Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Mica und Slides Vorbereitung <ol><li> Platz Nr. 1 ½ (0,17 mm) Deckgläser in Färbung Rack. </li><li> Beschallen für 30 min in 2% Detergens bei 60 ° C </li><li> Mit VE-Wasser waschen 20-mal. </li><li> Folien mit einer Pinzette entfernen und trocken blasen mit Druckluft oder Stickstoff. </li><li> Schneiden Glimmer Blatt in 10 x 10 mm quadratische Stücke mit einer Schere oder Rasierklinge. </li><li> Schneiden Sie die einzelnen Glimmer Stück in 2-3 dünner Blättchen mit Rasierklinge. HINWEIS: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von scharfen Klinge. </li></ol> 2. Mica Montage-und Befestigungskammer <ol><li> Saubere mikroskopischen Glasobjektträger mit Ethanol. </li><li> Kleber Beilage Glimmer in Schritt 1,6 bis Glasobjektträger mit optischen Kleber geschnitten. Niedrige Viskosität Klebstoff wird empfohlen, besser zu verbreiten und den Tropfen kleben die Glimmer. </li><li> Cure unter UV-Lampe, 10 min. HINWEIS: Kleber wird durch UV-Licht mit einer maximalen Absorption im Bereich von 350 bis 380 nm und die empfohlene Energie requ geheiltired für die vollständige Heilung ist 4,5 J / cm 2. Jedoch können verschiedene Lichtquellen für diesen Schritt verwendet werden (siehe Materialien Klebstoffhersteller geliefert). </li><li> Expose eine saubere Glimmeroberfläche durch Entfernen der ersten paar Schichten mit Klebeband. </li><li> Platzieren kleiner Tropfen (~ 20 &amp;mgr; m) der optischen Klebstoff auf der Glimmeroberfläche. HINWEIS: Bei diesem Schritt hohe Viskosität Klebstoff mit geringer Autofluoreszenz-Ebene wird empfohlen. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass mit Kombination von niedrigem (Schritt 2.2) und hochviskose Klebstoffe deutlich erhöht Wirksamkeit der Glimmer Spaltung (Schritt 2.7). </li><li> Sanft statt frisch gereinigten Deckglas auf den Tropfen Klebstoff Luftblasen vermeiden, lassen Sie begleichen für 1 min. </li><li> Cure unter UV-Lampe, 10 min. HINWEIS: Nach diesem Schritt kann das Sandwich aus Glas-Objektträger, Glimmer und Deckglas für eine relativ lange Zeitdauer (bis zu einige Wochen) gespeichert werden. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt kurz vor dem eigentlichen SLB Vorbereitung, um sicherzustellen, dass die Glimmeroberfläche frisch ist. HINWEIS: Kleber wird durch UV-Licht mit einer maximalen Absorption im Bereich von 350 bis 380 nm und für die vollständige Heilung erforderlich empfohlen Energie ausgehärtet ist 4.5J/cm 2. Jedoch können verschiedene Lichtquellen für diesen Schritt verwendet werden (siehe Materialien Klebstoffhersteller geliefert). </li><li> Mit einem exacto Messer vorsichtig demontieren das Deckglas von der Seite Glasobjektträger, wie im Video gezeigt. In den meisten Fällen wird eine dünne und flache Schicht aus Glimmer, um das Deckglas befestigt bleiben. Mica angebracht, um Glasobjektträger kann wieder verwendet werden (ab Schritt 2.4). </li><li> Überprüfen Sie die Oberflächenqualität mit bloßem Auge oder unter einem Binokular, um sicherzustellen, dass Glimmerschicht noch mit dem Deckglas geklebt und wurde beim Spalten in Schritt 2.8 nicht vollständig entfernt. Einen kleinen Kratzer mit einer Pinzette oder sezieren Nadel wird dazu beitragen, zwischen dem Klebstoff, der eine andere Konsistenz nachweisbar aus Glimmer unterscheiden. </li><li> Entfernen Gummidichtung von einem 1,5-ml-Fläschchen Kappe und kleben Sie die Kappe auf den Kopf an der Oberfläche mit Hilfe der optischenKlebstoff oder Nagellack und heilen mit UV-Lampe, oder lassen Sie Luft trocknen 10 min auf. HINWEIS: Wenn die Probe für die gleichzeitige optische (TIRFM oder konfokalen) mit AFM vorbereitet, könnte ein 1,5-ml-Fläschchen Kappe zu klein sein, um die AFM-Kopf auf den Mikroskoptisch montieren. In diesem Fall könnte die Kappe von einem Kunststoff-O-Ring mit einem größeren Durchmesser, geeignet für die Montage AFM Kopf ersetzt werden. Im Falle, wenn das Experiment erfordert Entfernen der Kappe, ohne die Glimmer-Oberfläche kann Silikonfett anstelle von Klebstoff oder Nagellack verwendet werden. </li></ol> 3. Unterstützt Lipiddoppelschicht (SLB) Bildung <ol><li> Zeigen frisch zubereitet Liposomenlösung in die Kammer mit der Oberfläche. Das Mindestvolumen für SLB Bildung erforderlich ist ~ 30 ul. HINWEIS: Für weitere Informationen zu der Liposomen und SLB Bildung, veröffentlicht Protokolle, wie zB Tasche et al siehe 2014 15.. </li><li> Fahren Sie mit SLB-Bildung unter Verwendung gewünschte Protokoll. Während der Inkubation undBildgebung kann die Kammer in einem Wärmeblock erhitzt Mikroskoptisch oder auf Temperatur erforderlich, um die Lipide, die oberhalb ihrer Schmelztemperatur eingesetzt zu halten pflegen platziert werden. </li></ol>

