten, die nach B. floridae 13,14 und B. belcheri 15, ist somit die dritte amphioxus Spezies, für die eine solche Technik ist beschrieben worden. Wichtig ist, dass das hier beschriebene Protokoll enthält auch die Beschreibung des Vektor-Systeme zur Herstellung von fluoreszierenden Proteinen in B. geeignet lanceolatum von...

Bei der Entwicklung, eine einzelne Zelle führt zu einem ganzen Organismus in einem sehr komplexen Prozess, der beide Zellteilungen und Bewegungen beinhaltet. Um die biologische Prinzipien der Dynamik des Zellverhalten besser zu verstehen, haben Entwicklungsbiologen begonnen, fluoreszenzbasierten In-vivo-Imaging-Techniken verwenden. Bestimmten Kompartimenten der Zellen, wie Zellmembranen, kann entweder durch Behandlungen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, wie dies bereits durch einen Mangel an Spezifität und der Gewebepenetration 1 behindert oder durch die spezifische Einführung in den Embryo von exogenen mRNAs fluoreszierenden Proteinen 2 kodiert. Verschiedene Techniken können für die effiziente Bereitstellung von exogenen Verbindungen, wie mRNAs verwendet werden. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Mikroinjektion, Elektroporation, Beschuss mit Mikropartikeln, Lipofektion und Transduktion 3,4 beschränkt. Obwohl alle diese Ansätze können verwendet werden, um exogene Verbindungen in ein einzuführensich entwickelnden Embryo, erlaubt nur die Mikroinjektion der Anwendung vordefiniert und genauen Mengen in jede Zelle 3. Mikroinjektionstechniken für alle wichtigen Entwicklungsmodell Systeme beschrieben 4 (zB Fruchtfliegen, Fadenwürmer, Zebrafisch, Frösche, Mäuse) sowie für einige alternative Modelle 4, auch für Vergleichsstudien auf das Verständnis der Evolution der Entwicklungsmechanismen abzielen verwendet (zB, Seeanemonen, Ringelwürmer, Seeigel, ascidian Manteltiere, die Schädellose Amphioxus). Cephalochordata, die zusammen mit Manteltieren und Wirbeltieren Herstellung der Chordaten Stamm, sind besonders gut geeignet, Modelle, die Entwicklung der Chordaten und die Diversifizierung der Wirbeltiere von einem wirbellosen Vorfahren 5-8 studieren. Die Schädellose Linie abwich sehr früh während der Chordaten Evolution; und vorhandenen Cephalochordata, die in drei Gattungen unterteilt sind (Branchiostoma, Asymmetron und Epigonichthys), ähneln Wirbeltieren sowohl in Bezug auf die gesamte Anatomie und Genom-Architektur 8.5. Von den etwa 30 Arten von Cephalochordata, die bisher beschrieben wurden, fünf sind für embryologische und Entwicklungsstudien 6,9 verfügbar: Asymmetron lucayanum (der Bahama Lanzettfisch) Branchiostoma floridae (der Florida Amphioxus) Branchiostoma lanceolatum (Europäische Amphioxus) Branchiostoma belcheri (die chinesische Amphioxus) und Branchiostoma japonicum (der japanische Amphioxus). Reife Erwachsene von drei dieser Arten (B. lanceolatum, B. belcheri und B. japonicum) induziert werden kann, um bei Bedarf während der Brutzeit 10,11 laichen. Darüber hinaus zumindest für B. lanceolatum, effiziente Laich kann auch in künstlichem Meerwasser 12 induziert werden, wodurch diese besondere Schädellose Arten zugänglich für laboratorer Jahren, die keinen Zugang zu natürlichen Meerwasser. Die Kombination, in B. lanceolatum, eine bequeme und sichere Zugang zu Embryonen mit einem effizienten Liefermethode, wie Mikroinjektion, bisher das einzige Fördertechnik, bei Amphioxus entwickelt (sowohl in B. floridae und B. belcheri) 13-15, wird die Entwicklung einer zu ermöglichen neue Suite von manipulativen Techniken, einschließlich Linie tracing- und dynamische Zellverhaltensbasierte Ansätze. Ein Protokoll für die effiziente Mikroinjektion von mRNAs, um fluoreszierende Proteine, die in dem B. auszudrücken lanceolatum Embryo wurde daher entwickelt. Darüber hinaus, um einen grundlegenden Toolkit für Live-Imaging von B. liefern lanceolatum Embryonen wurden Vektorsysteme entwickelt, die membranassoziierten und nukleare Expression von fluoreszierenden Proteinen ermöglichen. Für Membran Targeting wurde enhanced green fluorescent protein (eGFP) in die menschliche HRAS CAAX-Box und Kernlokalisation von mCherry und eGFP fusioniert wardurch Fusion an der Zebrafisch Histon 2B (H2B) Exon (Abbildung 1, Ergänzungs Datei 1) erhalten. Weiterhin mit dem Ziel, um die Proteintranslation zu optimieren, die Kozak-Sequenzen und Codons der Konstrukte wurden modifiziert und auf den Einsatz in B. angepaßt lanceolatum. Zusammengenommen können die hier vorgestellten Einspritzverfahren und Expressionsvektoren, als Grundlage für die Erzeugung von neuen experimentellen Ansätzen für Kephalochordaten dienen, insbesondere Analysen unter Verwendung der in vivo-Abbildungstechniken letzte Fluoreszenzbasis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Die zuvor dargelegten Protokoll stellt die Grundlage für die Mikroinjektion von B. lanceolatum Oocyten und damit die Einführung in die Entwicklung von B. lanceolatum Embryonen von mRNA kodiert fluoreszierenden Proteinen für die in vivo Bildgebung. Obwohl die Technik ist sicherlich robust und zuverlässig ist, die Rate der erfolgreichen Injektionen mit diesem Protokoll bleibt variabel (Tabelle 1). Die sehr wahrscheinliche Erklärung für diese interessante Tatsache ist die e...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Wir berichten hier über die robuste und effiziente Expression von fluoreszierenden Proteinen nach der mRNA-Injektion in unbefruchtete Eizellen von Branchiostoma lanceolatum. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in dieser basalen chordate wird den Weg für tiefgreifende technische Innovationen in diesem aufstrebenden Modellsystem, auch in-vivo-Bildgebung und genspezifischen Manipulationen zu ebnen.

Expression von fluoreszierenden Proteinen in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K Aufrufe.  Institut Pasteur.  Wir berichten hier über die robuste und effiziente Expression von fluoreszierenden Proteinen nach der mRNA-Injektion in unbefruchtete Eizellen von Branchiostoma lanceolatum. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in dieser basalen chordate wird den Weg für tiefgreifende technische Innovationen in diesem aufstrebenden Modellsystem, auch in-vivo-Bildgebung und genspezifischen Manipulationen zu ebnen. 

Serie: Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...