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J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung glatte und dünne Glimmeroberflächen für Lipid-Doppelschicht Abscheidung und hochauflösende Bildgebung. Die Technik erfordert nur minimale manuelle Fertigkeiten, vor allem auf die sorgfältige Demontage der Glasglimmer-Glas-Sandwich (Schritt 2.8), die entscheidend für die Erzielung einer hohen Qualität Glimmeroberfläche ist begrenzt. Inspektion der frisch gespaltenen Glimmer wird immer an diesem Punkt notwendig, da es möglich ist, die Glimmer, von der opti...

Das Gesamtziel des vorliegenden Protokolls ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Glimmeroberflächen für hochauflösende Bildgebung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten (SLBs) mit optischen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) oder die konfokale Mikroskopie, die auch mit Atomkraft kombiniert werden konnten zeigen, Mikroskopie (AFM). SLBs sind ein weit verbreitetes Modell für zahlreiche Studien von Lipid-Clustering, Phasentrennung, Dynamik der Doppelschicht-Komponenten oder ihre Wechselwirkungen mit Peptide, Proteine ​​oder andere Verbindungen 1-5. Unterschiedlichen Substraten kann zur Bildung SLB (z. B. Glas, Glimmer, Siliciumdioxid, Polymere), je nach der Art der Untersuchung 4,6-8 verwendet werden. Typische Membranstudien basieren auf Mikroskopie-basierte Bildgebungstechniken, wie TIRFM und AFM. So TIRFM Bildgebung, ist eine Glasoberfläche eine typische Wahl, denn Glas ist transparent. Herstellung von Glas ist relativ einfach, und die Qualität der Ergebnisse ist in erster Liniedurch gründliche Reinigung der Oberfläche vor dem Aufbringen der Lipidbläschen bestimmt. AFM aufgrund seiner hohen axialen Auflösung erfordert Glimmeroberflächen. Glimmer ist ein Silikat-Mineral, mit fast perfekten basalen Spaltung. So ist der frisch gespaltenen Glimmer atomar flach, so dass Beobachtung der Membran Höhenunterschiede auch bei den Sub-Nanometerskala 9. Diffusion Studien mit Methoden wie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), Einzelmolekül-Tracking (SMT) und Fluoreszenz-Erholung nach Photobleaching (FRAP) zeigten jedoch, dass die Lipidmembrandynamik hängen stark von der Art der Oberfläche, auf der sie abgeschieden werden, wobei Glas und Glimmer können sehr unterschiedliche Ergebnisse liefern 10,11. Diese Unterschiede sind nicht nur die Diffusionskoeffizienten der Membran-Sonden, aber auch die Erfassung von getrennten Populationen von Teilchen diffundieren mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und möglicherweise das Umschalten zwischen verschiedenen Staaten. FolglichDer direkte Vergleich der Resultate mit TIRFM und AFM-Techniken erhalten wird, ist oft problematisch, wenn nicht die gleiche Oberfläche (in diesem Fall Glimmer) verwendet. Zwar gibt es einige Studien, in denen TIRFM und AFM-Doppelschicht Abbildungs ​​wurde am gleichen Glimmeroberfläche 12,13 geführt, Glimmer wird selten für die optische Mikroskopie vor allem wegen der Handhabungsprobleme, verwendet. Mica Vorbereitung erfordert Schneiden von Hand in dünne Blättchen, die dann auf dem Deckglas mit optischen Kleber 12 verklebt sind. Diese Methode erfordert jedoch einige Übung, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus sind die erhaltenen Oberflächen oft wellig und dick, so dass sie schwer mit geringen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen zu verwenden. Mica Oberflächen hergestellt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben sind sehr dünn (~ 220 um, einschließlich des Deckglases Dicke von 170 um) und extrem flachen, Vermeidung von &quot;Welligkeit&quot;, die entscheidend für eine erfolgreiche hochauflösende Bildgebung ist. Sie können verwendet werden,für TIRFM oder konfokalen Setups. Darüber hinaus können die gleichen Proben zu AFM übertragen werden, und sogar gleichzeitig mit TIRFM / konfokalen und AFM abgebildet. Die Kombination dieser beiden Techniken ermöglicht die direkte Korrelation der Diffusionsverhalten mit Doppelschicht-Membran-Struktur 14. Da Glimmeroberflächen werden frisch gespalten, sie sind sauber und benötigen keine zeitraubende, schlecht reproduzierbar, und potenziell gefährliche Reinigungsverfahren (Glasreinigung Protokolle sind in der Regel Chemikalien wie Piranha-Lösung, Schwefelsäure, Natrium / Kalium-Hydroxid). Montage einer kleinen Kammer, die auch in dem Protokoll beschrieben, verringert das Volumen der Vesikel für eine effektive Doppelschichtbildung auf weniger als 50 &amp;mgr; l erforderlich. Schließlich ist der gesamte Prozess der Oberflächenmontage nicht zeitaufwendig (Zubereitung weniger als 30 min), und nicht einen hohen Grad an manueller Geschicklichkeit erfordern, ebenso wie herkömmliche Glimmer Spaltung und Kleben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Unterstützt Lipiddoppelschichten (SLBs) sind weit verbreitet als Modell für die Untersuchung Membraneigenschaften (Phasentrennung, Clustering, Dynamik) und seine Wechselwirkung mit anderen Verbindungen, wie Drogen oder Peptide eingesetzt. Allerdings SLB Merkmale unterscheiden sich je nach verwendetem Unterstützung. Häufig verwendete Techniken für die SLB-Bildgebung und Messungen sind Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie, FCS-und Rasterkraftmikroskopie (AFM). Da die meisten optischen Bildgebungsstudien werden auf einem Glasträger durchgeführt, während AFM erfordert eine extrem flache Oberfläche (in der Regel Glimmer), können die Ergebnisse von diesen Techniken nicht direkt verglichen werden, da die Ladung und Glätte Eigenschaften dieser Materialien stark beeinflussen Diffusion. Leider ist die hohe Fingerfertigkeit für das Schneiden und Kleben dünne Scheiben aus Glimmer an den Glasobjektträger erforderlich stellt eine Hürde für den routinemäßigen Einsatz von Glimmer für SLB Vorbereitung. Dies würde zwar die Methode der Wahl, wie Glimmer vorbereitet seinFlächen am Ende oft uneben (wellig) und schwer zu Bild, insbesondere mit kleinen Arbeitsabstand, hohe numerische Apertur Linsen. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und reproduzierbare Verfahren zur Herstellung von dünnen, flachen Glimmeroberflächen für die Lipid-Vesikel-Abscheidung und SLB Vorbereitung. Außerdem haben wir unsere maßgeschneiderten Kammer benötigt nur sehr kleine Volumina von Vesikeln für SLB-Bildung. Das Gesamtverfahren führt die effiziente, einfache und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen Lipiddoppelflächen, die direkt vergleichbar mit denen in AFM-Untersuchungen verwendet werden.

Das Diffusionsverhalten von Fluoreszenzsonden in Lipid SLBs ist je nach dem Substrat. TIRFM kombiniert mit der SMT-Technik ist eine wertvolle Methode zur Visualisierung von Partikelbewegungen und Extrahieren ihre Diffusionskoeffizienten. Einzelmolekülsignale einer Sphingomyelin-ATTO647N Sonde Diffundieren in DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)-Doppelschicht auf Glas und Glimmer gelagert sind in der beigefügten Figur gezeigt animiert. Der Glimmer-Oberfläche wurde nach dem hier vorgestellten Protoko...

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Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab.

Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Aufrufe.  Nanyang Technological University.  Wir präsentieren ein Verfahren zur Herstellung von Glimmer unterstützt Lipid-Doppelschichten für die hochauflösende Mikroskopie. Mica ist durchsichtig und flach auf atomarer Skala, aber nur selten in der Bildgebung aufgrund der Handhabungsschwierigkeiten verwendet werden; unserer Zubereitung ergibt sogar Abscheidung der Glimmerschicht und reduziert die Doppelschicht in Herstellung verwendeten Material ab. 

Serie: Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband Optical Detector von Ultraschall für medizinische Imaging-Anwendungen

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Ligand Nano-Cluster-Arrays in einem unterstützten Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für<em&gt; In vivo</em&gt; Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.